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(1)

第三章、實驗結果與討論

3-1 碳六十與 Anti-IgG 抗體間的吸附

3-1-1 塗佈碳六十石英晶體對 Anti-IgG 抗體的感應

本實驗以石英壓電晶體為研究之工具,利用自組的電子線路(包含 震盪線路、頻率/電壓轉換器、類比/數位轉換器之微電腦介面)來記 錄其震盪頻率。首先將碳六十利用旋轉塗佈裝置塗佈於石英晶片上,

隨後將已塗佈之石英晶片置入實驗槽中。待系統頻率穩定之後,再注 Anti-IgG 抗體溶液。觀察其頻率變化,圖 3-1(A)為此系統在無抗體 存在時之基準線。此為利用碳六十石英晶片偵測 Anti-IgG 抗體,以 探討碳六十與 Anti-IgG 抗體間的反應。碳六十石英晶片對 Anti-IgG 抗體的感測訊號,其結果如圖3-1(B)。

3-1-2 碳六十的塗佈量效應

研究碳六十的塗佈量是否會影響Anti-IgG 抗體的吸附量,當 Anti-IgG 抗體的濃度固定為 0.09 mg/ml 時,將碳六十塗佈於石英晶 片的量逐漸增加,此時頻率變化下降量也隨之增加;直到塗佈量到達 1.29μg 時,再增加碳六十的塗佈量時,發現頻率變化感應訊號的下 降量不再增加,此時石英晶片吸附的抗體量已達飽和。由此可推測因 為石英晶片的表面積固定,碳六十塗佈的吸附量是有限的。所以當吸 附量達到飽和時,塗佈量再增加,其抗體的吸附量也不會增加。結果 如圖3-2。

(2)

3-1-3 Anti-IgG 抗體的濃度效應

由上述結果得知碳六十的最適塗佈量為 1.3μg,因此將碳六十的 塗佈量固定於1.3μg ,探討注入不同 Anti-IgG 的濃度其頻率的變化 情形,注入不同濃度的 Anti-IgG 抗體溶液,隨著注入 Anti-IgG 抗體 濃度的增加,其頻率變化下降值也跟著增加;當 Anti-IgG 抗體濃度 到達 0.027 mg/mL 時即吸附量 1.29×10

-4

mole/µg,頻率不再有太大 的變化,會造成這種結果推測原因為:固定於石英晶片的碳六十分子 有限,所以對於抗體的吸附量也有其飽和點。其實驗結果如圖3-3。

3-1-4 Anti-IgG 抗體的吸附及脫附

為了解碳六十和 Anti-IgG 抗體間作用力,碳六十和 Anti-IgG 抗 體之間的吸附情形是為一化學吸附或物理吸附是本研究所關切的重 點,如果是單純的物理吸附,那麼注入大量的去離子水時,訊號會回 至基值;反之若為一化學吸附則訊號不會回至基值。本研究使用動相 系統來探討此一反應。塗佈碳六十的石英晶片,於 Anti-IgG 抗體注 入後,訊號下降量一直增加直到一平衡狀態,此時開始注入大量的去 離子水入實驗槽內,結果發現訊號無法回到起始點,即為不可脫附的 現象,可推測碳六十與抗體間的作用力可能為不可逆的化學吸附。其 結果如圖3-4。

(3)

0 500 1000 1500 2000 2500 -350

-300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50

B

A

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Time/s

3-1 (A)石英壓電晶體感測偵測系統基準線

(B)塗佈碳六十之石英晶體對 Anti-IgG 抗體的感應頻率 變化

Fig.3-1 (A) Piezoelectric crystal detection baseline

(B)Frequency shift of C

60

coated quartz crystal for anti-human IgG (0.01 mg/mL) at 30℃

(4)

0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 540

550 560 570 580

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Coating Load/ µ g

3-2 石英壓電晶片之碳六十塗佈量對 anti-IgG 抗體的影響

Fig.3-2 Effect of C

60

coating load effect on the frequency shift of PZ sensor for 0.09mg/mL anti-human IgG at 30℃

(5)

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 250

300 350 400 450 500 550 600

Fr equency shi ft /H z

Anti-IgG conc./(mg/mL)

3-3 碳六十石英壓電晶體感測 Anti-IgG 抗體之頻率變化

Fig.3-3 Effect of anti-human IgG concentration on the frequency response of C

60

coated(1.3μg) PZ sensor at 30℃

(6)

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 -1200

-1000 -800 -600 -400 -200 0 200

deionized water injection anti-human IgG

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Time/s

3-4 塗佈碳六十石英壓電晶體對 anti-IgG 抗體之不可逆訊號

Fig.3-4 Irreversible response curve of anti-human IgG (0.09 mg/mL) with C

60

(1.4µg) coated PZ crystal sensor

(7)

3-2 碳六十 - Anti-IgG 抗體固定化之研究

3-2-1 碳六十-Anti-IgG抗體的鑑定

塗佈碳六十的石英晶體,經動相脫附系統的研究顯示碳六十與 Anti-IgG 抗體的吸附在石英壓電晶體上為一不可逆之訊號,因此推測 可能其為化學吸附。化學吸附為單層吸附,且有產生化學鍵結,想要 進一步確認碳六十與 Anti-IgG 抗體的鍵結,因此本實驗將碳六十與 Anti-IgG 抗體做合成反應,欲得到碳六十與 Anti-IgG 抗體的產物。使 用的方法為將碳六十與 Anti-IgG 抗體在一起攪拌,置於室溫中約一 日就可見發現原本因碳六十不溶於水而呈現分離為兩層的溶液,變成 混濁的棕褐色,與原先之碳六十黑色顆粒有所分別;根據結果判定碳 六十與抗體必然產生了反應,且產物呈黏稠狀;將產物經過濾、離心 後等步驟後,再利用 IR 光譜鑑定產物。將產物的 IR 光譜和 Anti-IgG 抗體的光譜和碳六十的光譜相互比較。結果顯示產物具有抗體若干個 吸收峰如圖 3-5 (A) (B) (C)。

(8)

3-5 (A) Anti-IgG 抗體之 IR 圖 Fig.3-5 (A) IR spectra of anti-IgG

C -C

C = C

O -H

(9)

3-5 (B) 碳六十/ Anti-IgG 抗體之 IR 圖 Fig.3-5 (B) IR spectra of C

60

/anti-IgG

C=C

O-H

N-H C-C C60

(10)

3-5 (C) 碳六十之 IR 圖 Fig.3-5 (C) IR spectra of C

60

(11)

文獻上抗體固定於石英晶體的方法,不勝枚舉。最常使用的高分 子固定法如poly(ethylene imine),此法已被沿用數年。除此之外亦有 使用poly(vinyl dienfluodide)薄膜作為固定抗體的文獻;而直接將抗體 固定於空白晶片上的方法,亦是抗體固定化研究之方法。因此本實驗 將這些方法與碳六十/Anti-IgG 抗體固定化做一比較。結果顯示,以 碳六十固定 Anti-IgG 抗體的壓電系統研究模式,顯然優於空白晶片 PVDF 的研究方式。碳六十固定上 Anti-IgG 抗體時,由頻率的下 降量可觀察出其吸附量的多寡,使用空白晶片的方式其頻率的下降量 少於其他方法; 再注入 IgG 抗體溶液時,使用空白晶片的方式其吸 附量亦少於其他方法,依此結果推測晶片有可能毒化抗體,造成偵測 IgG 抗體時,Anti-IgG 抗體無法辨識 IgG 抗體。由結果可看出,偵測 能力上PEI 是最好的,但由於其操作的方法較碳六十複雜,而使用碳 六十的方法亦可達到接近的效果,操作上較方便,省時。結果如圖 3-6,3-7。

(12)

0 1000 2000 3000 4000 -1000

-800 -600 -400 -200 0 200

anti-human IgG injection

deionized water

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Time/s

3-6 塗佈 PVDF 石英壓電晶體對 anti-IgG 抗體之不可逆訊號

Fig.3-6 Irreversible response curve of anti-human IgG(0.09mg/mL) with PVDF coated PZ crystal sensor at 30℃

(13)

1.空白晶片 2 塗佈 PVDF 之晶片 3.塗佈碳六十之晶片 4. 塗佈 PEI 之晶片

3-7 四種固定抗體方法之比較

Fig.3-7 Comparison of frequency responses for the four methods of anti-IgG immobilize on (1) blank (2) PVDF (3)C60 (4)PEI coated PZ crystal sensor

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

1 2 3 4

Frequency shift/Hz

anti-IgG

IgG

(14)

3-3 碳六十/Anti-IgG 抗體- IgG 抗體之探討

3-3-1 碳六十 - Anti-IgG抗體的活性

Anti-IgG 抗體固定於碳六十石英晶片之後,由於固定化之後的 Anti-IgG 抗體是否仍保有活性是一個重要的問題,因此首先必須檢驗 其是否保有活性。本實驗的目的是期能運用碳六十/Anti-IgG 抗體來 偵測IgG 抗體及探討 Anti-IgG 抗體及 IgG 抗體間的反應性。

此實驗方法為將已固定化之 C

60

/anti-human IgG 石英晶片,置入 實驗工作槽中,待頻率穩定之後,再注入IgG 抗體溶液。注入 IgG 抗 體 分 子 後 發 現 頻 率 變 化 量 也 隨 之 下 降 。 由 此 可 知 此 固 定 化 之 C

60

/anti-human IgG 晶片仍保有活性,可用來偵測 IgG 抗體分子,並 研究Anti-IgG 抗體及 IgG 抗體間的反應,其實驗結果如圖 3-8。

3-3-2 碳六十/Anti-IgG抗體- IgG抗體之可逆性

Anti-IgG 抗體- IgG 抗體間的吸附,是一種物理性吸附,並非化 學吸附,所以碳六十/ Anti-IgG 抗體石英晶片於每次使用後可再生,

重複使用。本實驗發現Anti-IgG 抗體- IgG 抗體間的吸附作用力並不 強,但辨識能力很好,因此於工作槽內通入大量的去離子水,大部分 的訊號皆可回復至起始值。如圖 3-9

本實驗討論進一步探討anti-human IgG 及 human IgG 間的結合能 力、濃度關係、pH 值效應、溫度效應等。

(15)

0 500 1000 1500 2000 2500 -350

-300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50

injection human IgG

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Time/s

3-8 固定化之碳六十/Anti-IgG 抗體石英晶片對 IgG 抗體的感測訊

Fig.3-8 Frequency shift of C

60

/anti-human IgG (1.4µg) coated quartz crystal for 5 ng/mL human IgG at 30℃

(16)

pure water

3-9 碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測器對抗原感測之可逆訊號 Fig.3-9 Reversible response of C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor at

30℃

(17)

3-3-3 碳六十/Anti-IgG抗體-IgG抗體的濃度效應

本實驗利用塗佈碳六十/Anti-IgG 抗體的石英壓電晶體感測器,

偵測各種不同濃度的 IgG 抗體溶液,發現偵測訊號的頻率變化,隨 IgG 抗體濃度的增加頻率下降值也隨之增加,結果顯示在 10

-1

10

-4

(mg/ml)間有不錯的線性關係。一般石英壓電晶體的靈敏度,即為 Δ F 對 濃 度 作 圖 所 得 的 斜 率 ( 圖 3-10) , 由 圖 中 可 得 此 C60/Anti-humanIgG 塗佈在壓電感測器偵測 IgG 靈敏度(m)為 130.56 在此研究使用20 次重複偵測之空白值標準偏差(Sb)為 0.011,並由此 濃度效應研究可測定此壓電偵測法之偵測下限(Detection Limit, C

L

)可 IUPAC 的定義求得。其式子為:

X

L

=X

B

+KS

B

(3-1) C

L

=KS

B

/m (3-2) 式中

X

L

=為校正的訊號強度 X

B

=空白值的強度

S

B

=背景空白值藉由 20 次量測產生的標準差 C

L

=偵測下限

K=信度範圍

m=分析物的靈敏度

由圖中可得此 C60/Anti-IgG 塗佈壓電感測器偵測偵測下限為 3.25×10

-4

mg/ml。

為了避免非專一性物質的干擾,需將石英晶片表面作修飾,使用 的方法是用 BSA 覆蓋非專一性結合的部分,其實驗結果如圖 3-11。

(18)

-4.0 -3.5 -3.0 -2.5 -2.0 50

100 150 200 250 300 350

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log[IgG]

3-10 碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電晶體感測器之 IgG 濃度效應 Fig.3-10 Concentration effect of human IgG on frequency response of

C60/anti-human IgG (1.4µg) coated PZ sensor at 30℃

(19)

0 2 4 6 8 10 100

150 200 250 300

350

A B

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IgG/(ng/mL)

3-11 碳六十/Anti-IgG 抗體 /BSA 及碳六十/Anti-IgG 抗體石英晶 片對於 IgG 抗體感測訊號的比較

Fig.3-11 Human IgG concentration effect on frequency response of (A)C

60

/anti-human IgG (B)C

60

/anti-humanIgG/BSA and coated PZ crystals

(20)

3-3-4 碳六十/ Anti-IgG抗體- IgG 抗體的溫度效應

對大多數的抗體蛋白質而言,溫度會影響其反應,一般反應會隨 著溫度增加而增加,但到達一高溫時可能會造成抗體蛋白質變性,導 致活性衰退。因此本實驗探討溫度 Anti-IgG 對 IgG 作用力,觀察在 不同得溫度之下,抗體的活性是否會受溫度的影響;由實驗結果(圖 3-12)發現,固定化之 Anti-IgG 抗體的反應性會隨著溫度上升而增加;

當溫度增加到 30℃時,反應的活性達到最佳狀態,因此可知最適的 反應溫度為 30℃,而文獻中提到非固定化抗體一般最適的反應溫度 30-50℃範圍內

(52)

。本實驗的結果和文獻相符。

3-3-5 碳六十/Anti-IgG抗體- IgG抗體的 pH 值效應

除了溫度之外,溶液中的 pH 值也會影響到反應的活性, 過酸或 過鹼的溶液都會導致抗體活性的變化,所以pH 值也是影響抗體活性 的一大因素;為了解水溶液中,IgG 抗體活性隨 pH 值變化的關係,

30℃的固定溫度下,且 IgG 抗體濃度於 0.01(mg/mL)的條件下,配 製不同的 pH 值溶液來探討其反應情形。由圖 3-13 可知在 pH 值 6.7 C60/Anti-IgG 活性最大,而過酸或過鹼都會使抗體的活性變小。

(21)

10 20 30 40 50 0

50 100 150 200 250 300 350

Fr eq uenc y s hi ft/ H z

Temperature/

o

C

3-12 碳六十/Anti-IgG 抗體石英晶體感測器對偵測 IgG 抗體的溫度 效應

Fig.3-12 Temperature effect on C

60

/anti-human IgG coated piezoelectric crystal sensor for human IgG( 0.01 mg/mL)

(22)

4 5 6 7 8 9 0

50 100 150 200 250 300 350

Fr e que nc y s h if t/ H z

pH value

3-13 碳六十/Anti-IgG 抗體石英晶體感測器對偵測 IgG 抗體的 pH 值效應

Fig.3-13 pH effect on frequency response of C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor for human IgG(0.01mg/ml) at 30℃

(23)

3-3-6 碳六十/Anti-IgG 壓電晶體感測器的再現性

免疫分析方法中最常使用的是 ELISA(酵素免疫分析法)的方法,

然而此種利用螢光標定的分析方法,每一次分析都需要用新的樣品,

抗體並不能重複使用,往往造成樣品的浪費。Anti-IgG 抗體 IgG 抗 體的作用力為物理吸附,可藉由通入大量的再生液,使之分離。如此 一來就能將固定化之晶片重複使用均為昂貴的樣品,因此本實驗運用 石英壓電的分析方法,能將固定化之 Anti-IgG 抗體重複利用,必可 節省成本。結果得知如圖 3-14,本實驗所研製的碳六十/抗體石英壓 電感測晶體,使用七次有不錯的再現性 其RSD 值為 3.55%。

3-3-7 碳六十/Anti-IgG 抗體的儲存活性

Anti-IgG 抗體固定於石英晶片上的探針,欲得知其保存性,因此 將碳六十/Anti-IgG 抗體石英晶片儲存於 4℃的溫度下,經過七天後 仍有 90%的活性如圖 3-15,因此本實驗之固定化抗體具有實用上的 經濟價值。

(24)

1 2 3 4 5 6 7 0

50 100 150 200 250 300 350

Fr eque nc y s h if t/ H z

Times

3-14 碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測器的再現性

Fig.3-14 Repeatability of C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor for IgG (0.01mg/mL)at 30℃

(25)

1 2 3 4 5 6 7 0

20 40 60 80 100

A cti vi ty (% )

Day

3-15 碳六十/Anti-IgG 抗體之儲存活性

Fig.3-15 The activity of immobilizedC

60

/anti-human IgG as function of time

(26)

3-4 固定化感測系統受到干擾物質的影響

3-4-1 血液中干擾物質的影響

在人體的血液中。存在許多干擾物質,本實驗特別探討這些物質 是否會影響壓電系統之偵測。血液中的干擾物主要有尿素(urea)、尿 酸(uric acid)、維他命 C(ascorbic acid)、半胱胺酸(cystein)、酪胺酸 (tyrosine)。血液中 ascorbic acid 的濃度為 0.4-1.5mg/100ml ,urea,

uric acid 的濃度為 8mg/100ml ,cystein 及 tyrosine 的濃度也都小於 10

-3

M,而實驗結果如圖 3-16、3-17、3-18、3-19、3-20。可發現在有 干擾物的存在下之壓電感測器頻率訊號和只有 IgG 抗體存在之下之 頻率訊號幾乎一樣,換言之,這些物質對本實驗的偵測不會有影響,

由表 3-1 可知其干擾係數(interfering facor)皆很少,在 6.15×10

-3

8.57×10

-3

之間而在其他物質干擾存在下此壓電感測器對 IgG 之選 擇性係數(selectivity)也很好,皆接近 1.0。

3-4-2 鹽類的影響

人體中的鹽類能使體液維持在適當的 pH 值範圍,且決定組織中 水分的多寡,維持一定的滲透壓,因此探討是否會影響本實驗。結果 顯示鈉離子、鉀離子、鈣離子在 10-3M 濃度時,亦不會對本實驗造成

(27)

3-1 不同干擾物質對碳六十/抗體壓電感測器的影響

Table 3-1 Influence of different interference on the C60/anti-human IgG PZ sensor

干擾物質 IgG 濃度

( mg/mL) ΔF ΔF-ΔF0

ΔF0

ΔF ΔF0

cysteine 0.01 370 5.43×10-3 99.4%

ascorbic acid 0.01 350 5.75×10-3 99.4%

tyrosine 0.01 365 5.51×10-3 99.5%

urea 0.01 354 5.68×10-3 99.4%

uric acid 0.01 350 8.65×10-3 99.1%

Na+ 0.01 348 1.16×10-2 98.8%

K+ 0.01 350 1.16×10-2 98.9%

Ca2+ 0.01 370 1.65×10-2 98.4%

selectivity=

∆F0

∆F interfering factor =

0 0

∆F

∆F

∆F −

(28)

0 500 1000 1500 2000 -400

-300 -200 -100 0

B

A

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-16 於 1.0×10

-3

M 半胱胺酸存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓 電感測器頻率變化情形

Fig.3-16 Frequency responses of C

60

/anti-human coated PZ sensor for IgG (A) cysteine(1.0×10

-3

M) (B) IgG(0.01mg/mL) with cysteine(1.0×10

-3

M) at 30℃

(29)

0 500 1000 1500 2000 2500 -400

-350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0

B

A

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-17 於 1.0×10

-3

M 維他命 C 存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓 電感測器頻率變化情形

Fig.3-17 Frequency responses of C

60

/anti-human coated PZ sensor for IgG (A) ascorbic acid (1.0×10

-3

M) (B) IgG(0.01mg/mL) with ascorbic acid (1.0×10

-3

M) at 30℃

(30)

0 500 1000 1500 2000 2500 -400

-300 -200 -100 0 100

B

A

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-18 於 1.0×10

-3

M 酪胺酸存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電 感測器頻率變化情形

Fig.3-18 Frequency responses of C

60

/anti-human coated PZ sensor for IgG (A) tyrosine (1.0×10

-3

M) (B) IgG(0.01mg/mL) with tyrosine (1.0×10

-3

M) at 30℃

(31)

0 500 1000 1500 2000 2500 -400

-350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0

B

A

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-19 1.0×10

-3

M 尿素存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測 器頻率變化情形

Fig.3-19 Frequency responses of C

60

/anti-human coated PZ sensor for IgG (A) urea (1.0×10

-3

M) (B) IgG(0.01mg/mL) with urea (1.0×10

-3

M) at 30℃

(32)

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 -400

-300 -200 -100 0 100

B

A

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-20 1.0×10

-3

M 尿酸存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測 器頻率變化情形

Fig.3-20 Frequency responses of C

60

/anti-human coated PZ sensor for IgG (A) uric acid (1.0×10

-3

M) (B) IgG(0.01mg/mL) with uric acid (1.0×10

-3

M) at 30℃

(33)

0 500 1000 1500 2000 2500 -400

-350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50

B

A

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-21 於 10

-3

M 鉀離子存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測 器頻率變化情形

Fig.3-21 Frequency responses of C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor for (A) K

+

ions (1.0×10

-3

M) (B) IgG (0.01mg/mL) and K

+

ions (1.0×10

-3

M) at 30℃

(34)

0 500 1000 1500 2000 -400

-350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50

B

A

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-22 於 10

-3

M 鈉離子存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測 器頻率變化情形

Fig.3-22 Frequency responses of C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor for (A) Na

+

ions (1.0×10

-3

M) (B) IgG (0.01mg/mL) and Na

+

ions (1.0×10

-3

M) at 30℃

(35)

0 500 1000 1500 2000 -400

-300 -200 -100 0 100

B

A

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-23 10

-3

M 鈣離子存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測器 頻率變化情形

Fig.3-23 Frequency responses of C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor for (A) Ca

2+

ions (1.0×10

-3

M) (B) IgG (0.01mg/mL) and Ca

2+

ions (1.0×10

-3

M) at 30℃

(36)

3-4-3 金屬離子的影響

金屬對人體的影響是不可忽視的,本研究將 10

-3

M 之 Cu

2+

Pb

2+

等重金屬離子置於實驗槽中,觀察其是否會影響對IgG 偵測,結果顯 示其會影響本實驗的偵測,如圖3-24。進一步研究其是否因與石英晶 片上的 Anti-IgG 抗體產生反應,而影響偵測,因此將金屬離子 10

-3

10

-5

M 注入實驗槽中,發現 Anti-IgG 抗體與金屬的結合力並不強,

石英晶體感測器所測得的頻率下降量,約20-30Hz。金屬離子可能使 IgG 變性,造成 Anti-IgG 抗體辨識的困難,因而影響偵測。

3-5 探討有機物質對 Anti-IgG 抗體及 IgG 抗體結合的影響

人體中有一些有機物質,本研究探討在各種有機物質的環境下,

抗體和抗原的反應是否會受到影響。於醇類的溶液中(圖3-25),發現 其中甲醇的影響最為顯著,由此可知甲醇對IgG 的偵測影響最大。推 測甲醇的極性最大,最容易產生氫鍵。所以這三種醇類分子相比較,

則甲醇較易影響 Anti-IgG 抗體及 IgG 抗體分子的結合。本研究亦探 討在酸存在的溶液中對IgG 偵測之影響,結果發現在苯甲酸存在時,

(37)

由於氨會與 Anti-IgG 抗體分子結合,所以會將 Anti-IgG 抗體分子自 晶片上抓下來,此現象由頻率的變化可得知。如圖3-27。對於酮類及 醛類也做探討。由於醛類分子會和抗體分子鍵結,因而影響IgG 抗體 分子的反應,而環己醛的分子影響較大,推測其環的體積較大,所造 成的立體障礙也較大,且具有苯環疏水基易影響抗體間的反應。如圖 3-28。

(38)

0 500 1000 1500 2000 -500

-400 -300 -200 -100 0 100

c b a

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-24 於 10

-3

M 鉛離子及銅離子存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英 壓電感測器頻率變化情形

Fig.3-24 Frequency responses of C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor for (A) human IgG (0.01mg/mL) (B) IgG(0.01mg/mL) and Pb

2+

(10

-3

M) and (C) IgG (0.01mg/mL) and Cu

2+

(10

-3

M) at 30℃

(39)

圖 3-25 於不同濃度的甲醇、乙醇、丙醇的存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測器頻率變化情形

Fig.3-25Concentration effect of methanol , ethanol and propanol concentration effect on the frequency shift of C

60

/anti-Human IgG coated piezoelectric crystal detector for 0.1mg/ml Human-IgG at 30℃

0 5 10 15 20 25

-250 -200 -150 -100 -50 0

F 1 - F 0

solvent conc./(%)

methanol ethanol propanol

(40)

0 500 1000 1500 2000 2500 -350

-300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50

B A

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-26 於 10

-5

M 苯甲酸存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測 器頻率變化情形

Fig.3-26 Frequency responses of C

60

/anti-human IgG coated PZ sensor for(A) human IgG(0.01mg/mL) and (B) IgG(0.01mg/mL) and benzoic acid (1.0×10

-5

M) at 30℃

(41)

0 500 1000 1500 2000 2500 -100

-50 0 50 100 150

F req uenc y s h ift /H z

Time/s

3-27 於 10

-5

M氨存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測器頻 率變化情形

Fig.3-27 NH

3

(10

-5

M) effect on frequency shift of C

60

/antHi-human IgG with human IgG PZ sensor for IgG 30℃

(42)

0 5 10 15 20

-220 -200 -180 -160 -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20

F

1

-F

0

Aldehyde conc./(%)

propanal Benzaldehyde

圖 3-28 於不同濃度的丙醛、苯甲醛的存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體 石英壓電感測器頻率變化情形

Fig.3-28 Effects of propanal and benzoaldehyde concentrations on the frequency shift of C

60

/anti-Human IgG coated piezoelectric crystal detector for 0.1mg/ml Human-IgG at 30℃

(43)

0 5 10 15 20 -160

-140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20

F 1 -F 0

Conc./(%)

acetone propanal

圖 3-29 不同濃度的丙酮、丙醛的存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英 壓電感測器頻率變化情形

Fig.3-29 Concentration effects of acetone and propanal on the frequency shift of C

60

/anti-Human IgG coated piezoelectric crystal detector for 0.01mg/ml human-IgG at 30℃

(44)

3-6 麥膠蛋白的偵測

食物與環境過敏是造成許多健康問題的因素,幾乎身體的每一部 份皆受其影響,例如:消化不良,胃炎,過敏等疾病。研究發現小麥 中的麥麩(gluten)會導致過敏現象的發生,而在麥麩成分當中,最具 毒性的就是麥膠蛋白(Gliadin)。如果麥膠蛋白此有毒抗原存在時,IgA 抗體的分泌量就會增加。因此本實驗利用石英壓電感測系統來偵測麥 膠 蛋 白 及 其 抗 體 的 反 應 , 將 其 麥 膠 蛋 白 利 用 碳 六 十 固 定 於 形 成 C60-Gliadin 化 合 物 而 塗 佈 石 英 晶 片 上 , 偵 測 麥 膠 蛋 白 抗 體 (anti-gliadin)。

3-6-1 碳六十和麥膠蛋白作用研究

本研究利用石英壓電晶體感測器為偵測的工具,首先將碳六十塗 佈於石英晶片上,置入水中待頻率穩定之後,注入麥膠蛋白溶液,利 用碳六十石英晶片偵測,以探討碳六十與麥膠蛋白間的反應。由碳六 十石英晶片對麥膠蛋白的吸附及脫附感測訊號。(如圖 3-30)可知 C60 吸附麥膠蛋白為一不可逆(Irreversible)吸附,而此不可逆吸附可能為 化學吸附,換言之,C60 可能會和麥膠蛋白形成 C60-麥膠蛋白化合 物(C60-gliadin)。

3-6-2 碳六十/麥膠蛋白活性研究

將以固定化之碳六十/麥膠蛋白石英晶片置入工作槽中,於訊號 平穩後,再注入麥膠蛋白抗體,觀察其頻率變化,由圖 3-31 中發現 有頻率下降的現象,由此可知固定化之 C60-gliadin 仍然有活性,可

(45)

0 2000 4000 6000 8000 10000 -1000

-800 -600 -400 -200 0 200

injected deionized water

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-30 碳六十塗佈壓電晶體對麥膠蛋白感測之不可逆吸附訊號 Fig.3-30 Irreversible response curve of gliadin with C

60

coated (1.4µg)PZ

crystal detector at 20℃

(46)

0 500 1000 1500 2000 2500 -400

-350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50

Fr eque nc y s h if t/ H z

Time/s

3-31 固定上碳六十/麥膠蛋白的石英晶體感測器對麥膠蛋白抗體的 頻率變化

Fig.3-31 Frequency response of C

60

/gliadin coated quartz crystal for anti-gliadin at 20℃

(47)

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 40

60 80 100 120 140 160 180 200

Fr equency shi ft /H z

Conc./(mg/ml)

3-32 碳六十/麥膠蛋白石英壓電晶體感測器對麥膠蛋白抗體之濃 度效應

Fig.3-32 Concentration effect of C

60

/gliadin coated PZ sensor for anti-gliadin

(48)

3-7 血紅蛋白的偵測

血紅蛋白(Hemoglobin, Hb)俗稱血紅素是由兩種不同成分組成,

一是血基質(Heme),另一則是球蛋白(globin)。其分子量約為 64500 Dalton。血紅蛋白主要是擔任氧氣的運輸工作,本研究利用碳六十和 血紅素結合成碳六十固定化血紅素 C60-Hb,並做為石英壓電晶體塗 佈物以偵測水溶液中之抗血紅蛋白(Anti-hemoglobin)抗體。

3-7-1 碳六十-血紅蛋白的結合

本研究利用碳六十塗佈石英壓電晶體感測器為偵測的工具,首先 將碳六十塗佈於石英晶片上,置入水中待頻率穩定之後,注入血紅蛋 白溶液,利用碳六十石英晶片偵測,以探討碳六十與血紅蛋白間的反 應(如圖3-33)。碳六十石英晶片對血紅蛋白的不可逆感測訊號。可知 血紅素可能會和C60 形成 C60-Hb 化合物。此固定化之血紅蛋白可用 用來偵測溶液中之血紅蛋白抗體,如圖3-34。

3-7-2 碳六十-抗血紅蛋白的結合研究

本研究亦利用碳六十塗佈石英壓電晶體感測器探討碳六十與抗 血紅蛋白作用的偵測工具,首先將碳六十塗佈於石英晶片上,置入水 中待頻率穩定之後,注入血紅蛋白抗體溶液,利用碳六十石英壓電晶 體為偵測器,以探討碳六十與血紅蛋白抗體間的反應。由碳六十石英 晶片對血紅蛋白抗體的不可逆感測訊號。(圖 3-35)可知抗血紅蛋白可

(49)

血紅蛋白之濃度效應,由圖 3-37 可發現此 C60/Anti-Hb 壓電感測 器對血紅蛋白偵測有良好的線性關係,本研究也探討此固定化晶片儲 存於4℃之活性生命期,其結果如圖 3-38 所示,此固定化 C60/Anti-H b 之活性會隨著時間慢減低,五天後活性為原來的 70%。

(50)

0 1000 2000 3000 4000 5000 -1000

-800 -600 -400 -200 0 200

deionized water

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-33 碳六十塗佈壓電晶體感測血紅蛋白之不可逆吸附訊號

Fig.3-33 Irreversible response curve of hemoglobin with C

60

coated PZ crystal sensor at 20℃

(51)

3-34 固定化之碳六十/血紅蛋白石英晶體對血紅蛋白抗體的頻率變

Fig.3-34 Frequency response of C

60

/Hemoglobin coated quartz crystal for anti-hemoglobin at 20℃

0 500 1000 1500 2000 -200

-150 -100 -50 0 50

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

(52)

0 1000 2000 3000 4000 -1000

-800 -600 -400 -200 0 200

deionized water

F req uenc y s hi ft /H z

Time/s

3-35 碳六十塗佈壓電晶體感測血紅蛋白抗體之不可逆吸附訊號 Fig.3-35 Irreversible response curve of anti-hemoglobin with C

60

coated

PZ crystal sensor

(53)

0 500 1000 1500 2000 -200

-150 -100 -50 0

Fr equency shi ft /Hz

Time/s

3-36 固定化之碳六十/抗血紅蛋白石英晶體對血紅蛋白的頻率變化 Fig.3-36 Frequency response of C

60

/anti-hemoglobin coated quartz

crystal for hemoglobin at 20℃

(54)

0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 20

40 60 80 100 120 140 160 180

F req uenc y s h ift /H z

Hb/(mg/mL)

3-37 碳六十/血紅蛋白抗體石英壓電晶體感測器之濃度效應 Fig.3-37 Concentration effect of hemoglobin on frequency response of

C

60

/anti-hemoglobin coated PZ sensor

(55)

1 2 3 4 5 0

20 40 60 80 100

Ac tiv ity (% )

Day

3-38 碳六十/血紅蛋白抗體之儲存活性

Fig.3-38 The activity of C

60

/anti-hemoglobin as function of time

(56)
(57)
(58)

數據

圖 3-5 (A) Anti-IgG  抗體之 IR 圖  Fig.3-5 (A) IR spectra of anti-IgG

圖 3-5

(A) Anti-IgG 抗體之 IR 圖 Fig.3-5 (A) IR spectra of anti-IgG p.8
圖 3-5 (B) 碳六十/ Anti-IgG 抗體之 IR 圖  Fig.3-5 (B) IR spectra of C 60 /anti-IgG

圖 3-5

(B) 碳六十/ Anti-IgG 抗體之 IR 圖 Fig.3-5 (B) IR spectra of C 60 /anti-IgG p.9
圖 3-5 (C) 碳六十之 IR 圖      Fig.3-5 (C) IR spectra of C 60

圖 3-5

(C) 碳六十之 IR 圖 Fig.3-5 (C) IR spectra of C 60 p.10
圖 3-6 塗佈 PVDF 石英壓電晶體對 anti-IgG 抗體之不可逆訊號

圖 3-6

塗佈 PVDF 石英壓電晶體對 anti-IgG 抗體之不可逆訊號 p.12
圖 3-7 四種固定抗體方法之比較

圖 3-7

四種固定抗體方法之比較 p.13
圖 3-8 固定化之碳六十/Anti-IgG 抗體石英晶片對 IgG 抗體的感測訊 號

圖 3-8

固定化之碳六十/Anti-IgG 抗體石英晶片對 IgG 抗體的感測訊 號 p.15
圖 3-9  碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測器對抗原感測之可逆訊號  Fig.3-9 Reversible response of C 60 /anti-human IgG coated PZ sensor at

圖 3-9

碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測器對抗原感測之可逆訊號 Fig.3-9 Reversible response of C 60 /anti-human IgG coated PZ sensor at p.16
圖 3-11 碳六十/Anti-IgG 抗體 /BSA 及碳六十/Anti-IgG 抗體石英晶 片對於 IgG 抗體感測訊號的比較

圖 3-11

碳六十/Anti-IgG 抗體 /BSA 及碳六十/Anti-IgG 抗體石英晶 片對於 IgG 抗體感測訊號的比較 p.19
圖 3-25 於不同濃度的甲醇、乙醇、丙醇的存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測器頻率變化情形

圖 3-25

於不同濃度的甲醇、乙醇、丙醇的存在下,碳六十/Anti-IgG 抗體石英壓電感測器頻率變化情形 p.39
圖 3-30 碳六十塗佈壓電晶體對麥膠蛋白感測之不可逆吸附訊號  Fig.3-30 Irreversible response curve of gliadin with C 60  coated (1.4µg)PZ

圖 3-30

碳六十塗佈壓電晶體對麥膠蛋白感測之不可逆吸附訊號 Fig.3-30 Irreversible response curve of gliadin with C 60 coated (1.4µg)PZ p.45
圖 3-34 固定化之碳六十/血紅蛋白石英晶體對血紅蛋白抗體的頻率變 化

圖 3-34

固定化之碳六十/血紅蛋白石英晶體對血紅蛋白抗體的頻率變 化 p.51

參考文獻

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