醫療照護相關感染ESBL-producing Klebsiella pneumoniae菌株之分子流行病學分析

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某醫學中心醫療照護相關感染 ESBL-producing Klebsiella pneumoniae 菌株之分子流行病學分析

詹明錦¹　　張靜美¹　　邱玉惠¹　　黃子鳳¹　　王甯祺^1,2　　林永崇^1,2

三軍總醫院　¹感染管制室　²內科部感染科

摘　要

廣效性乙內醯胺酶(extended-spectrum β-lactamases; ESBLs) 在1980年代被初次發現以 後，很快地遍佈到世界各地，可造成廣泛的cephalosporins 與 aztreonam 類抗生素抗藥性的形 成，常見於Escherichia coli 及 Klebsiella pneumoniae 等腸道菌，並可造成廣泛的 cephalosporins 與aztreonam 類抗生素抗藥性的形成，根據不同地區發表的文獻得知，一種 ESBL 不只局限在 同一地區，可藉由宿主的四處移動而散佈至不同地區及國家。本研究依據某醫學中心專任感 染管制護理師以美國疾病管制中心公佈之醫療照護相關感染定義進行全院性監測，收集2007 年1月至2008年6月符合醫療照護相關 ESBL-producing K. pneumoniae 感染定義者相關資料 統整及分析菌株分子分型，研究結果顯示醫療照護相關ESBL-producing K. pneumoniae 感染 部位以泌尿道感染59.5% 最多，而病房分佈則以一般病房78.6% 較加護病房11.4% 高出6至7 倍，在抗生素敏感試驗方面可以發現醫療照護相關感染ESBL-producing K. pneumoniae 除了 對imipenem 與 ertapenem 之感受性分別為100% 及94.6% 外，對其餘抗生素抗藥性均超過六成 以上，以脈衝式電泳(pulsed ﬁeld gel electrophoresis, PFGE) 進行分析結果並無群聚感染情形發 生或優勢菌株存在。對於治療醫療照護相關ESBL-producing K. pneumoniae 感染之藥物仍以 carbapenem 類藥物敏感性測試最佳。

關鍵詞：廣效性乙內醯胺酶 (Extended-spectrum β-lactamases) 醫療照護相關感染(Healthcare-associated infection) 脈衝式電泳(Pulsed field gel electrophoresis) 克雷伯氏肺炎菌(

Klebsiella pneumoniae

)

前言

廣效性乙內醯胺酶(extended-spectrum β-lactamases; ESBLs) 是由一些革蘭氏陰性桿 菌所產生，並可造成廣泛的cephalosporins 與

aztreonam 類抗生素抗藥性的形成^1,2,3。在1980年代廣效性乙內醯胺酶被初次發現以後，很快地遍佈到世界各地，現在已成為全球性的問題⁴。它是一種突變的且經由質體(plasmid) 或內嵌酶 (integron) 為媒介、可在不同菌種間基因傳播的

聯絡人：林永崇　通訊處：臺北市內湖區成功路二段325 號　三軍總醫院內科部感染科

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物質，這些酵素經由一或多個氨基酸的改變就能水解更多cephalosporins 類抗生素，ESBL 常見於Escherichia coli 及 Klebsiella pneumoniae ( 以 下簡稱K. pneumoniae) 等腸道菌，並可造成廣泛 的cephalosporins 與 aztreonam 類抗生素抗藥性的形成^1,2,3。

根據不同地區發表的文獻得知，一種 ESBL 不只局限在同一地區，可藉由宿主的四處移動而散佈至不同地區及國家。且每個國家常見的ESBL 型有所不同。目前許多國家對其分佈之ESBL 有不同報告^5,6,7。可利用PFGE 將 ESBL-producing K. pneumoniae 菌株進一步分 型，發現有不少群突發或相同基因型散播(clone dissemination) 之報告^8,9。

三軍總醫院在2006年 K. pneumoniae 全院 分離菌株數為2266株，其中 ESBL-producing K. pneumoniae 分離菌株數為517株 (22.8%)，

而醫療照護相關感染K. pneumoniae 菌株數為 167株，其中 ESBL-producing K. pneumoniae 總 計72株，佔醫療照護相關感染 K. pneumoniae 總數比例高達43.1%。考證過去文獻，造成 ESBL-producing K. pneumoniae 盛行率性偏高 之因素，包括醫護人員未能遵守隔離防護措施、廣效性頭芽孢菌素的大量使用及菌株散播 (clonal spread) 的後果^10,11。因此為了了解本院 ESBL-producing K. pneumoniae 菌株之分子流 行病學，並探討是否有特定菌株出現菌株散播 (clonal spread)的現象導致盛行率偏高，所以希望藉由此次實驗深入分析原因。

材料與方法

研究材料

本研究依據該醫學中心專任感染管制護理師以美國疾病管制中心公佈之院內感染定義¹²進行全院性監測，收集2007年1月至2008 年6月符合醫療照護相關 ESBL producing K.

pneumoniae 感染定義者相關資料並加以統整分 析，予以收案並將菌株保留。資料收集包含病人年齡、性別、潛在疾病因素、侵入性醫療措施、感染部位及抗生素敏感試驗結果。

研究方法

一、 ESBL-producing K. pneumoniae^菌株的篩選與鑑定

確定為ESBL 的方法有很多，目前較常用的是雙紙錠協同測試法 (double disc synergy test; DDST)，方法為收集之血液、痰液及尿液等臨床檢體所分離出的K. pneumoniae 檢體，

若其cefotaxime 紙錠法藥物敏感性測試結果為抑制環小於27mm，則被初步挑選為疑似 ESBL-producing 菌株¹⁵。並依據美國國家臨床檢驗標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute; CLSI) 之建議，針對這些疑似菌株進行ESBL-producing 表現型之確定測試，其測試方法簡要說明如下：挑取疑似ESBL-producing 菌株2-3個菌落，種入含2 mL TSB (Trypticase Soy Broth) 之試管，培養在35℃直至渾濁度相當於0.5 Mc Farland 硫酸鋇標準液，平均塗抹在 Mueller-Hinton agar 培養基的表面，再分別貼上 ceftazidime (CAZ)、ceftazidime/clavulanic acid (CAZ/CLA)、cefotaxime (CTX) 及 cefotaxime/

clavulanic acid (CTX/CLA) 抗生素紙綻於瓊脂的表面，置於35℃，一般培養箱隔夜培養後判讀。觀察並測量抑制環的直徑大小(mm)，若 (CAZ/CLA)–CAZ>5mm 或 (CTX/CLA)–CTX>

5mm 則為 ESBL-producing 菌株¹⁵。經此測試判定為ESBL-producing 之菌株，配合是否為醫療照護相關感染收案定義加以收集，並保存於-80℃之冰箱中。

二、將收集之醫療照護相關 ESBL-producing K.

pneumoniae^{感染菌株，以}PFGE 進行分子流行病學分析¹³，方法敘述如下：

( 一 ) 細菌之包埋、酵素處理與清洗 (Bacterial Embeding, Enzyme Digesting, and Washing) 依據PFGE 標準操作方法進行菌體之包埋、

酵素處理及清洗，其過程簡述如下：第一天挑取單一菌落接種於MacConkey 培養基於35℃溫箱培養16-18小時；第二天以棉棒刮取菌體，

於Cell Suspension Buffer (100 mM Tris-Cl, 100 mM EDTA, pH 8.0) 中做成懸浮液，以濁度計

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(Turbidity Meter, Dade Microscan ™ ) 測量，調整菌液濃度至0.68–0.72 (in Falcon 2054 tubes)，取400 μl 菌液至1.5 ml 微量離心管，加20 μl proteinase K (20 mg/ml)，混合後加入400 μl 融化後回溫至 56℃的1% SeaKem® Gold agarose/1% SDS，快速以微量吸管混均勻後注入模具中，放置於室溫15 min 或4℃ 5 min 使充份凝固，再將膠體自模具中推入5 ml Cell Lysis Buffer (50 mM Tris. Cl; 50 mM EDTA, pH 8.0; 1% Sarcosine; 0.1 mg/ml proteinase K)，置於56℃水浴器振盪2小時；膠體經酵素處理後，加15 ml 預熱至56℃的ddH2O，置水浴器振盪15 min，重覆 ddH2O 清洗一次，再以15 ml 預熱至56℃的 TE buffer (10 mM Tris-Cl, pH8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0) 清洗四次，膠體最後保存於5 ml 的 TE 中，置於4℃冷藏，以供 PFGE 電泳分析使用。

( 二 ) PFGE 電泳分析 (PFGE Analysis)

以刀片切取約2-mm 寬含 chromosome DNA 的膠薄片(slice)，膠薄片先置入200μl 的指定之限制酶(XbaI) 緩衝液，室溫下放置5 min，以微量吸管吸出緩衝液，再注入200μl 含20U 限制酶之緩衝液，置於35℃下放置2小時，以微量吸管吸出緩衝液再注入200 μl 的0.5X TBE buffer (89 mM Tris borate, 2 mM EDTA)，放置5 min 後，將膠薄片取出，用吸水紙儘量吸乾附著於膠薄片之緩衝液，再將膠薄片依序平貼於孔梳 (coomb) 上，15孔之膠片於第1、5、10、15孔位置，10孔之膠片於第1、5、10孔位置放置以 XbaI 切割之 S. enterica serovar Braendrap H9812 基因體DNA 片斷做為標準量測標織 (reference size markers)，之後將孔梳放置於鑄膠台上，

倒入融化回溫至56 ℃ 的1% SeaKem® Gold agarose，放置室溫20-30 min，待瓊膠凝固後，

即可進行電泳。PFGE 電泳使用 Bio-Rad CHEF Mapper 脈衝式電泳儀 (Bio-Rad Laboratories Inc.)，使用指定之跑膠條件完成跑膠後，膠片以 0.5 μg/ml 的 ethidium bromide 染色15 min，再以 ddH2O 退染2 h ( 過程更換水3-4次 )，DNA 圖譜影像再以數位影像處理系統AlphaEase ™ (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA) 拍照貯存

成數位檔案，以供後續比對分析。

( 三 ) 脈衝式電泳法圖譜解讀 (Intepretation of PFGE Patterns)

菌株間任何一DNA 片斷的差異皆可能具有流行病學上的意義，菌株PFGE 圖譜只要與既有之圖譜存有一DNA 片斷的差異，即視為不同的 PFGE 圖譜，給與 PFGE 圖譜編號。有關判讀標準與菌株間相關性之綜合判定依Tenover 所發表之PFGE 判定準則¹⁴判定之。

( 四 ) 電腦輔助式電泳帶模式分析 (Banding pattern Analysis and Dendrogram Construction by Computer-aided Method)

脈衝場電泳法產出之電泳帶模式以電腦軟體AlphaEaseTM (Applied Math, Kortrijk, Belgium) 數位化後以Tiff 檔儲存，電泳帶模式隨後可利用 BioNumerics software (Applied Math, Kortrijk, Belgium) 進行菌株間相似度之分析與比對。以 Jaccard-complete linkage 法將欲分析菌株群組化 (clustering)，並以樹狀圖 (dendrogram) 呈現。

三、抗生素敏感性試驗

依據美國臨床實驗室標準機構(Clinical and Laboratory Standards Institute; CLSI) 之操作指引，以抗生素紙錠擴散法(disk diffusion) 針對鑑定為K. pneumoniae 操作敏感性試驗，其測 試方法簡要說明如下：挑取K. pneumoniae 菌 株2-3個菌落，種入含2 mL TSB 之試管，培養在35 ℃ 直至渾濁度相當於0.5 McFarland 硫酸鋇標準液，平均塗抹在Mueller-Hinton agar 培養基的表面，再分別貼上ampicillin (AM)、

cephalothin (CF)、gentamicin (GM)、amikacin (AN)、ceftazidime (CAZ)、ceftriaxone (CRO)、

imipenem (IPM)、ciprofloxacin (CIP)、cefepime (FEP)、ampicillin/sulbactam (AMS)、piperacillin- tazobactam (TZP)、ertapenem (ETP) 抗生素紙綻於瓊脂的表面，若為尿液檢體則加貼nalidixic acid (NA)、nitrofurantoin(F/M)，置於35 ℃，一般培養箱隔夜培養後判讀，觀察並測量抑制環的直徑大小(mm)¹⁵。

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結果

一、臨床菌株之分析

本研究共收集2007年1月至2008年6月符合醫療照護相關ESBL-producing K. pneumoniae 感染定義之菌株共44株，經進一步實驗分析時發現編號第33號菌株及第44號菌株有雜菌汙染故予以剔除，其餘42株細菌之病人性別、年齡與住院病房分布（如表一），資料分析顯示醫療照護相關ESBL-producing K. pneumoniae 感染部 位以泌尿道感染59.5% 最多，而病房分佈則以一般病房78.6% 較加護病房11.4% 高出6至7倍。

二、PFGE 電泳分析

以PFGE 對所收集之 ESBL-producing K.

pneumoniae 進行分析所得結果 ( 如圖一 )，其 中菌株編號1與2在圖譜上可見具有100% 相同度，分析檢體來源同一病人不同部位，收集時間為2007年2月5日與2007年2月6日，檢體來源為尿液與血液，可視為此次PFGE 之品質保證，編號25與35在圖譜上可見具有100% 相同度，編號25來自呼吸照護中心 ( 位於2樓 ) 收集時間為2007年8月19日，編號35來自神經加護

中心( 位於4樓 ) 收集時間為2007年12月3日，

照顧醫護人員也不相同，排除直接關聯性，而編號6、10與編號14、18及編號16、17雖分別具有90% 以上相似度但編號6來自呼吸照護中心( 位於2樓 ) 收集時間為2007年3月24日，編號10來自65病房 ( 位於6樓 ) 收集時間為2007 年4月24日，編號16來自31病房 ( 位於3樓 ) 收集時間為2007年6月26日，編號17來自23病房( 位於2樓 ) 收集時間為2007年6月22日照顧醫護人員也不相同，排除直接關聯性，但是編號14與18皆來自內科加護中心 ( 位於4樓 ) 收集時間為2007年6月13日與2007年6月16日，

抗生素感受性結果也相同，推測可能經由透過醫護人員照顧過程交互傳染，除此之外其餘醫療照護相關ESBL-producing K. pneumoniae 感 染菌株並不相似，可見並無群聚感染情形發生或優勢菌株存在，雖然病人得到醫療照護相關ESBL-producing K. pneumoniae 感染可能與 病人本身免疫能力及抗生素使用等諸多因素有關，醫護人員照顧病人是否嚴格執行感控措施對於減少病人得到醫療照護相關感染的機會有一定的相關，由此次研究結果推測經由醫護人員而導致醫療照護相關ESBL-producing K.

pneumoniae 感染的機會相對不高，與該院醫護 人員照護病人落實執行醫療照護相關感染管制措施及推行洗手運動與洗手稽核等措施有關。

三、抗生素感受性試驗

在抗生素敏感試驗方面可以發現醫療照護相關ESBL-producing K. pneumoniae 感染對 抗生素ampicillin、cephalothin、ceftriaxone、

ceftazidime、ciproﬂoxacin、cefepime、ampicillin/

sulbactam 皆呈抗藥性，但對 gentamicin 之抗藥性大於六成以上，而對amikacin、piperacillin- tazobactam 則約有六成左右感受性，對於治療醫療照護相關ESBL-producing K. pneumoniae 感染之藥物仍以carbapenem 類藥物敏感性測試最佳，imipenem 與 ertapenem 之感受性分別為 100% 及94.6%，如表二。

表一：醫療照護相關 ESBL-producing K. pneumoniae 感染病人之分佈表

性別男性 24

女性 18

醫療照護相關感染部位

UTI 25

BSI 6

LRI 7

SSI 2

SKIN 1

OTH 1

病房別一般病房 33

加護病房 9

年齡 <64 17

≧ 65 25

UTI：urinary tract infection，

BSI：bloodstream infection，

LRI：lower respiratory infection，

SSI：surgical site infection，OTH：other

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圖一：ESBL-producing K. pneumoniae 醫療照護相關感染菌株脈衝電泳 (PFGE) 分析圖。

1 2 12 36 38 28 9 37 40 27 31 32 29 21 7 4 6 10 14 18 15 11 16 17 13 24 20 5 22 30 23 26 8 19 39 43 34 41 42 3 25 35

100 90 80 70 60 50 40

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討論

過去文獻已證實臨床上大量使用廣效型 cephalosporins ( 如 ceftazidime、ceftriaxone 等 )，

會加速篩選出ESBL-producing 的細菌，導致該細菌盛行率偏高¹⁶，而最近的文獻報導也指出使用 piperacillin-tazobactam 是產生 ESBL-producing K.

pneumoniae 或 ESBL -producing E. coli 菌血症的 危險因子¹⁷，ESBL 的產生會讓接受不當抗生素治療的病人無可避免的治療失敗，也有文獻報導當病人被ESBL 菌株感染經 cephalosporins 治療其死亡率自42% 到100% 不等，cephalosporins 用於 ESBL-producing K. pneumoniae 多重感染的個案 失敗率也大於50%，用於治療 ESBL-producing K.

pneumoniae 及 ESBL-producing E. coli 之醫療照護 相關感染菌血症，其死亡率也高且癒後差¹⁸，如果偵測到細菌有ESBL，則所有的 cephalosporins;

penicillins 及 aztreonam 都應報告為無感受性，甚至連在藥物敏感性試驗結果呈感受性者也要報告為無感受性，此次實驗藥物感受性結果顯示，在所有的ESBL-producing K. pneumoniae 菌株中，

僅2.4% 對 ciproﬂoxacin 具感受性，此暗示 ﬂuoro- quinolone 已完全不適合用於治療 ESBL-producing K. pneumoniae。而全部菌株對於 carbapenem 類 藥物如imipenem 與 ertapenem 均具高度感受性，

顯示cabapenem 類抗生素仍是目前對抗 ESBL producing K. pneumoniae 最有效之抗生素。

而在美國臨床實驗室標準機構(CLSI) 最新指引中¹⁹，對分離菌株進行篩選及確認是否為ESBL 的方法分別有雙紙錠協同測試法 (DDST) 及最低抑菌濃度測試法 (Minimal inhibitor concentration, MIC)，不論使用何種方法都需要

先對測試菌株進行篩選，以紙錠擴散法來看，若菌株為K. pneumoniae、E. coli 及 K. oxytoca 時，

抗生素感受性試驗ceftazidime (CAZ) 抑制環的直徑大小 ≦22mm、ceftriaxone (CRO) ≦25mm、

aztreonam (ATM) ≦ 27mm、cefotaxime (CTX)

≦27mm 則懷疑為 ESBL-producing 菌株，需要再進行雙紙錠協同測試法(DDST) 確認。然而隨著CLSI 對於 CAZ 及 CRO 抗生素感受性試驗結果“感受性(S)”之抑制環的直徑大小分別將CAZ ≧18mm 更改為 CAZ ≧21mm 及 CRO ≧21mm 更改為 CRO ≧23mm，臨床微生物檢驗室若使用新更改之判讀標準，CLSI 已建議不再針對ESBL 進行篩選，若要進行 ESBL 篩選也僅是配合感染管制與流行病學的調查。

脈衝式電泳法(PFGE) 為目前細菌基因分型公認的標準方法，擁有最佳分型能力，已被廣泛應用於醫療照護相關感染群突發之調查，主要是提供判定傳播於病人間、醫護人員或醫院環境間之同種細菌是否源自同一基因型，也是建立細菌分子流行病學很重要的工具，PFGE 分型法的優點，即為其單一基因的變異具有解釋的標準¹⁴， PFGE 分型法具有四種單一的基因變異，會分別造成PFGE 型別的微小 (1-3個 band) 差異，分別為：1.產生限制酶切割位(gain of restriction site)；

2. 失去限制酶切割位 (loss of restriction site)；3. 插入一段DNA 片段 (insertion of a DNA fragment)；

與4. 刪除一段 DNA 片段 (deletion of a DNA fragment)。此外，PFGE 分型法亦有與流行病學資料結合的四種判定準則(The criteria for interpreting PFGE patterns)：1. 當此菌株之 PFGE 型別與群突發菌株(outbreak strain) 之 PFGE 型別完全相同時，則判定為無差異(indistinguishable)，

表二：醫療照護相關 ESBL-producing K. pneumoniae 感染抗生素感受性統計表

抗生素感受性 %

AM CF GM AN CAZ CRO IPM

0 0 35.7 59.5 0 0 100

CIP FEP ETP AMS TZP NA F/M

2.4 0 94.6 0 56.1 4.5 26.9

ampicillin(AM)、cephalothin(CF)、gentamicin(GM)、amikacin(AN)、ceftazidime(CAZ)、ceftriaxone(CRO)、

imipenem(IPM)、ciprofloxacin(CIP)、cefepime(FEP)、ertapenem(ETP)、ampicillin/sulbactam(AMS)、piperacillin-

tazobactam(TZP)、nalidixic acid(NA)、nitrofurantoin(F/M)

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而應將此菌株歸為群突發菌株(isolate is part of the outbreak)；2. 當此菌株之 PFGE 型別與群突發菌株(outbreak strain) 之 PFGE 型別相差2-3個 bands 時，則判定為與群突發菌株極相似 (closely related)，而應視此菌株極可能為群突發菌株 (isolate is probably part of the outbreak)；3. 當此菌株之PFGE 型別與群突發菌株 (outbreak strain) 之PFGE 型別相差4-6個 bands 時，則判定為與群突發菌株可能相似(possibly related)，而應視此菌株為可能是群突發菌株(isolate is possibly part of the outbreak)；4. 當此菌株之 PFGE 型別與爆發流行菌株(outbreak strain) 之 PFGE 型別相差6個 bands 以上時，則判定為與群突發菌株不同(different)，而應視此菌株不是群突發菌株 (isolate is not part of the outbreak)。因此，基因變異的解釋標準與流行病學結合的判讀準則構成了PFGE 分型法被廣泛使用的重要因素。

此次調查發現ESBL-producing K. pneumo- niae 醫療照護相關感染其基因型並未有集中趨 勢亦無優勢菌株存在，由研究結果推測經由醫護人員而導致ESBL-producing K. pneumoniae 醫 療照護相關交互感染的機會相對不高，探討原因應與醫護人員落實執行感染控制措施及抗生素使用管制的執行有關，除此之外與感控人員持續在職教育及感控措施稽核等因素亦有關。

誌謝

本研究由三軍總醫院民診研究計畫(計畫編號TSGH-C97-85、TSGH-C100-030、DOD-C13-02) 經費補助。

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Extended-spectrum β-lactamases Producing Klebsiella Pneumoniae in A Medical Center

Ming-Chin Chan¹, Ching-Mei Chang¹, Yu-Hui Chiu¹, Tzu-Feng Huang¹, Ning-Chi Wang^1,2, and Jung-Chung Lin^1,2

1

Infection Control Office,

²