成大研發快訊 第十卷 第二期 - 2009年八月十四日 [ http://research.ncku.edu.tw/re/articles/c/20090814/1.html ]
腸病毒71型弱毒株及克沙奇A16病毒的免疫可保護小鼠
對腸病毒71型的感染
吳得嘉
1、王雅芳
2、李一平
2、王貞仁
3、劉清泉
4、王世敏
4、黎煥耀
1、蘇益仁
5,6、
余俊強
1,* 國立成功大學 醫學院 1微免所、2基醫所、3醫技系、4小兒科、5臨醫所 6國家衛生研究院 臨床組 [email protected] Journal of Virology 2007, 81:10310-10315.1
998年腸病毒71型 (enterovirus 71, EV71) 在台灣爆發大規模流行， 造成嬰幼兒及孩童重症感染，EV71的高致死率更引起醫學界的關注 與造成家長的恐慌，自此，每年春夏交接及夏季時期都會出現幼童感 染的病例，EV71是台灣目前一項重要的公共衛生課題。事實上EV71 被認為是小兒麻痺病毒 (poliovirus) 獲得有效控制後最重要的嗜神經 性腸病毒 (13)。 根據腸病毒的生物學及分子特性，EV71和科沙克A16病毒 (coxsackie A16, CA16) 同被歸屬於人類A群腸病毒中 (15)。臨床上CA16與EV71 皆會造成幼童的手足口症及咽頰炎，但只有EV71會併發嚴重神經性 症狀及肺水腫而導致死亡 (7) 特異性是在後天性免疫系統中一個重要的特性，意指抗體或是T細胞反應，對於特異的抗原會有專一性，但當 抗原間呈現一些相似的結構時，即可能產生交互作用 (cross-reaction)，此時抗體不只對於引起它的原抗原有 反應，對於其他結構相似的抗原也產生作用，交互作用是引起自體免疫疾病很常見的因素。 文獻指出許多腸病毒彼此會發生基因重組的現象，馬來西亞的研究即分離出與EV71和CA16基因序列相似性皆 超過80﹪的腸病毒 (2 )。早期的文獻指出CA16和EV71共有相同的抗原，可藉免疫螢光染色、補體結合反應和 免疫擴散法鑑別 (6)。而此型間的交叉反應是否對EV71有中和性或更進一步具保護能力則未有探究，再者其他 型腸病毒與EV71是否也有加互反應，所引起的免疫反應是否會影響EV71感染產生輕重症的差異，也尚未清楚 瞭解。在環境中存在超過七十種的腸病毒，同屬於人類腸病毒A群的也逾十種，我們有相當多機會接觸到不同 的腸病毒 (9)，若其他這些腸病毒感染所引起的免疫反應足以提供對於EV71的交互保護作用的話，或許是降低 EV71感染引起重症流行的因素之一。 因此在本篇研究中我們以主動免疫或被動免疫的方式，使小鼠預先獲得EV71弱毒株或CA16的免疫力，再以模 擬自然糞口感染的動物模式進行實驗，探討宿主免疫狀況與腸病毒間交互作用的現象。 口服腸病毒71型弱毒株或克沙奇A16病毒的主動免疫可獲得對腸病毒71型強毒株輕度的保護力一日齡小鼠口服感染EV71弱毒株4643，不會引起死亡，一週後有特異性IgG 和 IgA抗體的產生 (Fig. 1A)，且 具中和效價 (使病毒喪失感染能力)。脾臟細胞的抗原特異性增值反應亦指出小鼠產生特異性的細胞免疫反應 (Fig 1B)。早期主動免疫亦能提供保護的效果。在小鼠一日齡時經口服餵食感染EV71弱毒株4643 引發免疫反 應，在小鼠七日齡時，再口服感染EV71強毒株MP4，結果顯示，對照組的小鼠 (口服培養液)，體重下降且呈 現不健康的狀態。先經4643免疫的小鼠，體重呈現穩定成長，臨床症狀也比口服培養液的對照組輕微，在存 活率方面，則可提高20~30﹪(Fig. 2)。更有趣的是，CA16主動免疫也同樣可讓小鼠產生可辨認EV71的特異性
抗體和細胞免疫 (Fig.1)，顯示CA16所引起的免疫反應與EV71有交互作用，而且這交互作用可提供微弱的保護 能力 (Fig. 2)。口服CA16免疫的小鼠經EV71強毒株感染後的存活率可提高10~20﹪。
圖一、EV71和CA16的活弱毒株皆可誘發新生小鼠的主動免疫 力。 一日齡ICR小鼠經口服接種EV71/4643、CA16或CB3 (104
PFU/鼠)。(A) EV71特異性血清IgG和腸道IgA抗體在感染後7日和 14日以ELISA定量。(B) 脾臟細胞對EV71、CA16或CB3抗原刺激的 增殖反應在感染後第7日測定。結果為平均值 ± 標準誤差。*P＜ 0.05與對照組小鼠比較。n = 10-12小鼠。 圖二、EV71和CA16的活弱毒株的主動 免疫可部份保護初生小鼠對EV71的致 死攻擊。 一日齡ICR小鼠經口服接種 EV71/4643、CA16或CB3 (104 PFU/
鼠)。小鼠於七日齡時再經相同途徑以 EV71/MP4 (105 PFU/鼠)攻擊，以後每 日紀錄小鼠體重、臨床症狀指數和存活 率。結果為平均值 ± 標準誤差。n = 10-12小鼠。 腸病毒71型與克沙奇A16的免疫血清對彼此的病毒抗原有相互辨認能力 EV71和CA16對小鼠皆具有高抗原性，可誘發成鼠產生高價的抗血清，且對於各自之病毒有高中和力價。進一 步的實驗可知EV71和CA16免疫血清能交互辨認相互的抗原 (Fig. 3)，此外CA16免疫血清對EV71有輕微的中和 能力，四倍稀釋的CA16免疫血清可中和EV71 (Fig. 4)，但對克沙奇B3 病毒(coxsackie B3, CB3) 以及小兒麻痺 病毒並沒有中和能力。西方墨點法的分析中，EV71和CA16兩者之免疫血清可交互辨認分子量為55~72 kDa的 病毒蛋白 (Fig. 5)，猜測為VP0-VP3尚未被切割的病毒結構蛋白。
圖三、EV71和CA16的交叉反應。 EV71或CA16的病毒 抗原 (10μg /ml) 分別披覆於96孔洞的平板，再與連續 稀釋的抗EV71、抗CA16、或抗CB3免疫血清培養。特 異性免疫反應經第二抗體及TMB受質培養後呈現。結果 為兩次相同實驗其中之一。 圖四、抗CA16免疫血清可交叉中和EV71。 (A)左 圖：抗CA16免疫血清減少EV71對RD細胞的細胞病 理效應 (CPE)。RD細胞 (8 × 104細胞/孔洞) 在加 入100 TCID50的EV71前，先與兩倍連續稀釋的抗 CA16或抗EV71免疫血清二重覆方式混合培養。每 天持續觀察細胞CPE現象。中間及右圖：抗CA16 免疫血清中和EV71而無法中和CB3和小兒麻痺病 毒。抗CA16或抗CB3免疫血清在加入等體積100 TCID50的CA16、EV71、CB3或小兒麻痺病毒前先 二重覆的加入RD細胞中。每天持續觀察CPE現 象。只呈現1：4稀釋的結果。放大率：×100。(B) 抗CA16免疫血清以劑量效應方式中和EV71。EV71 (100 TCID50) 與正常血清、抗EV71或抗CA16免疫 血清 (1：2至1：6稀釋) 培養兩小時。以溶菌斑法 測定細胞中病毒力價。結果為兩個實驗各有三重覆 的平均值 ± 標準誤差。ND：不可偵測。
圖五、抗EV71和抗CA16免疫血清可辨認EV71及CA16的病毒抗原。 EV71、CA16和CB3的病毒蛋白 (3 mg) 以12.5%聚丙烯醯凝膠電泳分離並轉染PDVF膜，再分別以抗CA16或抗EV71免疫血清 (1：500稀釋) 染 色。特異免疫反應最後以DAB顯示系統表現。 克沙奇A16免疫血清的被動免疫可減弱腸病毒71型強毒株感染引起的嚴重症狀並降低死亡率 CA16抗體對於EV71輕微的交互中和效價是否真的可以提供保護?我們進一步利用小鼠感染模式作探討。在小 鼠六日齡時，分別以正常的、CA16、EV71或CB3的免疫血清經腹腔注射的方式被動免疫，接著再以EV71強毒 株口服餵食感染。結果顯示，正常血清與CB3免疫血清並沒有保護的效果，小鼠呈現EV71的症狀較嚴重，死 亡率達70~80﹪(Fig. 6A)。然而EV71免疫血清免疫的小鼠完全沒有症狀，而且百分之百的存活；CA16免疫血 清被動免疫過的小鼠的平均症狀指數也較低，存活率比正常血清被動免疫對照組的小鼠提高40﹪。此外CA16 免疫血清或是EV71免疫血清皆能有效降低血液、腸道、肌肉以及腦等組織中的病毒效價 (Fig. 6B)，減少了對 標的器官的破壞而減輕症狀和死亡。從以上的實驗，我們可以確實知道CA16的抗體在活體內可以針對EV71提 供部分的保護力。 結論 圖六、抗CA16免疫血清的被動免疫可部份保護小鼠 減毒疫苗 (沙賓) 和不活化疫苗 (沙克) 的成功使用，讓 小兒麻痺得到有效控制 (1)。在 EV71方面，雖然已經有 實驗性疫苗試驗，臨床上目前仍未有安全有效的EV71 疫苗。我們曾報告一種經福馬林不活化全病毒顆粒疫 苗在新生小鼠的效能 (24)。在此文章中，我們首次證 實口服減毒的活病毒疫苗 (attenuated live vaccine) 的 可行性，小鼠口服接種弱毒株不但能誘發特異免疫反 應，並且提供小鼠對強毒株攻擊的保護力，表示減毒 疫苗是有發展的潛力。
對抗EV71的攻擊並減少組織中病毒量。七日齡的 ICR小鼠在口服接種EV71/MP4 (105 PFU/鼠) 前一天
先腹腔注射正常血清、抗CB3、抗CA16或抗EV71免 疫血清。症狀指數和存活率 (A) 和組織病毒力價 (B) 在感染後測定。結果為5至10隻小鼠實驗的平均值 ± 標準誤差。ND：不可偵測。結果為兩相同實驗其中 之一。 小鼠經CA16的主動免疫後獲得對EV71微弱的保護力， 這種保護力並非先天免疫特別是第一型干擾素被激發 所致。口服CA16並不會產生第一型干擾素，而主動免 疫的保護作用只限於CA16，同屬腸病毒的CB3的主動 免疫不會產生保護作用。 在體外實驗中，可知CA16抗體對於EV71抗原有交互作 用，並且呈現輕微的中和效果；小鼠體內若預先產生 CA16的抗體，可以對EV71的感染提供部分的保護效果，避免嚴重症狀產生。雖然在小鼠模式中看到上述結 果，但是在人體對腸病毒的免疫反應是否亦有此種交互作用及保護的情形，尚未知曉。 EV71的流行模式仍未明瞭 (18)，因此目前無法預測EV71的流行。對CA16的免疫記憶性能被CA16本身及EV71 所喚起，這表示在族群中對CA16或其他腸病毒已存在的免疫力可能是決定EV71在族群中流行的一個因素。台 灣疾病管制局流行病學的數據指出在過去若干年間CA16和EV71的感染率有負向相關性，間接支持我們的理 論。再者此假說若在臨床病患中證實，將為設計有效EV71疫苗提供一個重要方向。
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