行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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※戴奧辛暴露之生物指標的偵測方法評估與應用之研究(1)※
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計畫類別：□個別型計畫
□整合型計畫
計畫編號：
NSC 89-2621-Z-006-014
執行期間：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
計畫主持人：
王應然
共同主持人：
何元順
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□ 出 席 國 際 學 術 會 議 心 得 報 告 及 發 表 之 論 文 各 一 份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：
國立成功大學醫學院環境醫學研究所暨工業衛生科中
華
民
國
90
年
10
月
29
日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
戴奧辛暴露之生物指標的偵測方法評估與應用之研究(1)
計畫編號：NSC 89-2621-Z-006-014 執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日 主持人：王應然 國立成功大學醫學院環境醫學研究所暨工業衛生科 一、中文摘要 近四十年來，有許多環境污染物質如 農藥或工業化學產物均已被證實對野生動 物 及 人 類 具 有 類 似 荷 爾 蒙 的 效 應 （hormone-like effect）。由流行病學的研 究顯示暴露於此類化學環境污染物會增加 許多人類腫瘤的罹患率如：淋巴瘤、白血 病、肝癌及乳瘤。戴奧辛(dioxins)為一系列 具有高度毒性及廣泛分布的環境污染物， 對人類的健康被認為已構成顯著的危害。 絕大多數的戴奧辛類化合物在環境中都很 穩定，不易被環境或生物因子降解，且一 旦形成便會流佈到空氣、土壤及水等介質 中。雖然目前環境中 dioxins 的濃度尚低， 但因其親脂性及穩定性而有生物蓄積作 用，會在人類的主要食物中蓄積。由許多 動物實驗的結果得知，戴奧辛可導致大白 鼠的肝癌，小白鼠的畸胎和免疫毒性及生 殖發育等影響。除了這些明顯的毒性效應 外，戴奧辛亦會產生分子及生化層面的改 變，此包含許多與代謝有關的酵素濃度上 升。 本計畫嘗試先以實驗動物模式評估比 較戴奧辛暴露之毒性效應指標的靈敏度及 適用性，期能篩選出有效之分析方法，應 用於各種不同環境暴露族群之評估。一、 腫瘤壞死因子（TNF-α）之分析：戴奧辛 會促使實驗動物釋放出 TNF-α，此物質會 活化及致敏感吞噬細胞而釋出自由基，因 此由 TCDD 引起的氧化壓力中 TNF-α亦參 與 其 中 且 扮 演 推 手 的 角 色 。 二 、 8-Epi-PGF-2α之分析：TCDD 毒性的分子機 制中，可能有一個路徑是透過自由基(free radical)的產生而來，且所有的哺乳動物均 通用。8-epi-PGF-2α 為具有生物活性且是 一種自體有效物質(autacoid)。在許多與氧 化 壓 力 有 關 的 症 狀 中 均 被 發 現 其 8-epi-PGF-2α 的 含 量 上 升 ， 因 此 8-epi-PGF-2α 的量測可做為體內自由基產 生所導致脂質過氧化的一種有效指標。 本 研 究 使 用 兩 階 段 促 癌 實 驗 比 較 TCDD 與傳統促癌劑（TPA）的促癌能力， 並收集血清監測 TNF-α濃度變化，評估作 為 TCDD 的毒性效應指標之可行性；另外 再 以 灌 食 的 動 物 實 驗 模 式 監 測 尿 液 中 PGF-2α濃度變化。結果顯示 TCDD 不具有 對皮膚促癌的能力，此外當實驗動物受到 TCDD 刺激後，體內 TNF-α的濃度有顯著 上升的情形，但是就長時間的趨勢來看， 它並無法反映出累積的 TCDD 毒性傷害， 所以不適合作為 TCDD 的毒性效應指標。 而 8-epi-PGF-2α不論在短時間或長時間的 變化皆有相當靈敏的表現，因此它可以作 為 TCDD 的毒性效應指標。 關鍵字：戴奧辛， 毒性效應指標， 腫瘤壞 死因子，自由基 Abstr actFor the last 40 years, substantial evidence has surfaced on the hormone-like effects of environmental chemicals such as pesticides and industrial chemicals in wildlife and humans. Epidemiological evidence suggests that the increased incidence of a variety of human cancers, such as lymphoma, leukemia and liver and breast cancers, might be attributed to exposure to these agents. Dioxins are a class of highly toxic and broadly dispersed environmental
contaminants that may pose significant risk to human health. Most dioxins are resistant to environmental and biological degradation and once formed, disperse throughout the atmosphere, soil, and water. Although environmental concentrations of dioxins are
generally low, they bioaccumulate in human food stuffs because of their lipophilicity and stability. TCDD is a member of the class of dioxins and produces biological effects in experimental animals include cancer, teratogenicity and immunotoxicity and reproductive/developmental effects. TCDD also produces changes at the molecular and biochemical levels.
Experimental animal model will be conducted in this project to evaluate the response biomarkers exposed to dioxins. These include (1) Analysis of TNF-α production ： TNF-α may sensitize and activate phagocytic cells to agents that induce them to release free radicals, it may act as an amplifing loop in TCDD-induced oxidative stress. (2) Quantitative analysis of 8-epi-PGF-2α ： One of the molecular mechanisms underlying TCDD toxicity might be common to all mammalia and is thought through the generation of free radicals. Specific analysis of 8-epi-PGF-2α may afford an opportunity to evaluate the status of excessive lipid peroxidation in vivo. We used two kind of animal model experiments in this study. First, in two-stage carcinogenesis experiment, we compared the promoting activity of TCDD to TPA, a well-known promoter. Then, collected the serum of mice to investigate the trend of TNF-α concentration to see whether TNF-α is a suitable toxic responsive marker or not. In addition, gastric intubation experiment was conducted in rats to analyze the urinary 8-epi-PGF-2α induced by TCDD. In this study, TCDD performed no promoting activity in the two-stage mice skin model when compared with TPA, and we also found that the serum concentration of TNF-α did not increase when the mice accumulatively exposed to TCDD. Therefore, TNF-α is not suitable to be an effective marker. 8-epi-PGF-2α concentration in the urine of rat performed highly sensitivity after TCDD exposure. So it`s may be a good effective marker.
Keyword: Dioxins, tox ic response marker, tumor necrosis factor, free radical 二、緣由與目的 TCDD 經證實其毒性強烈，由許多動 物實驗的結果得知，戴奧辛可導致大白鼠 的肝癌，小白鼠的畸胎和免疫毒性及生殖 發育等影響。除了這些明顯的毒性效應 外，戴奧辛亦會產生分子及生化層面的改 變，此包含許多與代謝有關的酵素濃度上 升，其中研究最多的當為誘發細胞色素 P450（CYP1A1）的表現。而戴奧辛的許多 毒性效應（生長因子及荷爾蒙的改變，細 胞生長分化的改變）及細胞色素的誘發被 認為均起始於戴奧辛與細胞內的特殊受體 蛋白的結合反應（aryl hydrocarbon receptor, AhR）。此外，戴奧辛亦被證實為強力的 促癌劑（potent promoter），可促進由二乙 基亞硝胺（diethylnitrosamine）引起的致癌 效能，亦能使肝細胞增生（proliferation） 及產生肝毒性。一般而言，生物指標為以 實驗室內量測為主的研究，目標在提高靈 敏度（sensitivity）及特異性（specificity） 或 研 究 的 能 力 ， 以 建 立 暴 露 與 結 果 （exposure and outcome）間的相關性；亦 可提供參與在暴露、反應及易感性等機制 的有效訊息。有用的效應指標於公共衛生 方面助益甚大，尤其是一些潛伏期長（癌 症）或醫療及社會成本高昂（阿滋海默症） 的疾病。脂質過氧化作用是細胞膜、脂蛋 白或含有脂質的結構受到氧化性傷害時的 典型反應。含有花生油酸的磷脂質會經由 自由基的非酵素催化作用而產生前列腺 素。花生油酸的氧化作用形成一系列雙環 內過氧中間產物，其被還原成 PGF2 類物 質。此類物質在循環系統、尿液中的含量， 已被證實在氧化性壓力的動物模式及某些 人類致病過程中可被形成，此包含血管灌 流（vasular reperfusion），paracetamol 引起 的毒性及肝硬化過程，甚至抽煙及喝酒後 的健康個體身上。在 F2-isoprostane 異構物 中 最 主 要 的 稱 為 8-epi-PGF2 ， 8-epi-PGF-2α 為具有生物活性（biological
activity ） 且 是 一 種 自 體 有 效 物 質 （autacoid）。因此它被建議作為氧化性傷 害的指標。 戴奧辛在實驗動物的致癌及促癌作用 已被證實。流行病學的研究亦曾指出戴奧 辛的暴露與男性及女性的肝癌有正相關。 實驗動物模式中發現雌老鼠對戴奧辛引發 的 肝 癌 作 用 較 雄 老 鼠 敏 感 ， 而 雌 鼠 在 dioxins 的暴露下亦同時產生氧化壓力反應 （oxidative stress response），此可由脂質 過氧化（lipid peroxidation）現象，腹腔巨 噬細胞活化及肝臟內抗氧化物質含量下降 而得到證實。而根據新近的研究指出小白 鼠在戴奧辛的暴露下亦有持續性的氧化壓 力產生。以氧化壓力反應而言，對於戴奧 辛的暴露以雌老鼠的敏感度較高而人類及 小白鼠較低，既然小白鼠都可觀察到氧化 性壓力的反應，因此作者推論 dioxins 毒性 的分子機制中，可能有一個路徑是透過自 由基的產生而來，且所有的哺乳動物均通 用。此自由基的來源被推論與體內 CYP1A1 的活化有關；透過細胞色素 P450 複合物的 自體氧化還原作用（autoxidation）會產生 副產物（by-product）超氧自由基（superoxide anion）並進一步產生氫氧自由基（hydroxyl radical）而傷害細胞內的巨分子。為何雌老 鼠較雄老鼠敏感？是否為雌性激素與戴奧 辛交互作用的結果在科學上並無定論。 過量自由基的產生所引起的組織損 傷被認為與許多種類的疾病均有關。直接 量測人體內自由基含量在技術層面上有很 大的障礙，因此一個適當的指標對研究的 進行可提供很大的助益。在許多與氧化壓 力有關的症狀中均被發現其 8-epi-PGF-2α 的含量上升，因此 8-epi-PGF-2α 的量測可 做為體內自由基產生所導致脂質過氧化的 一種有效指標。 三、結果與討論 TCDD 已於 1997 年被 IARC 列為一級 的致癌物，根據文獻的記載，此物質之毒 性作用會促使 TNF-α的釋放，而 TNF-α在 生理上扮演著重要的角色，特別是與癌症 的發生有著密切的關係，因此本研究欲探 討以 TNF-α作為 TCDD 毒性作用的效應指 標，於是採用一個兩階段促癌的模式進行 研究，觀察在暴露不同濃度之 TCDD 下小 白鼠體內的 TNF-α變化情形，來評估是否 能夠作為 TCDD 毒性的效應指標。本研究 參考前人的研究後將每次暴露 TCDD 的濃 度調整為 0.0025、0.025、0.125 g，以期 能夠有效引發腫瘤增生，然而，在二十週 的實驗結束後發現，當 TPA 組的小白鼠已 經全部成功被誘發出腫瘤增生時，暴露 TCDD 的小白鼠仍然不能誘發出腫瘤，此 一結果可能表示 TCDD 不具有對皮膚促癌 的能力，又或者是因為 TCDD 的親脂性很 強，一旦塗抹於皮膚上便立刻被吸收入體 內，因而無法在表皮上停留以達到促進皮 膚癌化的作用。不過這些塗抹 TCDD 的小 白鼠，其表皮下層皆無脂肪存在，同時經 由切片觀察其表皮細胞與角質層有隨劑量 增高而減低的現象。 為探討暴露 TCDD 的系統性指標，便 收集了小白鼠的血清並測量其中 TNF-α的 濃度，結果發現在持續暴露 TCDD 的時 候，TNF-α的濃度從第一週開始就持續上 升，至第四週達到一個頂點後便開始下 降，推測是誘發出的 TNF-α在小白鼠體內 達成平衡所致，而且 TCDD 促進 TNF-α分 泌的機制是有劑量-效應關係的。根據過去 的研究顯示，當食入 TCDD 之後的第一天 就會使肝臟細胞大量分泌 TNF-α，如果之 後沒有持續暴露 TCDD，則 TNF-α的濃度 就會逐漸下降。因此本研究從第一週到了 第八週 TNF-α的濃度依舊超過對照組的濃 度 ， 推 測 應 該 是 由 於 持 續 不 斷 地 受 到 TCDD 刺激的緣故，至於第二十週時，只 有暴露最高劑量（0.125 µg）的小白鼠體內 之 TNF-α大量增加，推測是因為長期暴露 高劑量的 TCDD，以致在體內引起腫瘤細 胞的增生，所以才使其濃度突然大量增加 兩倍。 當身體受到來自外界的氧化性攻擊 時，會使身體產生一連串的反應，其中氧 化性壓力佔有相當重要的地位。氧化性壓 力對人體的脂質、蛋白質、DNA 造成傷害，
導致癌症、動脈粥狀硬化、風濕關節炎、 腸炎、免疫系統衰老、腦部機能障礙、白 內障等疾病。外來自由基會將脂質上的氫 原子予以抽離，使得脂質本身結構不穩 定，當有脂質過氧化現象時，身體就容易 產生 8-epi-PGF-α，此物質本身為強力血管 收縮素，也是有絲分裂原（mitogen），在 數種細胞中都可找到，其中血管平滑肌細 胞也包含在內，當受到自由基攻擊時，花 生油酸上的 bis-allylic 氫原子將被抽離形成 三種 arachidonoyl radicals，隨後與氧作用的 攻擊，則產生 PGG 類的複合物，然後經還 原作用後，而形成 PGF 類複合物，其中 F-type 的前列線素稱之為 PGF2-α，其與環 氧 素 cyclooxygenase）的生成作用機制 （ 是無關的。。 TCDD 灌食大白鼠的實驗發現，若是 只灌食玉米油，並不能引起 PGF2-α濃度的 上升，表示玉米油並不會產生氧化性傷 害，干擾本實驗結果，即本研究過程中 PGF2-α濃度的上升、下降，皆是由於 TCDD 所致。開始灌食 TCDD 後，在灌食第五次 後 PGF2-α濃度才明顯大量的增加，推測是 因為大白鼠體內原本就有對抗自由基的機 制，所以剛開始灌入 TCDD 所產生的自由 基並無法直接作用，PGF2-α的濃度才沒有 上升，直到超出了體內可以負荷的程度 時，PGF2-α的濃度才瞬間大幅增加。停止 灌食後 PGF2-α的濃度便漸漸地降低，逐漸 恢復正常。由此可知，TCDD 產生毒性的 機轉的確有一部份是來自於自由基，而測 量 PGF2-α的確可以代表 TCDD 透過自由 基產生毒性作用的程度。 本研究嘗試以 TNF-α作為 TCDD 毒性傷害 與致癌的效應指標之可行性，就長期的趨 勢來看，不論是高、中、低劑量組，TNF-α 被誘發出來的量到一固定程度時就停止上 升，而達到一平衡狀態，無法反應 TCDD 累積性的傷害，因此以 TNF-α當作 TCDD 的毒性效應指標是不合適的。本研究亦嘗 試以尿液中的 PGF2-α作為身體受到氧化 性傷害的系統性指標， PGF2-α在尿液中的 含量，在大白鼠長期暴露 TCDD 時顯著地 上升，且在停止暴露後，並不會立刻回復 到正常的濃度，而是以緩慢的速度降低， 此乃 TCDD 在體內不易被代謝之現象，故 PGF2-α應較適合作為 TCDD 毒性作用的效 應指標。 四、計畫成果自評 1.本研究計畫希望能比較各種戴奧辛暴露 之毒性效應指標的靈敏度及適用性，期能 篩選出有效之分析方法，應用於各種不同 環境暴露族群之評估。由研究成果來看應 已達成大部份原計畫之預期目標。 2.戴奧辛的毒性及致癌性在小白鼠的實驗 中甚為明確，但其致癌的作用機轉及傷害 指標的研究卻甚少。研究內容已整理成可 供學術期刊發表之格式。另有部分內容已 投稿至 Environmental Health Perspective.
五、參考文獻
1. Beutler, B A: The role of tumor necrosis factor in health and disease. J . Rheumatol 26(57):16-21, 1999
2. Delanty, N., Reilly, M., Fitzgerald, D J ., J . Lawson, J A., and Fitzgerald, G A., 8-Epi PGF2 alpha: specific analysis of an isoeicosanoid as an index of ox idant stress in vivo, Br. J. Clin. Pharmacol., 42(1):15-9 (1996) 3. Fan F. Yan B. Wood G. Viluksela
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