SlMYB94轉殖基因對番茄花器長度的影響評估

國立臺灣大學生物資源暨農學院農藝學系 碩士論文

Department of Agronomy

College of Bioresources and Agriculture National Taiwan University

Master Thesis

SlMYB94 轉殖基因對番茄花器長度的影響評估 Assessing Effect of the Transgenic SlMYB94 Allele

on Floral Organ Length in Tomato

陳品堯 Pin-Yao Chen

指導教授：陳凱儀 博士 Advisor: Kai-Yi Chen, Ph.D.

中華民國 106 年 9 月

September, 2017

誌謝

時光飛逝，兩年的碩士生涯一眨眼就過了。回想兩年前的我，剛踏入實驗室，

笨手笨腳地抽取番茄葉片 DNA，然後失敗；跑電泳跑了一小時照膠後，才發現沒

開電泳槽電源；在實驗的過程中不斷嘗試錯誤，一直到今天，能夠在這裡展現成果。

感謝陳凱儀老師從大學專討開始一直到現在的指導，告訴我進行科學研究應該有 的態度，雖然實驗的過程並不是一帆風順，但老師總會和我一起討論、思考解決問 題的辦法，替我出謀劃策，然後我再帶著成功的實驗結果回來和老師分享喜悅。感 謝董致韡老師，對我的實驗方法、架構疏漏之處提出改進方案；感謝蔡育彰老師，

提醒我轉殖構築應該註明的事項；感謝蔡欣甫老師，對於統計方法、資料表現格式 給予的建議。感謝林亞平學姊，在我對未來的研究計畫感到迷茫的時候，能夠給我 方向，親自帶我做實驗，不厭其煩的回答我的問題，使我確立了研究計畫。感謝台 南場的王聖善學長，在忙於自己的研究之餘，還撥空幫我檢討實驗的缺失，並親自 帶我做實驗，並給我許多寶貴的實驗經驗、建議。感謝番茄育種領域研究的前輩們，

有你們的努力不懈，我才能站在巨人的肩上觀覽科學世界。

感謝實驗室的大家，竹茵學姊和祐雅學姊雖然在我進實驗室不久之後，就離開 實驗室，但對於當時實驗還不熟悉的我來說，兩位學姊就像救火隊一般，能在我出 錯之前即時發現，並給我建議。感謝易整學長、兆平學長、瑋倫學姊還有依臻同學，

在這兩年的時間內，易整學長總是在我最需要的時候伸出援手，許多體力活學長都 義不容辭地一手接下；兆平學長在統計和程式語言上替我解答；瑋倫學姊分享許多 選修課程和考試的經驗；依臻同學在我的實驗還有論文寫作上都給了許多的幫助。

和你們一起度過的時間，一起創造的回憶，我永遠不會忘記！感謝昱富學弟、繼勤 學弟，在我因為陪伴家人住院無法來照顧材料的時候，默默地扛起責任，幫我照顧 實驗材料，當我焦急地從醫院趕到人候室的時候，發現盆栽的土還很濕潤！

感謝我所種下的番茄們，當你們挺過病魔、撐過銀葉粉蝨、經過農藥洗禮，重 新開花結果，我的眼淚都快掉下來了。

感謝我的父母，沒有你們，我的人生無法爬到如此的高度、看到這樣的風景。

陳品堯 謹識於 國立台灣大學 農藝系 中華民國一零七年九月二十二日

中文摘要

番茄的 se2.1 數量性狀基因座為複合式數量性狀基因座，包含 style2.1、

stamen2.1、stamen2.2、stamen2.3、以及 dehiscence2.1，其中的 stamen2.2 的候選基 因定位在番茄第二對染色體上 cLED19A24 至 CT9 分子標記區間內。本研究選擇 位於此染色體區間內的 SlMYB94 基因為 stamen2.2 的候選基因，並藉由基因轉殖 的方式，觀察 SlMYB94 對偶基因數目的增加，是否造成番茄雄蕊與雌蕊長度的改 變。轉殖植株的初步篩選是採用 CaMV 35S 分子標記和番茄背景分子標記對轉殖 T

世 代 植 株 進 行 篩 選 ， T

自 交 世 代 個 別 植 株 的 基 因 型 則 藉 由 焦 磷 酸 定 序 (pyrosequencing) 所偵測轉殖對偶基因型與背景對偶基因型之單核苷多型性的比 例推算而得。試驗結果顯示T

世代轉殖株「中研院 2-9」成功轉殖單一 SlMYB94 對 偶基因，然而在其自交世代 16TS357 族群中，帶有不同數目轉殖對偶基因植株之 間的雄蕊與雌蕊長度並沒有顯著的差異。由此結果推論 SlMYB94 並非 stamen2.2 基 因。

關鍵字：番茄、se2.1、stamen2.2、MYB、焦磷酸定序、雄蕊長

ABSTRACT

The tomato se2.1 is a composite quantitative trait locus, including style2.1, stamen2.1, stamen2.2, stamen2.3, and dehiscence2.1. The stamen2.2 was delimited between molecular markers cLED19A24 and CT9 on the chromosome 2. In the current study, the SlMYB94 gene is one of genes residing in the aforementioned chromosomal region and was chosen as the candidate gene of stamen2.2. The correlation between the SlMYB94 copy number and the changes of stamen and style length were observed via the gene transformation approach. CaMV 35S marker and genetic background marker were used to identify successful transgenic plants in the T

generation. In the T

generation, pyrosequencing was used to detect the proportion of single nucleotide polymorphism between the transformed allele and the background allele, and hence to infer genotypes of T

plants. The results showed that the “sinica2-9” T

plant successfully received a single copy of the SlMYB94 transgenic allele but its T

progenies, the 16TS357 population, did not show significant difference on style length and stamen length between individuals carrying different copy number of the SlMYB94 transgenic alleles. This conclusion infers that the SlMYB94 gene is not stamen2.2.

Key words: tomato, se2.1, stamen2.2, MYB, pyrosequencing, stamen length

目錄

口試委員會審定書 ... #

誌謝 ... i

中文摘要 ... ii

ABSTRACT ... iii

目錄 ... iv

圖目錄 ... vi

表目錄 ... vii

第一章 前言... 1

第一節 Style 2.1 與 Stamen 2.2 的候選基因 MYB94 ... 1

第二節 影響番茄花器長度的基因及轉錄因子 MYB... 3

第二章 研究目的... 4

第三章 材料與方法 ... 5

第一節 試驗材料... 5

第二節 抽取番茄基因體 DNA ... 8

第三節 DNA 純化 ... 10

第四節 清洗種子及乾燥保存... 11

第五節 初步確認轉殖是否成功及轉殖背景的分子標記... 11

第六節 焦磷酸定序(pyrosequencing) ... 14

第七節 雌蕊及雄蕊長度調查... 16

第八節 統計分析... 16

第四章 結果... 18

第一節 轉殖世代𝐓𝟎之轉殖與背景檢測及自交後代𝐓𝟏... 18

第二節 轉殖自交後代𝐓𝟏花器長度之測量... 25

第三節 焦磷酸定序結果... 27

第四節 基因型分析... 32

第五章 討論... 38

第一節 35S 分子標記與焦磷酸定序結果不完全相同 ... 38

第二節 SlMYB94 基因可能並非期望的 stamen2.2 基因 ... 39

引用文獻

附錄

附件 1. ... 42

附件 2. ... 45

附件 3. ... 48

附件 4. ... 49

附件 5. ... 54

附件 6. ... 61

附件 7. ... 62

附件 8. ... 64

圖目錄

圖一、35S 分子標記在T0世代 GENOMIC DNA 擴增結果 ... 20

圖一(續)、35S 分子標記在T0世代 G^ENOMIC DNA 擴增結果 ... 21

圖二、番茄背景分子標記在T0世代 GENOMIC DNA 擴增結果 ... 23

圖二(續)、番茄背景分子標記在T0世代 GENOMIC DNA 擴增結果 ... 24

表目錄

表一、分子標記CLED19A24 至 CT9 間 20 個候選基因 ... 2

表二、四種轉殖構築 ... 7

表三、35S 分子標記及番茄背景 INDEL分子標記 ... 13

表四、焦磷酸定序使用的引子 ... 15

表五、T0世代之自交後代T1世代重新編號、命名 ... 26

表六、焦磷酸定序T0世代與 M82、TA3178 ... 28

表七、16TS357 的焦磷酸定序結果 ... 30

表八、16TS357 基因型分群與外表型測量結果整理 ... 33

表九、16TS357 卡方適合性檢定表(1：2：1) ... 36

表十、16TS357 基因型分群外表型變異結果 ... 37

第一章 前言

第一節 Style 2.1 與 Stamen 2.2 的候選基因 MYB94

在本實驗室先前的研究中(Chen and Tanksley, 2004)，發現番茄的 se2.1 數量性

狀基因座包含了 style2.1 控制雌蕊長度；stamen2.1、stamen2.2、及 stamen2.3 控制

雄蕊長度； dehiscence2.1 控制雄蕊頂端的鬆弛與彎曲，這些控制相似性狀的基因座

落在相鄰的位置。在本實驗室 100-103 年國科會補助計畫中，成功將 se2.1 QTL 中

控制雄蕊長短性狀的基因 stamen2.2 鎖定在番茄第二條染色體上 cLED19A24 至

CT9 分 子 標 誌 區 間 內 ， 該 區 間 含 有 20 個 候 選 基 因 ( 詳 見 表 一 ) 。 其 中

Solyc02g087960.3.1 這 個 基 因 被 選 為 進 行 轉 殖 試 驗 的 候 選 基 因 。 與 番 茄 的

Solyc02g087960.3.1 基因同源的 MYB94 基因在阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)上是

一 個 正 向 調 控 表 面 蠟 質 的 基 因 (Lee et al., 2015) ， 因 為 同 源 的 關 係 ， 番 茄 的

Solyc02g087960.3.1 在前人的研究中又被稱為 SlMYB94 (Zhao et al., 2014)。這個基

因在茄科的氨基酸序列比較中，被分類在 S1、對於環境反應(environmental responses)

相關的基因群當中(Gate et al., 2016)。由於 MYB 基因家族是轉錄因子，該基因

SlMYB94 有可能是藉由轉錄來調控雄蕊長度的基因 stamen2.2，因此最終選擇了

SlMYB94 來進行後續的轉殖互補性試驗。

表一、分子標記 cLED19A24 至 CT9 間 20 個候選基因

候選基因名稱

分子標記

Solyc02g087930.3.1 60S ribosomal protein L34

cLED19A24

Solyc02g087935.1.1

Mediator of RNA polymerase II transcription subunit

Solyc02g087940.3.1 Coiled-coil domain-containing protein 115

Solyc02g087950.3.1 60S ribosomal protein L34

TBS32

Solyc02g087970.1.1 Mini zinc finger protein

Solyc02g087980.3.1 Structural maintenance of chromosomes protein 4

TAP109

Solyc02g088000.3.1 Starch synthase

Solyc02g088010.3.1 Defective in cullin neddylation protein Solyc02g088020.1.1 DNA-directed RNA polymerase subunit beta Solyc02g088030.1.1 RING/U-box superfamily protein

Solyc02g088040.1.1 Ribosomal protein L34e superfamily protein Solyc02g088050.1.1 Plasma membrane ATPase

Solyc02g088060.2.1 Plasma membrane ATPase Solyc02g088070.3.1 Dof zinc finger protein

Solyc02g088075.1.1

S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltrasferases superfamily protein

Solyc02g088080.2.1 Thioredoxin superfamily Protein Solyc02g088090.1 Calcium-binding EF-hand

Solyc02g088100.2 Expensin precursor 5

CT9

第二節 影響番茄花器長度的基因及轉錄因子 MYB

影響番茄花器長度的基因，最常見的就屬 MADS-box 的基因了，這類基因在 花朵的發育 ABC-model 上，分別在不同時期啟動、調控包括萼片、花瓣、雄蕊、

雌蕊，4 層環狀構造的發育。在這之中，尤其是 B-class 的基因更是和雄蕊的發育 息息相關，在一些例子中，過量表現 MADS-box 的基因 TM8，使得番茄雄蕊變得 分散，並且影響花粉發育，造成後代稔實率降低(Daminato et al., 2014)；B-class 基 因突變甚至會導致雄蕊消失(Quinet et al., 2014)；研究也指出，高溫造成的花柱外 突、雄蕊變短、雄蕊分散，是源自於 B-class 的基因表現量改變(Müller et al., 2016)。

然而研究結果顯示，除了 MADS-box 的基因外，其他基因也會直接或間接影響番 茄的花器長度，例如調控茉莉酸的基因也會直接或間接的影響雄蕊長度(Dobritzsch et al., 2015)；過量表現番茄 R2R3MYB 的 SlANT1 和 SlANT2 基因，會影響雄蕊以 及果實的外表型(Kiferle et al., 2015; Meng et al., 2015)；其中一份轉殖葡萄的 R2R3MYB 至番茄當中的研究，甚至使整個番茄花朵都產生了變形(Mahjoub et al., 2009)。這些轉殖 R2R3MYB 至番茄的先例，為我們的研究提供了可能性，我們所 找到的 MYB94 轉錄因子或許就是調控雄蕊長度的基因，並且轉殖基因可以作為研

究的手段。現今關於番茄的 MYB 轉錄因子的研究仍十分稀少，因此確認轉殖

SlMYB94 在番茄中能否影響雄蕊長度，相信能夠給予未來的研究者們對於研究番

茄 MYB 基因功能一些方向。

第二章 研究目的

本研究承接本實驗室 100-103 年的國科會計畫，利用基因轉殖將番茄 se2.1 數

量性狀基因座中控制雄蕊長短 stamen2.2 的候選基因 SlMYB94 轉入番茄中，從而

進行轉殖基因的互補性試驗，並欲藉由轉殖世代的自交後代𝑇

的分離比、基因型及

外表型資料的結合來驗證，轉入的 SlMYB94 候選基因是否確實為調控雄蕊長短的

stamen2.2 基因。

第三章 材料與方法

第一節 試驗材料

本研究所使用的兩親本分別為 Solanum lycopersicum cv. M82 以及 TA3178，其 中 TA3178 是 Solanum lycopersicum cv. M82 的近似同源系(NIL)，只有在 T1301 至 T497 的這兩個分子標記之間的片段(se 2.1)是由 Solanum pennellii 所滲入。而 Solanum lycopersicum 的花器外表型為花柱不外突(雌蕊長小於雄蕊長)， Solanum pennellii 的花器外表型為花柱外突(雌蕊長大於雄蕊長)。在本實驗室先前的研究當 中(Chen and Tanksley, 2004)，已經證實代表 Solanum lycopersicum 的 M82 雄蕊長度 較 Solanum pennellii 的 TA3178 為長，因此設計轉殖互補試驗，期望能在轉殖品系 雄蕊長度上觀察到變異。

1.

互補性試驗與基因轉殖

為了進行互補性試驗，我們設計了 4 組構築(constructs)，用以將 SlMYB94 利 用基因轉殖轉入兩種親本當中。包含了將 M82 的 SlMYB94 全基因轉入 TA3178、

將 M82 的 SlMYB94 基因的 cDNA 轉入 TA3178 ；以及將 TA3178 的 SlMYB94 全 基因轉入 M82、將 TA3178 的 SlMYB94 基因的 cDNA 轉入 M82。這 4 種構築當中，

將 TA3178 的 SlMYB94 基因 cDNA 轉入 M82 的構築沒有製作成功，因此只剩下 3

組構築，詳見表二、附件 1、附件 2。構築所使用的質體為 pCAMBIA2300，使用

限制酶 PstI 對 CaMV 35S 啟動子的 PCR 產物(引子兩端設計限制酶切位)及

pCAMBIA2300 進行處理，接著將兩端有 PstI 切位的 35S 啟動子以連接酶接至

pCAMBIA2300 的多重切位點(multiple cloning site)，然後用 BamHI 限制酶將 SlMYB94 基因的 PCR 產物(引子兩端有限制酶切位，由 M82 及 TA3178 的 Genomic DNA 和 cDNA 進行擴增)、以及前面已經有接入 35S 啟動子的 pCAMBIA2300 進 行處理後，將 SlMYB94 基因接到 pCAMBIA2300 中 35S 啟動子的後面。基因轉殖 使用的載體為農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。

(構築的設計、製作，由本實驗室的林亞平學姊進行；基因轉殖由本實驗室的林亞 平學姊、以及委託中央研究院植物轉殖中心[轉殖植物核心實驗室]進行轉殖，本人 僅進行轉殖株出瓶後的後續培養及試驗；編號 89C2、89M6、90M4 的轉殖株為本 實驗室的林亞平學姊進行轉殖，中研院 2、中研院 3、中研院 4 的轉殖株為中研院 進行轉殖；其中 89C2 和中研院 2 為完全相同的構築、89M6 和中研院 3 為完全相 同的構築、90M4 和中研院 4 為完全相同的構築，僅進行轉殖操作的人員不同)

轉殖株出瓶與自交

轉殖株於培養基成功再生(regeneration)出根與葉後，將植株取出，以蒸餾水清

洗後，移植至 3 吋盆中，培養介質為根基旺，至植株成長至約 4 葉齡大後，移至 8

吋盆，培養介質為泥炭土：蛭石 = 2：1。植株培養於台灣大學人工氣候室(phytotron)

中，日溫20℃ / 夜溫15℃。待轉殖世代T

開花後進行自交，然後收取果實、清洗

種子，之後再以穴盤發芽T

世代的種子，待植株約 4 葉齡，移至 8 吋盆，同樣培養

於人工氣候室。

表二、四種轉殖構築

編號 轉殖設計 使用質體

插入基因使

用的限制酶

使用的

啟動子

插入啟動子

使用的限制酶

沒有成功

TA3178 的

轉入 M82

pCAMBIA2300

CaMV

35S

89C2

中研院

M82 的

轉入 TA3178

pCAMBIA2300

CaMV

35S

89M6

中研院

M82 的

轉入 TA3178

pCAMBIA2300

CaMV

35S

90M4

中研院

TA3178 的

轉入 M82

pCAMBIA2300

CaMV

35S

第二節 抽取番茄基因體 DNA

抽取番茄 DNA 使用的是 CTAB 法，方法如下，

1.

備製萃取液

先將114mg的 sodium bisulfate 充分溶解於12.5mL的 DNA extraction buffer，

然後依序加入12.5mL的 nuclei lysis buffer 及5mL的 5% Sarkosyl solution 後充分 混合，溶液的配置在室溫下進行。

2.

採取番茄葉片樣品及葉片均質化

剪取 2~3 片番茄幼葉約 1 平方公分，置於已標示樣品編號的1.5mL微離心 管中，加入200μL的萃取液，並加入一粒直徑3mm的鋼珠，藉由高通量組織研 磨機的來回振動，將葉片打碎、均質化。從組織研磨機取出微離心管後，再加 入500μL的萃取液，與均質液混合均勻後，置入 65℃的水浴槽中等待 30 分鐘 後取出。

3.

去除葉綠素與雜質

在抽氣通風櫃中，將每個樣品加入 600μL 的氯仿混合液 (chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1)，蓋緊微離心管蓋子後，以手動方式將微離心管上下劇 烈震盪 100 次，在置入離心機中，以10000rpm離心 5 分鐘。離心結束後的微 離心管應小心取出避免震盪，而後取出500μL上層澄清液，置入新標示樣品編 號的1.5mL微離心管中。所有步驟在常溫進行。

4. DNA 沉澱與溶解

每個樣品加入600μL的異丙醇(iso-propanol)，倒轉微離心管數次充分混合

溶液，置入離心機中，以10000rpm離心 5 分鐘。離心後將溶液倒出拋棄，加

入200μL 70%酒精(ethonal)，再以10000rpm離心 5 分鐘。離心後將溶液倒出，

靜置 30~60 分鐘待酒精乾燥後加入100μL的 TE buffer，置入 4℃冰箱靜置一天 後即可使用。

DNA extraction buffer

31.885 克的 Sorbitol[Sigma S-6021]及 6.055 克的 Tris[hydroxymethyl]aminomethane, Trizma

及 0.931 克 EDTA[Ethylene]加水至接近500mL，而後以濃鹽酸調整 pH 值 至 8.26，再加水至500mL。

Nuclei lysis buffer

加入100mL 1M Tris(121.1g/L)、100mL 0.25M EDTA(sodium salt, 84.05 g/L)、200mL 5M NaCl(292.2g/L)[Sigma S-3014]、10g CTAB(Hexadecyltrimethylammonium bromide, Sigma H-9151)、100mL ddH

O，以磁石進行攪拌一天後，以濃鹽酸調整 pH 值至 7.5。

TE buffer

加入0.5mL 1M Tris(121.1g/L)、0.2mL 0.25M EDTA(sodium salt, 84.05 g/L)、49.3mL

ddH

O，配置為50mL溶液。

第三節 DNA 純化

使用AMPure

XP 的磁珠溶液進行 DNA 純化，為了去除溶液中小片段(<50 bp) 的 DNA 以及雜質，加入的 AMPure : DNA 溶液 = 1.8 : 1，

1.

將大片段

加入欲純化 DNA 溶液以及 DNA 溶液 1.8 倍體積的 AMPure 至200μL PCR tube 中，充分混合後靜置 5 分鐘，然後將 PCR tube 至於磁石盤上靜置 5 分鐘。

2.

清洗

將磁石盤上的 PCR tube 中的溶液小心吸出丟棄，然後加入200μL 70%酒精，

靜置 30 秒後將酒精吸出丟棄。此步驟重複一次，並確認酒精完全吸出。然後將 PCR tube 由磁石盤上取下，自然陰乾 5 分鐘。

3. DNA 回溶及磁珠分離

加入100μL的 Buffer EB，將管壁上的磁珠沖下並充分混合，靜置 5 分鐘後，

再移至磁石盤上靜置 5 分鐘，使磁珠與溶液分離，然後小心吸取澄清 DNA 溶液至

新的離心管中，即完成純化。

第四節 清洗種子及乾燥保存

為了進行自交後代分離比，以及自交後代外表型、基因型的整合調查，收取番 茄果實、並清洗出番茄種子是必須的。在轉殖番茄自交果實進入紅熟階段時，將果 實採下，由果實中段橫切，觀察可見果實有 2-3 心室，以刮杓將種子及果膠取出置 入燒杯中，加入 5%稀釋鹽酸至液面完全蓋過種子及果膠後，靜置 30 分鐘。以不 鏽鋼小網目篩網(1mm)過濾種子，並以大量清水清洗後，將種子以刮杓移至擦手紙

上，並於擦手紙上以標簽註記種子來源、編號，置於防潮箱內 3 天以上，待種子陰

乾後，以封口袋收納，移置4℃冰箱保存。

第五節 初步確認轉殖是否成功及轉殖背景的分子標記

在轉殖植株出瓶後，我們需要快速確認該轉殖植物是否有成功轉殖，並捨棄沒 有成功轉殖的植物。除此之外，再次確認轉殖植物背景也是必須的。

1.

確認轉殖是否成功的分子標記

為了確認轉殖是否成功，我們使用了設計構築時 PCR 擴增 CaMV 35S 啟動子 的引子，詳見表三。一旦 PCR 能夠在轉殖番茄的 genomic DNA 中擴增出，本來植 物體不存在的 CaMV 35S 片段，我們就相信這是一株有轉殖成功的植物。

2.

確認轉殖植物背景的分子標記

確認轉殖植物的背景(background)，能夠在植物還是幼苗時，就先行捨棄背景

錯誤的轉殖株。為此，我們在兩親本 M82 及 TA3178 間，利用 blast 搜尋兩親本不

同的片段(T1301 至 T497)，然後選定了位於 style2.1 基因上的 Indel 片段，設計了

一組 Indel 分子標記，詳見表三。引子的設計使用 Primer3

(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。利用 PCR 產物大小可以快速的分辨轉植株背 景是否有錯誤。

3. PCR 及電泳跑膠

PCR 使用的試劑如下，2μL番茄 genomic DNA、2μL forward 引子、2μL reverse 引子、10μL Taq DNA Polymerase Master Mix RED、4μL ddH

𝑂。PCR 程序為：94℃

3 分鐘，然後94℃ 30 秒、60℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘，此 2 分鐘步驟重複 35 次，最

後 72℃ 10 分鐘結束。電泳 agarose 為 1%，電泳溶液為 TBE 0.5X，以 100V 進行 1

小時，然後拍照確認並留存。

表三、35S 分子標記及番茄背景 Indel 分子標記

引子名稱 引子序列 引子大小 產物大小

35S-SF

CCTTTGAGCTCCCGCCTTCAGTTTAGCTTCA 31bp

580bp

31bp

番茄背景

引子名稱 引子序列 引子大小 產物大小

TMBG-F GGGCCATGTAAGTGAAGACC

20bp

TMBG-R GAAACATTTAAGGGCCACGTT

21bp 458bp 903bp

第六節 焦磷酸定序(pyrosequencing)

為了確認轉殖自交世代T

，以及轉殖世代T

的基因型，進行了焦磷酸定序 (pyrosequencing)，總共對 6 個有產生T

後代的T

進行檢查，並將 4 組有成功轉殖 SlMYB94 的T

後代，共 82 株T

世代，以及兩親本 M82、TA3178，總計 90 株進行 交磷酸定序。焦磷酸定序使用的引子詳見表四。

焦磷酸定序時，有 biotin 標記的 PCR 產物，會被 Streptavidin-Sepharose HP (Amersham Pharmacia)捕捉，而後藉由 Pyrosequencing Vacuum Prep Tool 將 PCR 產 物的另一股洗去，接著將焦磷酸定序的引子加入，該引子會 annealing 到單股的 PCR 產物上，定序使用的儀器為 PyroMark Q24 system (Qiagen)，並用 PyroMark Q24 軟 體分析定序結果。

表四中 Pyro-F 和 Pyro-R 的引子是用來做 PCR 擴增欲定序片段的一組引子，

且 Pyro-R 末端接有 biotin， Pyro-S1 則是進行焦磷酸測序時使用的引子。PCR 所 使用的試劑如下：0.1μL Accu Prime Taq DNA polymerase(High fidelity)、2.5μL PCR buffer II、0.5μL Pyro-F 引子、0.5μL Pyro-R 引子、2μL genomic DNA、20.4μL ddH

𝑂。

PCR 程序設定如下：94℃ 3 分鐘，然後94℃ 30 秒、57℃ 3 分鐘、72℃ 30 秒，

此 4 分鐘步驟重複 40 次，最後 72℃ 10 分鐘結束。PCR 產物以 AMPure XP 磁珠

純 化 DNA 方 法 純 化 後 ， 委 託 明 欣 生 物 科 技 有 限 公 司 (Mission

Biotech)(http://www.missionbio.com.tw/)進行焦磷酸定序。

表四、焦磷酸定序使用的引子

引子名稱 引子序列 引子大小 產物大小

Pyro-F

GGGCTGCCATAGCTTCATATCT 22bp

162bp

Pyro-R

BIO-ATTGCCCTCTGGAGGTTGAA 20bp

Pyro-S1

TCATTTAAAAAAGAAGCTG 19bp

第七節 雌蕊及雄蕊長度調查

為了瞭解轉殖 SlMYB94 基因對蕃茄雄蕊長度是否有影響，總計對 94 株T

世代 共 1630 朵花進行了雄蕊長度、雌蕊長度的測量。

1.

收集花朵並掃描圖片留存

在T

世代開始出現花苞後，在花苞下方繫上紅色細繩作為標記，之後每天繫紅 繩，並且對有繫紅細繩的花朵，進行當天開放的花朵採集，採集下來的花朵插在濕 海綿上、並標號，待當天開放的花朵全部採集完畢後，以鑷子照順序將花朵的萼片、

花瓣摘除，然後小心的將雄蕊環從雌蕊外圍剝下，並將同一朵花的雌蕊、雄蕊放在 掃描機(HP Scanjet G4010)上，待掃描機上排列了適量的樣品後，蓋上 5mm 方格紙 進行掃描。每株T

世代盡量採集到 20 朵花，以利統計分析。

2.

測量雌蕊及雄蕊長度

對於已掃描進入電腦儲存的照片，以 imageJ 軟體(https://imagej.nih.gov/ij/)，進 行測量。先用直線工具對掃描照片中 5mm 長度進行 set scale，然後再以直線工具 分別測量(measure)每一朵花的雄蕊及雌蕊最大直線距離，將結果輸出至 excel 進行 儲存。

第八節 統計分析

單因子變異數分析 ANOVA 以及 Tukey’s HSD 檢定使用 R 的 agricolae package。

將焦磷酸定序T

世代的結果，分為有成功轉入單一 copy 的轉殖株，以及沒有成功

轉入單一 copy 的轉殖株；有成功轉入單一 copy 的T 世代，其自交後代應該會符合

孟德爾單一基因遺傳的分離比 1：2：1，因此用卡方適合性檢定(goodness of fit test)，

檢定是否符合單一基因分離，若符合單一基因分離，則該T

世代為成功轉殖單一

copy 的轉殖株，然後依照基因型將T

世代的自交後代T

外表型分組，再次進行單

因子變異數分析，分別檢定雄蕊長度、雌蕊長度、雌雄蕊長度差，在各基因型所代

表的外表型組間是否有差異。

第四章 結果

第一節 轉殖世代𝐓

之轉殖與背景檢測及自交後代𝐓

1.

轉殖世代𝐓

與其自交後代𝐓

之種子數

轉殖構築成功的有 3 組，分別為 M82 的 SlMYB94 基因 cDNA(共 864 bp)轉入 TA3178，轉殖世代T

由本實驗室進行轉殖的名稱為 89C2、由中研院植物轉殖中心 代為轉殖的名稱為中研院 2；M82 的 SlMYB94 全基因(共 1293 bp)轉入 TA3178，

T

由本實驗室進行轉殖的名稱為 89M6、由中研院代為轉殖的名稱為中研院 3；以 及將 TA3178 的 SlMYB94 全基因(1347 bp)轉入 M82，T

由本實驗室進行轉殖的名 稱為 90M4、由中研院代為轉殖的名稱為中研院 4，詳見表二。T

世代的植株數量，

89C2 有 8 株，編號分別為 89C2-1 至 89C2-8，中研院 2 有 10 株，編號分別為中研 院 2-2、中研院 2-4 至中研院 2-6、中研院 2-8 至中研院 2-11、中研院 2-14、中研院 2-15；89M6 有 6 株，編號分別為 89M6-1 至 89M6-6，中研院 3 有 23 株，編號分 別為中研院 3-2、中研院 3-3、中研院 3-7 至中研院 3-12、中研院 3-14 至中研院 3- 28；90M4 有 19 株，編號分別為 90M4-1 至 90M4-13、90M4-15 至 90M4-20，中研 院 4 有 13 株，編號分別為中研院 4-1、中研院 4-2、中研院 4-4、中研院 4-5、中研 院 4-8 至中研院 4-12、中研院 4-15 至中研院 4-18。附件 4 含全部T

世代以及最後 收取到的自交種子(T

)的數量。

2. 35S 分子標記檢測𝐓_𝟎

世代之結果

在轉殖世代T

成長至四葉齡以後，抽取番茄基因體 DNA，使用 35S 分子標記

進行檢測，可以預先丟棄沒有轉殖成功的植株。35S 分子標記檢測結果可見 89C2

全部皆有在 genomic DNA 中擴增出 580 bp 的片段(圖一 A)；中研院 2 除了中研院

2-5、中研院 2-6、中研院 2-11 沒有擴增出片段，中研院 2-14 僅擴增出微量片段之

外，其餘皆有擴增出 35S 片段(圖一 A)；89M6 全部沒有擴增出片段(圖一 A、圖一

B)；中研院 3 除了中研院 3-23 僅擴增出微量片段之外，其餘皆有成功擴增出 35S

片段(圖一 B)；90M4 除了 90M4-4、90M4-7 有擴增出微量片段，90M4-15 至 90M4-

20 皆無擴增出片段以外，其餘皆有擴增出 35S 片段(圖一 B、圖一 C)；中研院 4 除

了中研院 4-8、中研院 4-12 之外，其餘皆有成功擴增出 35S 的片段(圖一 C、圖一

D)。35S 分子標記檢測結果詳見附件 4。

圖一、35S 分子標記在T

世代 Genomic DNA 擴增結果

圖二(續)、35S 分子標記在T

世代 Genomic DNA 擴增結果

3.

番茄背景

世代之結果

對轉殖世代進行的背景檢測，是為了在植株仍為幼苗時，快速篩檢出背景錯誤 的轉殖株並拋棄，除了可以減少試驗錯誤的風險，也可以降低維持植物生長的成本。

在T

世代轉殖株 89C2、89M6、中研院 2、中研院 3 當中，全部的植株都擴增出了

903 bp 的 PCR 產物，並與 TA3178 親本的 PCR 擴增結果相同(圖三)，這表示它們

的轉殖背景無誤。在 90M4 以及大部分中研院 4 當中，則擴增出了 458 bp 的 PCR

產物，並且與 M82 親本的 PCR 擴增結果相同，然而在中研院 4-15 卻出現了與

TA3178 親本相同的擴增結果，這表示中研院 4-15 是轉殖背景出錯的植株。

圖三、番茄背景分子標記在T

世代 Genomic DNA 擴增結果

圖四(續)、番茄背景分子標記在T

世代 Genomic DNA 擴增結果

第二節 轉殖自交後代𝐓

花器長度之測量

在收取了T

世代種子後，由附件 4 將背景錯誤的T

世代種子排除，然後再將

沒有轉殖 35S 啟動子的也排除。為了進行自交後代分離比的試驗，以及外表型的

測量，我們假設由農桿菌轉入的 SlMYB94 基因在大部分T

世代會是 1 copy，那麼 外表型若符合孟德爾單一基因分離比的話，很有可能會是3：1。於是，假設不同株 外表型有差異為獨立事件，若希望有 95%的機率能在T

世代中看到至少 1 株外表 型有差異的個體，(1 − 0.25)

≤ (1 − 0.95)，n = 10.4，意即最少需要種植 11 株T

世代，並且考慮到種子發芽率，我們挑選了種子數為 40 以上的T

世代種子，每種 構築(constructs)各挑選 3 個。最後挑選了 89C2-2、89C2-8、中研院 2-9、中研院 3- 11、中研院 3-14、中研院 3-21、90M4-2、90M4-3、90M4-6 的T

世代種子進行發芽，

每組皆播種 40 粒種子。為了方便管理T

世代，將T

世代重新以本實驗室譜系編號 命名為 16TS355 至 16TS363，詳見表五。

然而在發芽率不高，以及育苗過程中，有多數幼苗感染疾病死亡，最後剩餘的 T

世代數量 16TS355(以下簡稱 355)為 12 株，編號為 355-1 至 355-12；16TS356(以 下簡稱 356)為 20 株，編號為 356-1 至 356-20；16TS357(以下簡稱 357)為 35 株，

編號為 357-1 至 357-35；16TS358、16TS359、16TS360 因染病全數丟棄；16TS361(以

下簡稱 361)為 15 株，編號 361-1 至 361-15；16TS362(以下簡稱 362)為 7 株，編號

362-1 至 362-7；16TS363(以下簡稱 363)為 5 株，編號 363-1 至 363-5。因此我們對

剩餘總計 94 株T

世代進行了雄蕊及雌蕊長度調查，每株盡量以 20 朵花為目標測

量，花器的掃描圖標號後範例如附件 3，結果如附件 5 (單位：mm)。

表五、T

世代之自交後代T

世代重新編號、命名

𝐓

世代親本 𝐓

世代 𝐓

世代親本 𝐓

世代 𝐓

世代親本 𝐓

世代

89C2-2 16TS355 中研院 3-11 16TS358 90M4-2 16TS361

89C2-8 16TS356 中研院 3-14 16TS359 90M4-3 16TS362

中研院 2-9 16TS357 中研院 3-21 16TS360 90M4-6 16TS363

第三節 焦磷酸定序結果

為了有效率的進行基因型鑑定，我們由作為 355、356、357、361、362、363 的親本T

世代 89C2-2、89C2-8、中研院 2、90M4-2、90M4-3、90M4-6，以及未進 行轉殖的 M82、TA3178，共 8 個樣品先進行焦磷酸定序，定序結果若確實有轉殖 單一 copy，再繼續進行其自交後代T

世代的焦磷酸定序。定序時由 Pyro-S1 引子由 5 端向 3 端合成並偵測 SNP 位點，目標位點為 ARGAAGCTTGAAACA (R:A/G)，

該位點為在 SlMYB94 基因的 exons 上，對於 M82 (Solanum lycopersicum)和 TA3178 (Solanum pennellii)皆有高度專一性的片段，在 M82 中 R 位置為 G，在 TA3178 中 R 位置為 A，即偵測 R 位置上 A 和 G 的比例，可以知道樣品中所含的來自 M82 和 TA3178 的片段的比例多寡。M82 的 genomic DNA 在目標 SNP 位點為 G，因此可 以將其同源染色體所含的 SlMYB94 基因定義為 LL (lycopersicum)，而 TA3178 為 A，定義為 PP (pennellii)，那麼轉入一個 copy 的T

世代，應該為 LLP、LPP，所含 的 G 和 A 比例應該為 1/3，即 33%，但由表六的定序結果可以發現，T

世代只有 中研院 2-9 較為接近 33%，89C2-2、89C2-8 雖然不接近 33%，但仍不為 0%，90M4- 2 雖然為 6.89%，為求保險，我們決定將 89C2-2、89C2-8、中研院 2-9 以及 90M4- 2 的自交後代T

都進行焦磷酸定序。而 90M4-3 及 90M4-6 的焦磷酸定序結果顯示，

它們並沒有成功轉入來自 M82 的 SlMYB94 基因，35S 分子標記檢測結果有轉入

35S 啟動子，但可能並不包含後續的 SlMYB94 基因。

表六、焦磷酸定序T

世代與 M82、TA3178

樣品名稱 A Frequency (%) G Frequency (%) 推測基因型

M82 0 100 LL

TA3178 99.89 0.11 PP

89C2-2 88.97 11.03 LPP

89C2-8 87.77 12.23 LPP

中研院 2-9 71.76 28.24 LPP

90M4-2 6.89 93.11 LL

90M4-3 0 100 LL

90M4-6 1.63 98.37 LL

由 16TS355 的焦磷酸定序結果(附件 6)，可以觀察到除了 355-10 之外其餘皆 沒有成功轉入 M82 的 SlMYB94 基因。16TS356 的焦磷酸定序結果(附件 7)，除了 356-9 之外其餘皆沒有成功轉入 M82 的 SlMYB94 基因，而 356-9 則呈現了較自交 親本 89C2-8 更高的 M82 的 SlMYB94 基因比例。由 16TS361 的焦磷酸定序結果(附 件 8)，16TS361 皆沒有成功轉入 TA3178 的 SlMYB94 基因。

由 16TS357 的焦磷酸定序結果(表七)，可以發現 357-4、357-18、357-20、357- 23、357-27、357-34 沒有轉入 M82 的 SlMYB94 基因，而 357-11、357-13、357-15、

357-21、357-24、357-25、357-26、357-32、357-33 則呈現了較自交親本中研院 2-

9 更高的 M82 的 SlMYB94 基因比例，我們可以推測若中研院 2-9 是轉入單一 copy

的轉殖株 LPP，那麼這些含有更高轉殖基因比例的自交後代，基因型應該為 LLPP。

表七、16TS357 的焦磷酸定序結果

樣品名稱 A Frequency (%) G Frequency (%) 推測基因型

M82 1.55 98.45 LL

TA3178 99.33 0.67 PP

中研院 2-9 71.89 28.11 LPP

357-1 77.52 22.48 LPP

357-2 72.33 27.67 LPP

357-3 71.55 28.45 LPP

357-4 99.45 0.55 PP

357-5 73.27 26.73 LPP

357-6 72.39 27.61 LPP

357-7 76.47 23.53 LPP

357-8 75.17 24.83 LPP

357-9 76.85 23.15 LPP

357-10 72.29 27.71 LPP

357-11 60.35 39.65 LLPP

357-12 74.73 25.27 LPP

357-13 60.34 39.66 LLPP

357-14 75.02 24.98 LPP

357-15 60.61 39.39 LLPP

357-16 71.26 28.74 LPP

357-17 72.9 27.1 LPP

357-18 100 0 PP

357-19 73.13 26.87 LPP

357-20 100 0 PP

357-21 59.13 40.87 LLPP

357-22 71.09 28.91 LPP

357-23 100 0 PP

357-24 59.66 40.34 LLPP

357-25 62.95 37.05 LLPP

357-26 61.07 38.93 LLPP

357-27 100 0 PP

357-28 75.71 24.29 LPP

357-29 76.12 23.88 LPP

357-30 76.13 23.87 LPP

357-31 75.39 24.61 LPP

357-32 59.45 40.55 LLPP

357-33 61.39 38.61 LLPP

357-34 100 0 PP

357-35 80.16 19.84 LPP

第四節 基因型分析

基因型分析主要有兩個目的，一是確定T

世代的分離比，由基因型方面觀察是

否符合孟德爾單一基因分離比，以確認T

世代是轉入單一 copy 的轉殖株；二是根

據基因型將外表型資料分群，並比較各群之間是否有差異，驗證轉入的 SlMYB94

基因是否確實能夠調控雄蕊長度。由第三節、焦磷酸定序結果來對基因型分群，其

中 16TS355、16TS356 因為都各只有一個T

個體有成功遺傳自T

世代的轉殖

SlMYB94 基因，而 16TS361 的T

個體皆沒有成功轉殖 SlMYB94 基因，因此以下我

們針對有成功轉殖的 16TS357 進行分群(表八)，其中共 35 個個體，依據推測的單

一基因後代分離比 1：2：1，以卡方適合性檢定(goodness of fit test)，檢查推測基因

型是否符合轉入單一 copy 的推測。

表八、16TS357 基因型分群與外表型測量結果整理

Sample ID 推測基因型 雄蕊長(mm) 雌蕊長(mm) 雌雄蕊長度差 357-21 LLPP 9.8±0.9 10.3±0.8 0.6±0.3 357-32 LLPP 10.6±0.6 11.2±0.7 0.6±0.3 357-24 LLPP 9.3±1.0 9.8±0.9 0.4±0.4 357-13 LLPP 10.2±0.9 10.2±2.2 0.0±1.7 357-11 LLPP 11.0±0.5 11.7±0.5 0.7±0.5 357-15 LLPP 10.6±0.3 11.2±0.4 0.6±0.4 357-26 LLPP 9.2±1.0 8.5±2.4 -0.7±1.8 357-33 LLPP 11.1±0.3 11.3±0.1 0.2±0.3 357-25 LLPP 10.4±0.7 11.0±0.8 0.6±0.4

357-22 LPP 未收取到花 未收取到花 未收取到花

357-16 LPP 7.4±0.1 8.3±0.7 0.9±0.6

357-3 LPP 10.5±0.6 11.0±0.7 0.6±0.3

357-10 LPP 10.7±0.8 11.4±0.8 0.8±0.5

357-2 LPP 10.7±0.6 11.1±0.7 0.5±0.3

357-6 LPP 11.3±0.5 11.9±0.6 0.6±0.3

357-17 LPP 10.1±0.7 10.6±0.8 0.5±0.3

357-19 LPP 9.2±0.4 9.8±0.5 0.6±0.2

357-5 LPP 9.8±1.1 10.1±1.1 0.3±0.3

357-12 LPP 10.8±0.4 11.3±0.5 0.5±0.3

357-14 LPP 10.8±0.4 11.5±0.4 0.7±0.3

357-8 LPP 10.2±0.8 10.7±0.9 0.5±0.4

357-31 LPP 10.0±1.0 10.4±1.0 0.4±0.4

357-28 LPP 10.3±0.7 11.0±0.7 0.7±0.3

357-29 LPP 10.2±0.7 10.7±0.8 0.6±0.3

357-30 LPP 10.5±0.5 11.0±0.5 0.5±0.3

357-7 LPP 9.8±1.1 10.2±1.1 0.4±0.3

357-9 LPP 10.5±0.5 10.9±0.5 0.4±0.4

357-1 LPP 10.8±0.4 11.3±0.6 0.6±0.4

357-35 LPP 10.0±0.9 10.3±1.4 0.3±0.5

357-4 PP 10.7±0.5 11.3±0.9 0.6±0.5

357-18 PP 11.0±0.6 11.6±0.7 0.6±0.3

357-20 PP 10.9±0.9 11.5±1.0 0.6±0.3

357-23 PP 10.3±0.5 10.9±0.6 0.6±0.5

357-27 PP 9.8±0.9 10.0±1.9 0.3±1.1

357-34 PP 8.2±0.6 8.5±0.6 0.3±0.3

以表八的推測基因型數量對 1：2：1 進行卡方適合性檢定(表九)，H

：符合 1：

2：1 比例；H

：不符合 1：2：1 比例，檢定結果χ

= 1.228571，χ

= 5.991，

χ

< χ

無法拒絕H

，即無法拒絕為 1：2：1 比例，符合單一基因分離比，T

世代轉殖的 SlMYB94 基因為單一 copy。

接著用單因子變異數分析，分別對雄蕊、雌蕊、雌雄蕊長度差，依照基因型的 分群，對外表型有資料的 34 個 16TS357 個體進行分析，檢查組間變異(轉殖 SlMYB94 基因的數量)，是否相對大於組內變異(轉殖同樣 copy 數 SlMYB94 基因個體間差異)，

檢查結果顯示不論是雄蕊、雌蕊、或是雌雄蕊長度差，依照基因型分群的情況下，

其外表型皆無顯著差異(表十)。

表九、16TS357 卡方適合性檢定表(1：2：1)

以卡方適合性檢定中研院 2-9 的自交後代 16TS357 是否符合孟德爾遺傳單一基因 分離比，結果卡方值為 1.228571，χ

< χ

= 5.991，無法拒絕為 1：2：1 比 例，意即中研院 2-9 應為轉入單一 copy 的轉殖植株

推測基因型 LLPP LPP PP 合計

實際值(期望值) 9 (8.75) 20 (17.5) 6 (8.75) 35

卡方值 0.007143 0.357143 0.864286 1.228571

表十、16TS357 基因型分群外表型變異結果

三種推測基因型(LLPP、LPP、PP)分別對外表型(雄蕊、雌蕊、雌雄蕊長度差)進 行 ANOVA，結果顯示 P-value 皆大於 0.05，以基因型分群的外表型間無差異

雄蕊長度 ANOVA

Df Sum Sq Mean Sq F-value Pr (>F) genotype 2 0.0346 0.01729 0.039218 0.961589 Residuals 31 21.6156 0.69726

雌蕊長度 ANOVA

Df Sum Sq Mean Sq F-value Pr (>F) genotype 2 0.1135 0.05676 0.0671 0.9353 Residuals 31 26.2268 0.84603

雌雄蕊長度差 ANOVA

Df Sum Sq Mean Sq F-value Pr (>F)

genotype 2 0.28204 0.14102 1.9986 0.1526

Residuals 31 2.18737 0.07056

第五章 討論

第一節 35S 分子標記與焦磷酸定序結果不完全相同

針對 6 個T

世代 89C2、89M6、中研院 2-9、90M4-2、90M4-3、90M4-6，在焦

磷酸定序結果中， 90M4 的 3 個轉殖株皆確認沒有成功將 TA3178 pp 的 SlMYB94 基

因轉入 M82 中，然而在更早之前進行的 35S 分子標記測試，卻都顯示上述 6 個T

世代能夠在其體染色體中，藉由 PCR 擴增出 CaMV 35S 啟動子。這可能是由於轉

殖構築製作時，沒有成功將 SlMYB94 基因接入，只有接入了 35S 啟動子。在焦磷

酸定序設計中， SlMYB94 基因是屬於 MYB 家族的 R2R3MYB，SlMYB94 基因包含

了 3 個外顯子(exons)，當中前 2 個分別屬於 R2、R3，為 MYB 的特徵片段，在整

個番茄的基因體中能夠對到 1 至 2 處其他位置，專一性不夠高，因此焦磷酸定序

設計的 SNP 位點是位在 SlMYB94 基因第 3 個 exon 上，並不是針對 35S 啟動子進

行偵測，所以有可能發生 35S 分子標記和焦磷酸定序結果不同的狀況。

第二節 SlMYB94 基因可能並非期望的 stamen2.2 基因

在基因型分析 16TS357 轉殖品系的結果中，藉由卡方檢定，我們確認了 16TS357 轉殖品系的親本，中研院 2-9 確實是轉入單一 copy 的轉殖株，然而將外 表型數據以基因型進行分群的結果，在 16TS357 這個轉殖品系當中，轉入不論單 一 copy，或是自交產生的 double copies 的 M82 之 SlMYB94 基因 cDNA，皆無法在 TA3178 這個轉殖背景上，產生顯著的外表型差異。考慮到初始的試驗設計為轉殖 互補性試驗，然而在這次試驗中，沒能夠成功產生出 TA3178 的 SlMYB94 基因轉 殖到 M82 背景的植株，因此，互補性試驗只能算是驗證了其中的一半，即 M82 之 SlMYB94 基因 cDNA 轉殖到 TA3178 中，並使其大量表現，並無法使其雄蕊長度發 生顯著改變。雖然如此，但在這次試驗當中，在 CaMV 35S 啟動子大量表現 M82 的 SlMYB94 基因的條件之下，TA3178 的雄蕊長度並不因此產生變化，這可能是因 為轉入的 SlMYB94 基因並非我們所期望的 stamen2.2 基因。這次的試驗雖然我們 沒有找到 stamen2.2 基因，卻也反向證實了 SlMYB94 基因並非 stamen2.2 基因。

對於未來的研究者們，我們在這次的研究中，以基因轉殖配合遺傳育種方式，測量

外表型並比對轉入基因的 copy 數，以驗證目標基因的方式；相較常見的以 RT-PCR

分析表現量的研究模式，提供另一條研究方向。

引用文獻

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附錄

附件 1

附件 1、SlMYB94 基因及其多肽鏈

序列當中淺灰色網底部分為 exons，深灰色網底部分為 M82 和 TA3178 對偶基因間 的 Indel 及 SNP

SlMYB94 in S. lycopersicum (M82)

ATGGGTAGACCACCTTGTTGTGATAAAACGGGGGTGAAGAAAGGACCATGGACTCCT

GAAGAAGATATTATGCTAGTCTCTTTTGTTCAAGAACATGGTCCAGGGAATTGGAGG

ACTGTTCCCACTCATACAGGTTCATTTCTTTTCCTTC-TTGATTTATCGTATAGTCA

CTCAATTAATAGTTATTATGTCATATACTTCAAAGTGTAATGTGTTTGTTTTAATGT

GCAGGGCTACGGAGATGTAGCAAAAGCTGCAGACTAAGGTGGACTAACTACCTCAGA

CCAGGAATCAAGAGGGGTAGCTTCAGTGATCAAGAGGAGAAGATGATTATCCAGCTT

CAGGCTCTCTTAGGCAACAAGTATGTATTTTCTCATTAATTCCCTTCATTACCTATC

TTGATCCTTTTCGTTTCATTTCATATGACTGTATTTGACAAAAAAAAAAA---

GAATTTATTTTTAAAATAGATATACCAATTTTTGGCATTATACTAAAGTACCTTTAT

TCTATTATGATCGATCTTAAACATGTCATGACATTAGGGAGATTGAATTACTATTAC

ATGGATCTGGATAGTCACTTTGATGTATTTATTCTTCATTATGAAATTCTTTAAAGA

GTAACTGTTTACAGTACAGCAAGTCCCTTGTTACTGATTTTCTGCTTCTTTGTAACA

GATGGGCTGCCATAGCTTCATATCTCCCTGAGAGAACCGATAACGACATTAAAAATT

ACTGGAATACTCATTTAAAAAAGAAGCTGAGGAAGCTTGAAACAAGTGATTTATACT

CAAATGATGGACATTGTTTATCAAAATTTAATTCAACCTCCAGAGGGCAATGGGAAA

GGACACTTCAAGCTGATATTAACACAGCCAAACAAGCTTTACAAAATGCTCTGTCAC

TCGATGAATCAAGCCCAATT---CCTGATATTGGATGTTACCCAT

TCATAAAACAAGAAGCGAAAATGTCTACTACTACTTATGCATCAAGTGCTGAAAACA

TAGCCAAATTACTCAAACAATGGACCAGAAGCGAATCCACAAATAATTCAGAGCAAT

CAAAGGCTTCGTCAAGTACTCAATTTTCTTGTAATACTACTAACAATAATGCCATGA

CTGAATATTCATCTTCATTTGAACCGTCGAATTCAGATCAATTTTCACAAGCCACGA

CACCTGAAGCTGCTGGTAAATTTCATGGTGAAAGCAAAAGAGAAATGGATGATGAAA

TTCAGTTGTCAGTAATGCTGGAGAGTTGGCTGTTTGATGAAAATGACGATTTATTAA

TTTAG

SlMYB94 in S. pennellii ( TA3178 )

ATGGGTAGACCACCTTGTTGTGATAAAACGGGGGTGAAGAAAGGACCATGGACTCCT

GAAGAAGATATTATGCTAGTCTCTTTTGTTCAAGAACATGGTCCAGGGAATTGGAGG

ACTGTTCCCACTCATACAGGTTCATTTCTTTTCCTTCTTTGATTTATCGTATAGTCA

CTCAACTAATAGTTACTATGTCATATACTTCAAAGTGTAATGTGTTTGTTTTAATGT

GCAGGGCTACGGAGATGTAGCAAAAGCTGCAGACTAAGGTGGACTAACTACCTCAGA

CCAGGAATCAAGAGGGGTAGCTTCAGTCATCAAGAGGAGAAGATGATTATCCAGCTT

CAGGCTCTCTTAGGCAACAAGTATGTATTCTCTCATTAATTTCCTTCATTACCTATC

TCGATCCTCTTCGTTTCATTTCATATGACTGTATTTGACAAAAAAAAAAAAGATAAA

GAGTTTATTTTTAAAATAGAAATACCAATTTTTGGCATTATACTAAAGTACTTTTAT

TCCATTA----CGATCTTAAACATGTCATGACATTAGGGAGATTGAATTACTATTAT

ATGGATCTGGATAGTCACTTTGATGTATTTATTTTTCATTATGAAATTCTTTAAAAA

GTAATTGTTTACAGTACAGCAAATCCCTTGTTACTGATTTTCTGCTTCTTTGTA-CA

GATGGGCTGCCATAGCTTCATATCTCCCTGAGAGAACCGATAACGACATTAAAAATT

ACTGGAATACTCATTTAAAAAAGAAGCTGAAGAAGCTTGAAACAAGTGATTTATACT

CAAATGATGGACATTGTTTATCAACATTTAATTCAACCTCCAGAGGGCAATGGGAAA

GGACACTTCAAGCTGATATTAACACAGCTAAACAAGCTTTACAAAATGCTCTGTCAC

TCGATAAATCAAGCCCAATTTCTGACTATACAATTCCTGATATTGGATGTTACCCAT

TCATAAAACAAGAAGCGAAAATGTCTACTACTACTTATGCATCAAGTGCGGAAAACA

TAGCCAAATTACTCAAACAATGGACCAGAAGCGAATCCACAAATGATTCAGAGCAAT

CAAAGGCTTCGTCAAGTACTCAATTTTCTTGTAATACTAAT---AATAATGCCATGA

CTGAATATTCATCTTCATTTGAACCGTCGAATTCAGATCAATTTTCACAAGCTACGA

CACCTGAAGCTGCTGGTAAATTTCATGGTGAAAGCAAAAGAGAAATGGATGATGAAA

TTCAGTTGTCAGTAATGCTGGAGAGTTGGCTGTTTGATGAAAATGACGATTTATTAA

TTTAG

SlMYB94 protein in Solanum lycopersicum (M82)

MGRPPCCDKTGVKKGPWTPEEDIMLVSFVQEHGPGNWRTVPTHTGLRRCS KSCRLRWTNYLRPGIKRGSFSDQEEKMIIQLQALLGNKWAAIASYLPERT DNDIKNYWNTHLKKKLRKLETSDLYSNDGHCLSKFNSTSRGQWERTLQAD INTAKQALQNALSLDESSP---IPDIGCYPFIKQEAKMSTTTYASSAE NIAKLLKQWTRSESTNNSEQSKASSSTQFSCNTTNNNAMTEYSSSFEPSN SDQFSQATTPEAAGKFHGESKREMDDEIQLSVMLESWLFDENDDLLI*

SlMYB94 protein in Solanum pennellii (TA3178)

MGRPPCCDKTGVKKGPWTPEEDIMLVSFVQEHGPGNWRTVPTHTGLRRCS KSCRLRWTNYLRPGIKRGSFSHQEEKMIIQLQALLGNKWAAIASYLPERT DNDIKNYWNTHLKKKLKKLETSDLYSNDGHCLSTFNSTSRGQWERTLQAD INTAKQALQNALSLDKSSPISDYTIPDIGCYPFIKQEAKMSTTTYASSAE NIAKLLKQWTRSESTNDSEQSKASSSTQFSCN-TNNNAMTEYSSSFEPSN SDQFSQATTPEAAGKFHGESKREMDDEIQLSVMLESWLFDENDDLLI*

SlMYB94 cDNA in S. lycopersicum (M82)

ATGGGTAGACCACCTTGTTGTGATAAAACGGGGGTGAAGAAAGGACCATGGACTCCT

GAAGAAGATATTATGCTAGTCTCTTTTGTTCAAGAACATGGTCCAGGGAATTGGAGG

ACTGTTCCCACTCATACAGGGCTACGGAGATGTAGCAAAAGCTGCAGACTAAGGTGG

ACTAACTACCTCAGACCAGGAATCAAGAGGGGTAGCTTCAGTGATCAAGAGGAGAAG

ATGATTATCCAGCTTCAGGCTCTCTTAGGCAACAAATGGGCTGCCATAGCTTCATAT

CTCCCTGAGAGAACCGATAACGACATTAAAAATTACTGGAATACTCATTTAAAAAAG

AAGCTGAGGAAGCTTGAAACAAGTGATTTATACTCAAATGATGGACATTGTTTATCA

AAATTTAATTCAACCTCCAGAGGGCAATGGGAAAGGACACTTCAAGCTGATATTAAC

ACAGCCAAACAAGCTTTACAAAATGCTCTGTCACTCGATGAATCAAGCCCAATTCCT

GATATTGGATGTTACCCATTCATAAAACAAGAAGCGAAAATGTCTACTACTACTTAT

GCATCAAGTGCTGAAAACATAGCCAAATTACTCAAACAATGGACCAGAAGCGAATCC

ACAAATAATTCAGAGCAATCAAAGGCTTCGTCAAGTACTCAATTTTCTTGTAATACT

ACTAACAATAATGCCATGACTGAATATTCATCTTCATTTGAACCGTCGAATTCAGAT

CAATTTTCACAAGCCACGACACCTGAAGCTGCTGGTAAATTTCATGGTGAAAGCAAA

AGAGAAATGGATGATGAAATTCAGTTGTCAGTAATGCTGGAGAGTTGGCTGTTTGAT

GAAAATGACGATTTATTAATTTAG

附件2

附件 2、轉殖構築示意圖

由上而下依序為 89C2、89M6、90M4，其中 89M6 和 90M4 構築僅 MYB 片段大小

及來源(M82、TA3178)不同

附件3

附件 3、番茄花器掃描圖編號後之範例

附件4

附件 4、轉殖世代T

之 35S 及背景檢測與收取的自交種子(T

)的數量

𝐓

世代編號 是否轉入

番茄背景 收取的自交種子(𝐓

89C2-1

是 TA3178 157

89C2-2

是 TA3178 109

89C2-3

是 TA3178 0

89C2-4

是 TA3178 69

89C2-5

是 TA3178 37

89C2-6

是 TA3178 7

89C2-7

是 TA3178 83

89C2-8

是 TA3178 113

𝐓

世代編號 是否轉入

番茄背景 收取的自交種子(𝐓

中研院 2-2 是 TA3178 0

中研院 2-4 是 TA3178 29

中研院 2-5 否 TA3178 4

中研院 2-6 否 TA3178 0

中研院 2-8 是 TA3178 47

中研院 2-9 是 TA3178 90

中研院 2-10 是 TA3178 61

中研院 2-11 否 TA3178 75

中研院 2-14 否 TA3178 112

中研院 2-15 是 TA3178 0

M82 的 SlMYB94 全基因轉入 TA3178

𝐓

世代編號 是否轉入

番茄背景 收取的自交種子(𝐓

89M6-1 否 TA3178 78

89M6-2 否 TA3178 51

89M6-3 否 TA3178 333

89M6-4 否 TA3178 70

89M6-5 否 TA3178 5

89M6-6 未檢測 未檢測 10

𝐓

世代編號 是否轉入

番茄背景 收取的自交種子(𝐓

中研院 3-2 是 TA3178 20

中研院 3-3 是 TA3178 30

中研院 3-7 是 TA3178 48

中研院 3-8 是 TA3178 5

中研院 3-9 是 TA3178 0

中研院 3-10 是 TA3178 0

中研院 3-11 是 TA3178 193

中研院 3-12 是 TA3178 0

中研院 3-14 是 TA3178 140

中研院 3-15 是 TA3178 55

中研院 3-16 是 TA3178 13

中研院 3-17 是 TA3178 0

中研院 3-18 是 TA3178 93

中研院 3-19 是 TA3178 62

中研院 3-20 是 TA3178 0

中研院 3-21 是 TA3178 128

中研院 3-22 是 TA3178 0

中研院 3-23 否 TA3178 0

中研院 3-24 是 TA3178 0

中研院 3-25 是 TA3178 0

中研院 3-26 未檢測 未檢測 ₀

中研院 3-27 未檢測 未檢測 ₀

中研院 3-28 未檢測 未檢測 ₀

TA3178 pp 的 SlMYB94 全基因轉入 M82

𝐓

世代編號 是否轉入

番茄背景 收取的自交種子(𝐓

90M4-1 是 M82 0

90M4-2 是 M82 66

90M4-3 是 M82 53

90M4-4 否 M82 281

90M4-5 是 M82 0

90M4-6 是 M82 119

90M4-7 否 M82 254

90M4-8 是 M82 0

90M4-9 是 M82 46

90M4-10 是 M82 10

90M4-11 是 M82 86

90M4-12 是 M82 116

90M4-13 是 M82 26

90M4-15 否 TA3178 74

90M4-16 否 M82 0

90M4-17 否 M82 0

90M4-18 否 M82 9

90M4-19 否 M82 0

90M4-20 否 M82 0

𝐓

世代編號 是否轉入

番茄背景 收取的自交種子(𝐓

中研院 4-1 是 M82 0

中研院 4-2 是 M82 18

中研院 4-4 是 M82 0

中研院 4-5 是 M82 0

中研院 4-8 否 M82 0

中研院 4-9 是 M82 10

中研院 4-10 是 M82 4

中研院 4-11 是 M82 8

中研院 4-12 否 M82 0

中研院 4-15 是 M82 0

中研院 4-16 未檢測 未檢測 ₀

中研院 4-17 未檢測 未檢測 ₀

中研院 4-18 未檢測 未檢測 ₄₂