(1) D D DD (2)50 圖一、pGEX-5X-3-tTBP-Qn 重組質體、融合蛋白及限制酶圖譜分析

D D DD

50

圖一、pGEX-5X-3-tTBP-Qn 重組質體、融合蛋白及限制酶圖譜分析。

(A) pGEX-5X-3 質體的 SmaI 切位鄰近序列，及 TBP cDNA 上 HaeIII 切位鄰近序列，圖上並標示出 Factor Xa 辨識序列(IEGR 四個胺基酸) 及切割位置。(B) pGEX-5X-3 載體及置入於 SmaI 切位的 TBP cDNA HaeIII、AluI 片段。GST：glutathione-S- transferase gene；Ptac：tac

promoter；Lac I：repressor gene；Amp：Ampicillin resistance gene。(C) 不完整 N 端 TBP 蛋白(tTBP)包括 TBP N 端第 16~57 個胺基酸、3 或 61 個多麩醯胺鏈(Q)n及之後的 3 個胺基。(D) pGEX-5X-3 載體(lane 1) 及 pGEX-5X-3-GST-tTBP-Q3 (lane 2)、-Q61 (lane 3)質體經 EcoRI、XhoI 酵素雙切割的 1.4%洋菜膠電泳照片。Lane M1、M2 分別為 pGEM-4 質體以限制酶 HinfΙ 切割的結果及 1 kb DNA ladder (New England Biolabs)，作為片段大小標記。

D D DD

52

圖二、pGEX-5X-3m-nTBP-Qn 重組質體、融合蛋白及限制酶圖譜分 析。(A)修改過的 pGEX-5X-3m 質體的 AccI (site-directed mutagenesis 引入)、XhoI 切位鄰近序列。圖上並標示出 Factor Xa 辨識序列(IEGR 四個胺基酸)及切割位置。(B) pGEX-5X-3 載體及置入於 AccI/TaqI、

XhoI 切位間包含 20/45/61 個多麩醯胺鏈的 5' TBP cDNA 片段。GST：

glutathione-S- transferase gene；Ptac：tac promoter；Lac I：repressor gene；Amp：Ampicillin resistance gene。(C) N 端 TBP 蛋白(nTBP)包 含 TBP N 端第 1~57 個胺基酸、20/45/61 個多麩醯胺鏈(Q)n 及之後的 59 個胺基酸。(D) pGEX-5X-3m 載體(lane 1)及 pGEX-5X-3-GST- nTBP -Q20 (lane 2)、-Q45 (lane 3)、-Q61 (lane 4)質體經 PstI 切割的 0.8% (1)、

EarI 切割的 1.4% (2)洋菜膠電泳照片。Lane M 為 1 kb DNA ladder (New England Biolabs)，作為片段大小標記。

D D DD

54

圖三、pGEX-5X-3m-fTBP-Qn 重組質體、融合蛋白及限制酶圖譜分 析。(A)修改過的 pGEX-5X-3m 質體的 AccI (site-directed mutagenesis 引入)、NotI 切位鄰近序列。圖上並標示出 Factor Xa 辨識序列(IEGR 四個胺基酸)及切割位置。(B) pGEX-5X-3m 載體及置入於 AccI/TaqI、

NotI 切位間包含 20/45/61 個多麩醯胺鏈的全長 TBP cDNA 片段。圖

上並標示出限制酶 PstI 切位。GST：glutathione-S- transferase gene；

Ptac：tac promoter；Lac I：repressor gene；Amp：β-lactamase coding region。(C)全長 TBP 蛋白(fTBP)包含 TBP N 端第 1~57 個胺基酸、

20/45/60 個多麩醯胺鏈(Q)n及之後的 244 個胺基酸。(D) pGEX-5X-3m 載體(lane 1)及 pGEX-5X-3-GST-fTBP-Q20 (lane 2)、-Q45 (lane 3)、-Q61

(lane 4)質體經 PstI 切割的 0.8% (1)、EarI 切割的 1.4% (2)洋菜膠電泳 照片。Lane M 為 1 kb DNA ladder，作為片段大小標記。

DD DD

56

圖四、pGEX-5X-3m-TBP-Qn 重組質體、融合蛋白及限制酶圖譜分析。

(A)修改過的 pGEX-5X-3m 質體的 AccI (site-directed mutagenesis 引 入)、XhoI 切位鄰近序列。圖上並標示出 Factor Xa 辨識序列(IEGR 四個胺基酸)及切割位置。(B) pGEX-5X-3m 載體及置入於 AccI/TaqI、

XhoI 切位間僅包含 20/45/61 個多麩醯胺鏈及鄰近各四個胺基酸的

TBP 片段。圖上並標示出限制酶 MscI 切位。GST：glutathione-S- transferase gene；Ptac：tac promoter；Lac I：repressor gene；Amp：

β-lactamase coding region。(C) TBP 蛋白僅包含 TBP N 端第 54~57 個 胺基酸、20/45/60 個多麩醯胺鏈(Q)n及之後的 3 個胺基酸。(D) pGEX- 5X-3 載體(lane 1)及 pGEX-5X-3-GST-TBP-Q20 (lane 2)、-Q45 (lane 3)、

-Q60 (lane 4)質體經 MscI、XhoI 酵素雙切割的 1.2%洋菜膠電泳照片。

Lane M 為 1 kb DNA ladder (New England Biolabs)，作為片段大小標 記。

DD DD

58

圖五、pYES2-tTBP-Qn-EGFP 重組質體、融合蛋白及限制酶圖譜分 析。(A)不完整 TBP N 端(tTBP-Q20/Q54)的 EcoRI、PstI 片段與 in-frame 相連的綠螢光蛋白基因 PstI、NotI 片段。(B) pYES2 載體及置入的 EcoRI、NotI 切位。PGAL1：GAL1 promoter；CYC1TT：transcription terminator；pUC1/f1/2µ ori：origin；Ampicillin：ampicillin resistance gene；URA3：selection marker gene。(C) tTBP-Qn-EGFP 融合蛋白。

(D) pYES2 載體(lane 1)、pYES2-EGFP (lane 2)及 pYES2-tTBP- Q20- EGFP (lane 3)、-Q54 (lane 4)質體經 EcoRI + NotI (1)、PstI (2)切割的 0.8%洋菜膠電泳照片。Lane M 為 1 kb DNA ladder，作為片段大小標 記。

D D D D

60

圖六、pYES2-nTBP-Qn-EGFP 重組質體、融合蛋白及限制酶圖譜分 析。(A)完整 TBP N 端(nTBP-Q20/Q54)的 EcoRI、RsaI 片段與 in-frame 相 連的綠螢光蛋白基因 RsaI、NotI 片段。(B) pYES2 載體及置入的 EcoRI、NotI 切位。PGAL1：GAL1 promoter；CYC1TT：transcription terminator；pUC1/f1/2µ ori：origin；Ampicillin：ampicillin resistance gene；URA3：selection marker gene。(C) nTBP-Qn-EGFP 融合蛋白。

(D) pYES2 載體(lane 1)、pYES2-EGFP (lane 2)及 pYES2-nTBP-Q20- EGFP (lane 3)、-Q54 (lane 4)質體經 EcoRI + NotI 切割的 0.8% (1)、RsaI 切割的 1.2% (2)洋菜膠電泳照片。Lane M 為 1 kb DNA ladder，作為 片段大小標記。

圖七、SCA17 TBP 基因 CAG 三核苷酸重複次數分佈圖。所檢測的台 灣人族群包括正常人(Controls)、運動失調症患者(Ataxia)、失智症患 者(Dementia)、帕金森氏症患者(Parkinson's disease)、震顫患者(Tremor) 以及其他神經相關疾病患者(Others，包括舞蹈症患者、肌張力異常症 等)。

62

圖八、GST-fTBP-Qn 融合蛋白的誘導與表現。將構築好的質體轉入表 現宿主 BL21(DE3)中，當菌生長到 OD600≒0.6後以 IPTG 誘導不同時 間點(1~3 hr)後，離心蒐集細胞，以 BugBuster protein reagent 將 pellet 懸浮起以打破細菌抽取蛋白，再離心取上輕液以 10% SDS-PAGE 電 泳分析結果。膠圖顯示隨著不同時間點誘導下 GST-fTBP-Q20/Q45/Q61

融合蛋白皆有表現(圖中星號表示處)，相對大小分別約為 61 kDa、64 kDa、66 kDa，而 GST 本身大小約為 26 kDa。

圖九、純化後的 GST-fTBP-Qn 融合蛋白。GST-fTBPQn 融合蛋白經 GST˙Bind column 純 化 及 定 量 後 ， 以 Factor Xa 有 無 切 割 下 以 SDS-PAGE 電泳分析並且以 Coomassie blue 染色。圖中顯示在未切 割情況下可染到 GST-fTBPQn 融合蛋白相對大小(上排星號標示 處)；在切割後依然可染到 fTBPQn 相對大小(下排星號標示處)，表 示全長的 TBP 蛋白溶解度變佳。

64

圖 十 、 tTBP-Q3/Q61 蛋 白 的 filter trap 藥 物 檢 測 試 驗 。 純 化 的 GST-tTBP-Q3、GST-tTBP-Q61 融合蛋白經分裝入試管後，同時加入 Factor Xa (切開 GST、tTBP-Q3/Q61)及待檢測的小分子化合物(QC-17、

18、20、22、23、28、36、37、40、41)，或加入可能穩定並幫助擴 增的多麩醯胺鏈摺疊的剛果紅(Congo red)及海藻糖(Trehalose)作為控 制組。室溫作用 24 小時後將試管煮沸 10 分鐘以終止反應，並將反應 物過濾過 cellulose acetate 膜，再以 1C2 抗體檢測滯留在膜上的多麩 醯胺鏈聚集物。

圖十一、nTBP-Q20/Q45/Q61蛋白的 Coomassie blue 染色及抗體染色分 析。純化的 GST-nTBPQ20/Q45/Q61融合蛋白經分裝入試管後以 Factor Xa (切開 GST、nTBP-Q20/Q45/Q61)有無處理下以 SDS-PAGE 電泳分 析，Coomassie blue 染色結果顯示切割後的 nTBPQn 蛋白皆無法偵測 到，只能染到 GST 蛋白(26kDa)。另外分別以 TBP、GST、1C2 抗體 呈色結果顯示，TBP 可以辨識到 nTBP-Q20及、nTBP-Q45，1C2 則辨 識 nTBP-Q45及、nTBP-Q61能力較佳。GST 抗體專一性較差無法辨識 到 nTBP-Qn 相對大小片段。

66

圖 十 二 、 nTBP-Q20/Q45/Q61 蛋 白 的 western blot 藥 物 檢 測 試 驗 。 GST-nTBP-Q20/Q45/Q61蛋白經純化定量後，加入 Factor Xa 切割 24 小 時後加入剛果紅、海藻糖再作用 24 小時後終止反應，進行 SDS-PAGE 及 Western blot 分析。圖中顯示 GST-nTBP-Q45融合蛋白皆可被 TBP、

1C2 抗體辨識，但 1C2 辨識 GST-nTBP-Q61能力較佳；而 TBP 辨識 GST-nTBP-Q20能力較佳。在不同處理組下 GST-nTBP-Q20/Q45/Q61蛋白 量相較於未處理組下有變少趨勢，但是切割下的 nTBP-Q20/Q45/Q61蛋 白量無明顯改變，因此無法判斷藥物處理下能否幫助多麩醯胺摺疊。

圖十三、fTBP-Q20/Q45/Q61蛋白的 Coomassie blue 染色及 Western blot 藥物檢測試驗。(A)純化後的 GST-fTBP-Q20/Q45/Q60融合蛋白經 Factor Xa 有無切割後以 SDS-PAGE 電泳分析。圖中顯示 GST-fTBP-Q20/Q45

/Q60 以及切割下的 fTBP-Q20/Q45/Q61皆可被偵測到。顯示全長的 TBP 蛋白溶解度較佳。 (B~D) fTBP-Q20、fTBP-Q45、fTBP-Q61之藥物檢測 試驗。其中 lanes 1~8 為 Factor Xa 切割後的 fTBP 蛋白，分別加入剛 果紅(lane 2)、海澡糖(lane 3)、QO-17 (lane 4)、QO18- (lane 5)、DPQ-3 (lane 6)、DPQ-14 (lane 7)、KC-03 (lane 8)以 Western blot 及 1C2 抗體 呈色結果，圖中顯示藥物處理下亦無法幫助多麩醯胺蛋白摺疊。

68

圖十四、流式細胞儀分析酵母菌(erg 6 品系)表現 TBP-Qn-EGFP 融合 蛋白情形。載體(pYES2)、只含綠螢光蛋白(pYES2-EGFP)、不完整 N 端 TBP-綠螢光融合蛋白(pYES2-tTBP-Q20/Q54-EGFP)及完整 N 端 TBP- 綠螢光融合蛋白(pYES2-nTBP-Q20/Q48-EGFP)質體轉型的酵母菌，在 加入半乳糖誘導 24 小時後的綠螢光蛋白表現情形。

圖十五、流式細胞儀分析酵母菌(W303α 品系)表現 TBP-Qn-EGFP 融 合蛋白情形。載體(pYES2)、只含綠螢光蛋白(pYES2-EGFP)、不完整 N 端 TBP-綠螢光融合蛋白(pYES2-tTBP-Q20/Q54-EGFP)及完整 N 端 TBP-綠螢光融合蛋白(pYES2-nTBP-Q20/Q48-EGFP)質體轉型的酵母 菌，在加入半乳糖誘導 24 小時後的綠螢光蛋白表現情形。

70

圖十六、不同品系酵母菌表現 TBP-Qn-EGFP 融合蛋白情形統計圖。

將流式細胞儀分析圖(圖十四、十五)橫座標 FL1-H(綠螢光)訊號以 10¹ 為界線分成 M1(背景區)、M2(綠螢光訊號)兩區，計算表現綠螢光的 酵母菌的百分比(M2/M1+M2)。圖(A)、(B)分別為兩種不同品系酵母 菌誘導綠螢光表現情形。

圖十七、螢光顯微鏡觀察酵母菌表現 TBP-Qn-EGFP 融合蛋白情形。

載體(pYES2)、只含綠螢光蛋白(pYES2-EGFP)、不完整 N 端 TBP-綠 螢光融合蛋白(pYES2-tTBP-Q20/Q54-EGFP)及完整 N 端 TBP-綠螢光融 合蛋白(pYES2-nTBP-Q20/Q48-EGFP)質體轉型的酵母菌，在加入半乳 糖誘導 24 小時後的以螢光顯微鏡觀察圖。圖中顯示只含 EGFP 或是 TBP-Qn-EGFP 融合蛋白在誘導下皆有偵測到綠螢光訊號，另外以白 光觀察結果顯示並非每個酵母菌皆表現綠螢光蛋白，顯示誘導情況並 不甚理想。

72

圖十八、erg 6 品系 TBP-Qn-EGFP 融合蛋白對酵母菌生長情形的影 響。酵母菌經半乳糖誘導不同時間(20、42 hr)下，表現 EGFP 或 TBP-Qn-EGFP 融合蛋白後的生長情形。圖中標示 1 X≒2 × 10⁶ cells/

ml。

圖十九、W303 α品系 TBP-Qn-EGFP 融合蛋白對酵母菌生長情形的影 響。酵母菌經半乳糖誘導 48 小時後，表現 EGFP 或 TBP-Qn-EGFP 融合蛋白後的生長情形。圖中標示 1 X 2 × 10≒ ⁶ cells/ ml。

74

表一、SCA17 TBP 基因 CAG 三核苷重複各對偶基因的頻率分佈

CAG Controls Ataxia Dementia PD Tremor Others

No. No. % No. % No. % No. % No. % No. %

28 0 0.0 0 0.0 0 0.0 1 0.5 0 0.0 1 1.7

29 1 0.3 0 0.0 0 0.0 0 0.0 0 0.0 0 0.0

30 1 0.3 0 0.0 0 0.0 0 0.0 0 0.0 0 0.0

32 5 1.3 0 0.0 4 1.6 2 1.0 1 0.5 0 0.0

33 6 1.5 1 3.8 3 1.2 5 2.4 1 0.5 1 1.7

34 4 1.0 0 0.0 0 0.0 0 0.0 0 0.0 0 0.0

35 15 3.8 0 0.0 10 4.1 7 3.4 6 3.0 0 0.0

36 214 54.3 15 57.7 137 56.1 98 47.6 105 52.0 35 60.3

37 101 25.6 4 15.4 62 25.4 50 24.3 54 26.7 16 27.6

38 33 8.4 4 15.4 15 6.1 28 13.6 21 10.4 3 5.2

39 9 2.3 2 7.7 6 2.5 7 3.4 4 2.0 0 0.0

40 4 1.0 0 0.0 6 2.5 3 1.5 5 2.5 1 1.7

41 1 0.3 0 0.0 0 0.0 2 1.0 2 1.0 0 0.0

42 0 0.0 0 0.0 0 0.0 1 0.5 3 1.5 1 1.7

43 0 0.0 0 0.0 1 0.4 2 1.0 0 0.0 0 0.0

Total 394 26 244 206 202 58

Mean 36.4 36.6 36.4 36.6 36.7 36.4

Std 1.2 1.2 1.2 1.6 1.3 1.6