豬胸膜肺炎放線桿菌
OmlA 蛋白之抗原決定位分析
王炳傑、蔣仲豪、楊文仁＊ 國立高雄大學生物科技研究所 m0946407@mail.nuk.edu.tw (王炳傑) 猪胸膜肺炎放線桿菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae) 為革蘭氏陰性菌，感染豬隻 後引起出血性、纖維性、壞死性胸膜肺炎，造成養猪業嚴重損失。其致病因子包括莢膜多 醣、脂多醣、外膜蛋白與外毒素等。1993年 Gerlach 等人指出，OmlA (outer membrane lipoprotein A) 蛋白位於猪胸膜肺炎放線桿菌之外膜，且OmlA蛋白質序列在不同的血清 型間有高度之同源性，實驗發現以OmlA免疫之猪隻再以豬胸膜肺炎放線桿菌攻毒時有 84%存活率，而對照組全數死亡。由此可知，OmlA蛋白具有開發為次單位疫苗的潛力。 本實驗主要目的是針對此蛋白的抗原決定位做進一步分析，以更清楚了解OmlA蛋白的 免疫學特性，做為研發疫苗的基礎。本實驗已將omlA基因選殖入pcDNA3.1表現載體，轉形入 E. coli Top10中進行
OmlA蛋白之表達，並經由DNA定序分析確認基因之序列。與NCBI基因資料庫omlA基因 (Accession No. AB007572)序列比對結果，發現基因序列完全ㄧ致。將構築完成之OmlA-pcDNA3.1表現載體，利用exonuclease III之特性，將omlA基因截切成不同大小的片段後， 再以S1 Nuclease移除單股DNA，以T4 連接酶接合，形成各式omlA基因截切之質體，經 由基因定序確認截切的正確位置，並推算截短之蛋白質大小。本實驗已完成數個截切在 不同位置之OmlA蛋白的菌株，並以OmlA蛋白的多株抗體進行西方點墨法檢測，初步 發現OmlA蛋白之抗原決定位可能位在第144~366 胺基酸間。另一方面，經由Parker等人 的方法分析其親水性區域，發現約在第 25、60、120、209 胺基酸附近具有較高的親水性， 亦即可能為抗原決定位之位置。 為了更進一步分析OmlA的重要抗原決定位，本實驗藉由pcDNA3.1表現載體上之 6xHis tag來純化OmlA蛋白，以50ng OmlA融合蛋白分別混合弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)與弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)免疫小鼠，最後一劑 施打50ng OmlA融合蛋白，並以酵素連結免疫分析法確認其抗體效價，犧牲小鼠取其脾 臟細胞與生長良好之骨髓瘤細胞(NS-1)形成融合瘤以製備單株抗體，目前正在進行篩選 測試中。
