國立中興大學物理系 生物物理實驗 95 學年度
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實驗十 質體 DNA 檢定-限制脢切割與接合反應
實驗目的
利用限制酶切割或皆合質體DNA，接上欲表現蛋白 DNA 序列，或依切 割後長度檢定質體DNA 是否正確。
實驗原理
將原本沒有欲表現蛋白序列的質體，經限制脢切割後，再以T4 ligase 接上 欲表現之蛋白序列，並以電泳分離出所需質體DNA。此處為了練習方便，將 pGFPuv 其中一段序列切下後再重新接。而若是要轉移至其它載體，則要考慮 並選擇適當的切位基，避免潛在的問題，如錯位讀取(frame shift)產生錯誤的蛋 白而導致實驗失敗。
實驗步驟
A. 儀器用具
高速離心機 Pipette 電泳槽
電泳膠照像器(UV 照射平台，數位像機) 手術刀
水浴槽
B. 藥品試劑
Qiagene gel extraction Kit (QIAquick Gel Extraction Kit) 電泳膠片
0.5X TAE buffer
EtBr stock solution(5mg/ml)
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1.5ml 微量離心管 Isoprophanol 100%
3M sodium acetate
Endonuclease: SacI， KpnI T4 ligase (include ligase buffer)
C. 方法步驟
1. 取出含有欲分離片段之 DNA 溶液，跑電泳後以上個實驗步驟(回收電泳膠)分離 出所需要長度之DNA。
2. [選擇性步驟]將分離出之 DNA 溶液用以下方式以 SacI 與 KpnI 切割：
a. 用以下方式加入各液至管壁上，以 SacI 進行第一步切割:
set 1 2 3 4
sample 10ul 10ul 10ul 10ul
10XL 2 2 2 2
SacI 0 1 1 0
ddH2O 8 7 7 8
b.將以上溶液以離心混合，然後以 37℃，水浴一小時。
c.用以下方式加入各液至管壁上，以 KpnI 進行第二步切割:
set 1 2 3 4
KpnI 0 0 1 1
d.將以上溶液以離心混合，然後以 37℃，水浴一小時。
e.加入 2ul 10X loading buffer，以 65℃水浴 5min。
f.電泳確認結果。若目的長度的 DNA 片段有出現，在此處為~800bp，則進行下 一步驟。
3. 大量切割 DNA:
a.用以下方式加入各液至管壁上，以 SacI 及 KpnI 進行切割:
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含所需序列之
plasmid 目的plasmid
set 1 2
sample 50 50
10XL 6 6
SacI 2 2
KpnI 2 2
µl
b.將以上溶液以離心混合，然後以 37℃，水浴一小時。
c.加入 6ul 10X loading buffer，離心後以 65℃水浴 5min。
4. 將上步結果溶液跑電泳取回:
set.1: ~738+34bp 之 DNA 片段 set.2: ~5.4kbp 之 DNA 片段
5. 將處理完之 set.1， set.2 DNA 片段溶液以以下方式加至離心管壁上後離心混合:
sample: set.1(insert) 20 sample: set.2(target) 10 T4 DNA ligase reaction buffer 4
T4 DNA ligase 1
ddH2O 5
µl
6. 16℃水浴 1hr。結束後若不立即使用，儲存於 4℃或-20℃冰箱。
