Laminar flow

(1)

第二章研究原理和方法

2-1 毛細管電泳層析法的發展

電泳（electrophoresis）是指在電場的作用下，電解質中的荷電粒子以不同的速率向荷電相反的電極遷移的現象。利用各荷電粒子所帶荷電量與質量的不同，產生不同的遷移速率，藉此可達到分離的效果，即稱為電泳分離法。

電泳技術發展至今，已有一百多年的歷史。最早發展是在 1886 年時，由 Lodge 在含有膠質的電解液中，兩端施以電壓，觀察出顏色產生變化；1892 年 Picton 使用含有離子型色素，1899 年 Hardy 利用含有膠質粒子的U 型管，都發現了電泳的現象，而且 Hardy 並於 1905 年利用有刻度的U 型管，記錄了膠質粒子的移動[35]；1937 年 Tiselius 應用此方法分離出馬的三種血清蛋白，將它們分別命名為α、β、γ 球 蛋白[36]，使電泳技術獲得重大突破，電泳分離技術漸漸受到重視，

並對此進一步更深入的探討，以期讓電泳成為簡便而有效率的分離技巧，而他本人並因對電泳-吸附現象的研究及血清蛋白分離等相關的研究，而獲得到1948 年諾貝爾獎化學獎。

由於電泳的分離效率和外加的電場大小成正比，早期的電泳分析法是直接在電解質溶液中進行分離，但施加高電壓會產生焦耳熱

（Joule heating）而導致熱擴散及熱對流。這種熱效應會使介質產生溫度梯度及速度梯度以致使譜帶加寬，降低分離效率，使電泳技術無

(2)

流的介質，如：聚丙醯胺（acrylamide）或瓊脂（agarose）凝膠等。

但此法還會延長電泳分離時間，並使再現性變差，而且凝膠介質製備困難，故一直沒有受到廣泛的應用。直到 1965 年 Konstantinov 首度嘗試利用毛細管進行電泳分析[37]，1967 年，Hjerten 使用內徑 1-3 mm 的石英管，進行無機離子、核酸與蛋白質的分離[38]，並以甲基纖維素（methylcellulose）修飾石英管內部表面，然後將毛細管繞著縱軸緩慢的旋轉，以消緩層帶擴散的影響，防止電滲流（electroosmosis）

的產生，進行區帶電泳的實驗。此一技術成功地將蛋白質與核酸完全的分離。1979 年 Virtanen 和 Mikkers 利用內徑 200～500 µm 的玻璃材質與聚四氟乙烯材質的毛細管進行電泳[39-40]，由於管柱的表面積與管柱體積比例大為提高，因此有效地控制了焦耳熱的產生。其後 Martin 和 Everaerts 的研究，進一步確立了毛細管電泳（Capillary Electrophoresis, CE）的理論基礎[41]。

目前大家普遍熟知的高效能毛細管電泳法（High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE）則是由 Jorgenson 及 Lukacs 在 1981 年提出的（42-44）。他們發表以 75 µm 內徑的毛細管玻璃管柱，在 30 kV 的高電壓條件下，成功地分離胺基酸的衍生物。並且結合螢光偵測器做線上偵測，將偵測靈敏度提高。且提出了毛細管區帶電泳分析法（Capillary zone electrophoresis, CZE），其原理是利用離子分析物在電埸作用下，由於質量和帶電量不同，產生不同的遷移速度，達到分離效果。在電泳的實驗中，使用毛細管有許多優點，愈細的毛細管所產生的焦耳熱愈少，毛細管能夠在高電場情況中產生很少的熱量，

而且毛細管電泳獨特的EOF（電滲流）所形成的流動界面也愈接近柱

(3)

狀層流（piston-like flow）（如圖 2-1 所示），因此可使得理論板數大為提高。所以目前已有開發內徑細到5~10 µm 的毛細管，但太細的毛細管會有校光、進樣及毛細管堵塞的問題存在，所以較為實用的毛細管內徑約為25～75 µm，。

毛細管電泳在其發展主要 Jorgenson 等人提出的毛細管區帶電泳層析法（CZE）。由於此法僅能分離質量和帶電量不同離子性分析物，

無法對中性分子加以分析，乃缺點之一。在 1984 年，Terabe 利用微胞液相層析（micellar liquid chromatography）的原理，發展出微胞電動毛細管層析法（Micellar Electrokinetic Chromatography 或 Micellar Electrokinetic Capillary Electrophoresis，簡稱 MEKC 或 MECC），在緩衝溶液中添加界面活性劑而形成微胞，使分離系統中如同有兩相的存在，一是由緩衝溶液組成的水相、一是由界面活性劑形成的微胞相，

分析物在兩相間分配係數不同，電泳時產生不同的遷移速率，可以成功分離不帶電的中性物質[45-46]。事實上，界面活性劑的添加，對於荷電分子的分離也極具效率，使毛細管電泳的發展更為廣泛[47]。隨後Hjerten 在 1985 年將傳統的等電聚焦過程移到毛細管進行，進而提出毛細管等電聚焦電泳法（Capillary isoelectric focusing, CIEF）

[48-49]，使用不同 pH 梯度的溶液，利用分析物等電點的差異進行分離蛋白質。1987 年 Cohen 與 Karger 亦將傳統的凝膠電泳法應用到毛細管中，將十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯氯在毛細管內形成凝膠，直接應用在蛋白質的分離與分子量的決定，發展成毛細管凝膠電泳

（Capillary gel electrophoresis, CGE）[50]。其間，還有其他的毛細管電泳技術被發展出來，如：利用不連續的緩衝溶液系統，造成電場差

(4)

異，使分析物依據不同電場下電泳速率的不同，而形成樣品區帶的分離機制，稱為毛細管等速電泳法（Capillary isotachophoresis, CITP）

[51-53]。此外，Tusda 結合液相層析與毛細管電泳的優點，使用填充物於毛細管中，利用分析物在這種特殊填充物與溶液間的分佈平衡，

而產生的一種分離機制，稱為毛細管電層析法（Capillary electrochromatography, CEC）[54-56]。這些技術使得毛細管電泳法應用日益廣泛。在毛細管區帶電泳中，理論板數一般可達數十萬，高的可達數百萬，同時由於儀器的自動化，使得操作更為簡便。還有目前新興的微晶片毛細管電泳分析[57-61]，使毛細管電泳的技術更趨成熟，成為分析技術的主流。

由於毛細管電泳分析法具有許多優點，包含樣品及溶劑使用量少，不會造成污染，而且分離時間短且效率佳，可搭配不同的電泳模式，使分離物種類多樣化，加上商業自動化儀器的普及，使CE 技術被廣泛應用在刑事鑑定、藥物分析、環境檢測、食品品管、生化醫藥上，成為簡便且有效率的分析方法[62-71]。

(5)

圖 2-1 毛細管柱內流動的示意圖及相對溶質的區帶

泳動方向

EOF

泳動方向

Laminar flow

a b

泳動方向

EOF

泳動方向

Laminar flow

a b

(6)

2-2 毛細管電泳層析法的分離原理

毛細管電泳的基本組件如圖2-2 所示，包含毛細管（capillary）、

電壓電源（HV）、緩衝溶液儲存槽（buffer solution）、樣品儲存槽（sample solution）、偵測器（detector）。先在毛細管中注滿緩衝溶液或背景溶液（background solution），再將適量的分析物進樣至毛細管內，然後把毛細管兩端放入緩衝溶液儲存槽中，利用白金電極通以高壓直流 電，進行電泳分析。

2-2.1 電泳的分離與遷移率

電泳的分離機制係以帶電粒子在電場中的速度差異為基準，當一個帶電粒子在自由溶液中，外加電場作用下所受到的靜電力為F_i[72]：

F_i＝qE

qe＝粒子帶電量（單位為庫倫）

E_e＝電場強度(單位為 V／cm)

此靜電力會使得此荷電粒子加速運動，直到和反方向的黏滯力 F_d相等而達成平衡。

Fi = Fd

這個黏滯力與粒子的移動速度v_i、半徑r_i、介質的黏度 η 成正比，

可表示為：F_d

= 6 πη ×

r_i_×v_i

當這兩個作用力互相平衡時，在電場 E 下，粒子的移動能達到一個穩定狀態的速度v_i為： E

r v q

i e

i ×

= ×

πη

6

又 v_i =µ_i E

(7)

（1）虹吸進樣時，將毛細管兩端分別置於 sample solution 及 buffer solution 中，並將 sample solution 抬高，利用兩端壓力差將樣品注入毛細管內。

（2）進樣完成後，將毛細管兩端分別放入 buffer solution 中，

通入高壓直流電，進行電泳分析

圖 2-2 CE 儀器裝置簡圖

HV Detector

buffer

buffer sample

capillary

HV Detector

buffer

buffer sample

capillary

(8)

其中，v_i為電泳速度，E 為電場強度，µ_i為帶電粒子的遷移率。

這種帶電粒子的遷移行為即為電泳。我們可定義電泳遷移率為單位電場下的電泳速率 µ_i：

i i

r q E

V

= ×

= 6 πη µ

_i

2-2.2 Zeta 電位與電滲流

電滲流（electroosmotic flow, EOF）為毛細管的自然現象，是在十九世紀末由Helmholtz 將電場應用至含鹽類水溶液之水平玻璃管中時發現的[73]。主要是指毛細管內壁表面電荷所引起管內液體的整體流動。主要形成的來源為外加電場對管壁溶液電雙層的作用。

如圖 2-3 所示，毛細管壁之離子化矽醇基（SiO^-）會因緩衝溶液的pH 值不同而有不同比例的解離，進而吸引緩衝溶液中的陽離子，

形成了所謂的電雙層。根據 Stern 的電雙層理論，溶液的正離子在經活化後的毛細管壁上，將因靜電吸引力而吸附在管壁表面上，形成不可逆吸附的第一層吸附，稱為固定層（stern layer）。當稍遠離於毛細管表面時，也會有過多的正電荷被靜電力吸引，此時吸附的程度則沒有第一層來的強，其電荷隨遠離管壁程度呈指數趨勢急遽下降，此層吸附稱為擴散層（diffuse layer）。由於溶液在毛細管內電荷分佈的不均勻，因此溶液與管壁間會有電位差的存在，此稱為 zeta 電位（ζ potential）。

若將溶液的中央部分（bulk solution）定為零電位，則管壁的電位為

ψ

0，此時在固定層中的電位由

ψ

0降至

ψ

_δ，而在擴散層中電位則由

(9)

圖 2-3 毛細管壁因帶電荷而形成電雙層及zeta電位示意圖 Solution

Silica wall

Stern layer Surface of shear Diffuse layer

ψ

0

ψ

δ

0

r（μm）

ζ

(10)

ψ

δ降至零。用公式則表示為：

ε ζ = 4 πδ ^×

^e

其中，δ為電雙層的厚度；e 為每單位表面積的電荷；ε為溶液的介電常數。因為zeta 電位的存在，在高壓電場的作用下，使得毛細管中的液體會有泳動的現象，即為電滲流（electroosmotic flow, EOF），

如圖 2-4。將電滲流遷移率定義為單位電場下的電滲流速率 µ_eof，而毛細管中各部位介質的電滲流與該點的zeta 電位成正比，可表示為：

η ζ

µ

_eof

= ε ^×

其中，η 為溶液的黏度。由於帶電粒子在緩衝溶液中，藉著靜電力和本身質量的影響，有其電泳遷移率（µep），而溶液本身因pH 值、

離子強度、濃度的控制亦存在著電滲流遷移率（µeof），因此帶電粒子整體的遷移率則為這兩者向量的加成；電滲流遷移率之作用如一種泵機制，可帶動所有粒子朝向偵測器，測定各分析物在電泳遷移中的差異而達分離目的。當通以正的高壓電時，陽離子移動方向與電滲流µ_eof 相同，其單位電場的遷移速率為µep＋µeof，陰離子移動則與電滲流相反，其單位電場的遷移速率為︱µ_ep－µ_eof︱。

電泳分離的機制就是靠著各種分析物在電解質溶液中電泳遷移率的差異來達成，如圖2-5。表 2-1 列出了控制 EOF 常見的方法，由此可藉由改變電解質的條件，如組成、濃度、pH 值、有機修飾劑、

電解質修飾劑、管柱修飾劑等，來達成不同的分離效果。

(11)

圖 2-4 EOF的形成及流動 (a) 毛細管壁的解離 (b) 電雙層的形成

(c) 通電後，電滲流的形成

a

b

c

Si Si Si Si Si Si Si Si Si

O - OH O - OH O - O - OH OH OH

K_SiOH

H⁺ H⁺

H⁺

H⁺ Electrolyte solution

Silica wall

+

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

+ + + + + + + + + + + +

+ + + + +

+

+ + + +

+ + + + + + +

+ + +

+

+ + + + + + +

+ + + + +

+ +

+

+ +

+

+ + +

+ + +

+ +

+ + + + +

+ +

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

EOF

a

b

c a

b

c

K_SiOH

H⁺ H⁺

H⁺

Silica wall Si Si Si Si Si Si Si Si Si

K_SiOH

H⁺ H⁺

H⁺

Silica wall

+

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

+ + + + + + + + + + + +

+ + + + +

+

+ + + +

+ + + + + + +

+ + +

+

+ + + + + + +

+ + + + +

+ +

+

+ +

+

+ + +

+ + +

+ +

+ + + + +

+ +

+

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

+ + + + + + + + + + + +

+ + + + +

+

+ + + +

+ + + + + + +

+ + +

+

+ + + + + + +

+ + + + +

+ +

+

+ +

+

+ + +

+ + +

+ +

+ + + + +

+ +

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

EOF

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

EOF

(12)

表2-1 常見控制 EOF 的方法

影響因素電場強度

緩衝溶液 pH

離子強度或緩衝溶液濃度

溫度

有機修飾劑

表面活性劑

中性親水高分子聚合物共價鍵結

結果

●電滲流呈比例變化

●低 pH，EOF 降低

●高 pH，EOF 增加

●增加離子強度，zata 下降，

EOF 下降

●每℃黏度變化 2~3%

●改變 zata 電位及黏度，一般使 EOF 下降

●透過疏水性或離子相互作用吸附於毛細管壁

●透過疏水性相互作用吸附於毛細管壁

●化學鍵結於毛細管壁

說明

●場強降低可能引起分離效率和解析度下降

●場強增加可能引起焦耳熱

●改變 EOF 最方便有用的方法

●可能改變溶質的電荷或結構

●高離子強度產生較大電流引起焦耳熱

●低離子強度產生樣品吸附問題

●樣品導電度不同引起譜峰變形

●低離子強度降低樣品堆積效果

●若由儀器控溫，改變溫度是有效的方法

●變化複雜，需透過實驗確認

●可能改變選擇性

●陰離子表面活性劑增加 EOF

●陽離子表面活性劑減少 EOF 或使之改變方向

●改變選擇性

●通過覆蓋表面電荷和黏度增加降低 EOF

●多種可能影響(親水性或帶電性)

●穩定性常有問題

(13)

圖 2-5 在CZE的分離模式下，不同粒子的遷移

（a）分離示意圖

（b）層析圖譜示意圖

t＝0

t t t

^N

t t

Migration time

b

detector

EOF

N

N N

N

a

(14)

2-2.3 電分散作用

樣品區帶和緩衝液之間導電度的差異會引起電分散作用，而使譜峰產生fronting 與 tailing 的現象。如圖 2-6（a）所示，當溶質區帶的電泳遷移率較緩衝溶液快時（即高電導、低電阻），則溶質區帶的譜峰前沿將會擴散而後尖銳（fronting）。相反地，當溶質區帶具有比緩衝溶液低的電泳遷移率時（即低電導、高電阻），則溶質區帶的譜峰前沿尖銳而後沿擴散（tailing），如圖 2-6（c）。當溶質區帶與緩衝溶液導電度相同時，則不會出現譜峰畸變現象，而譜峰以高斯曲線或標準偏差曲線的形式出現，為理想峰形，如圖2-6（b）[74-76]。

上述情形的發生必須待測樣品本身帶有電荷，亦即樣品本身具有導電度才會有影響。對於電中性的物質，則不受導電度差異的影響。

儘管這些譜峰畸變的情形經常發生，若導致解析度降低，則必需透過分析樣品及緩衝溶液的導電度調整，加以改善，若並不影響分離效率，則譜峰的扭曲變形，往往可以忽略。

(15)

圖 2-6 緩衝溶液與樣品的導電度不同，導致溶質的電分散作用

（a）分析物區帶的導電度較高

（b）分析物與緩衝液的導電度相近

（c）分析物區帶的導電度較低

buffer

sample zone

低電導高電導低電導

a b c

buffer buffer

sample zone

高電導低電導高電導

buffer buffer

sample zone

等電導

t=0 t=0 t=0

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2-2.4 分離效率及解析度

理論板數（N）是反應物質在固定相和流動相中動力學的重要層析參數，代表層析管柱分離效能的指標，毛細管電泳的分離效率與一般層析方法一樣，可用理論板數（N）當作指標：

2

2 / 1

54 .

5 ⎟⎟ ⎠

⎜⎜ ⎞

⎝

× ⎛

= W

N t

其中t 為物質的遷移時間；W_1/2為吸收峰半波寬。一般而言，毛細管電泳的理論板數在 10⁵~10⁶之間，比 HPLC 來得高。但實際上，

常因縱向擴散、焦耳熱所造成的溫度梯度、樣品吸附管壁、樣品進樣長度、溶質及緩衝液間導電度的差異等不同的因素而造成譜帶加寬和分離效率降低。一般常見可以提高分離效率的方法有︰將電壓調高、

使用內徑較小或較長的毛細管、降低分析樣品的濃度、降低毛細管的溫度、添加修飾劑減少管壁吸附現象…等。而解析度（R_S）可用來描述兩譜峰的分離情形

¹ ²

1

2

)

( 2

W W

t R

_s

t

−

= −

其中，t1及t2為溶質1 及 2 的遷移時間；W1及W2則為各別的吸收峰底部的寬度。在定量方法中，通常 R_S大於 1.5 表示兩譜峰以達基線分離。因此，在毛細管電泳的分離過程中，必須特別注意上述影響分離效率的因素，才能成功地分離樣品、增加分離效率及解析度。

(17)

2-3 毛細管電泳層析法的分離模式

毛細管電泳層析法的分離模式很多，但由於本實驗主要以添加界面活性劑的微胞電動毛細管電泳（MEKC）分離法為主，因此本處只簡述毛細管電泳層析法中最基本的毛細管區帶電泳層析法（CZE）及本研究所使用的 MEKC 法。並將其他毛細管電泳模式，列於表 2-2 中。

2-3.1 毛細管區帶電泳層析法（CZE）

CZE（capillary zone electrophoresis）是毛細管電泳法中最基本也是應用最廣的一種操作模式。其分離原理是在外加電場的存在下，分析物在毛細管內緩衝溶液中，因質量與有效電荷的差別，造成電泳遷移率的差異而達到分離的效果，故又稱自由溶液電泳（free zone electrophoresis）。如圖 2-5 所示，在通正高壓電場的情況下，正離子分析物運動方向和電滲流一致，會最先通過檢測器；中性物質本身在電場中不移動，則隨電滲流遷移但彼此不能分離；而負離子因其運動方向和電滲流相反，則在中性物質之後才被偵測到。

在CZE 中，可藉由改變電壓、溫度、緩衝溶液組成、pH 值、濃度及添加有機修飾劑等方法來改善分離效率。因為這個方法很簡便，

所以應用的範圍很廣，包括胺基酸的分析、蛋白質的純度分析、陰陽離子分析等等[77-80]。

(18)

2-3.2 微胞電動毛細管層析法（MEKC）

MEKC（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography）技術是由Terabe 等人在 1984 年首先提出。此一技術最大的特點在於兼具電泳與層析的特性，使毛細管電泳技術可同時分離離子型化合物及中性物質。

MEKC 的分離通常是在緩衝溶液中加入濃度大於臨界微胞濃度

（critical micelles concentration, CMC）的界面活性劑。如表 2-3 為常用的界面活性劑及其臨界濃度（74）。當一定數量的界面活性劑單體分子會聚集在一起，形成一個球體，稱為微胞（micelles）圖 2-7。

在水溶液中的微胞，其單體聚集的方式為疏水性的一端聚合而形成微胞的中心，親水性的一端則朝向水相。由於在緩衝溶液中有水相及微胞相同時存在，因此分析物可在水相和微胞相中有不同的分配比，而將分析物分離。如圖2-8 所示，在電泳的過程中，由於緩衝溶液在靠近管壁處會形成的正電荷，導致強大的電滲流產生而向負極移動，對於陰離子微胞（如 SDS 微膠粒）而言，因其外殼帶很大的負電荷，

使之往正極遷移，這與電滲流方向相反，因此陰離子微胞會最慢到達偵測器。分析物也會隨著本身疏水或親水的性質，以及與帶電荷微胞的靜電作用力，在水相與微胞相之間有不同程度的分佈（partition）。

在 MEKC 中，界面活性劑的選擇對分離的影響很大，因為不同的界面活性劑會產生不同的交互作用力、不同的溶解度以及不同的聚合數（aggregation number）和形狀，這些因素都會影響分離的選擇性。

(19)

圖 2-7 陽離子和陰離子微胞的示意圖

表 2-2 毛細管電泳層析法的分離模式

分離模式分離機制

毛細管區帶電泳法(CZE) Capillary zone electrophoresis

●分析物緩衝溶液中的電泳遷移率不同

微胞電動層析法(MEKC)

Micellar electrokinetic chromatography

●分析物與微胞間的相互作用力

毛細管凝膠電泳法(CGE) Capillary gel electrophoresis

●大小及電荷不同的分析物通過分子篩的難易度毛細管等電聚焦法(CIEF)

Capillary isoelectric focusing

●蛋白質分析物會在等電點的位置被聚焦

毛細管等速電泳法(ITP) Isotachophoresis

●分析物在兩種緩衝液造成的分離區帶中等速移動毛細管電色析層法 (CEC)

Capillary electrochromatography

●毛細管填充的靜相物與分析物間的交互作用

(20)

表 2-3 微胞電動毛細管層析法常用的界面活性劑

Biological detergents CMC

（mM）

臨界濃度

Aggregation number 分子聚集數

Anionic SDS DOSS

8.2

─

62

─ Cationic DTAB

CTAB

14 1.3

50 78 Non ionic Octylglucoside

n-Dodecyl-β-D-maltoside Triton X-100

─ 0.16 0.24

─

─ 140 Zwitterionic CHAPS

CHAPSO

8 8

10 11 Bile Salt Cholic acid

Deoxycholic acid Taurocholic acid

14 5 10-15

2-4 4-10

4

(21)

圖 2-8 MEKC的分離模式

S1及S2分別代表不同的溶質粒子，因與微胞產生作用力的不同，

而有不同的遷移速率（a）分離示意圖（b）層析圖譜示意圖

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

µ

eof

µ

mc

S

₂

S1

t=0

t

_eof

t

_S₁

t

_S₂

t

_mc

b

a Detector

mc

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

µ

eof

µ

mc

S

₂

S1

t=0

t

_eof

t

_S₁

t

_S₂

t

_mc

b

a Detector Detector

mc

(22)

2-4 毛細管電泳線上濃縮技術

毛細管電泳發展初期所使用的偵測器仍然是傳統層析技術的紫外光吸收法，但毛細管內徑比HPLC 管柱小很多，所以在樣品偵測極限上反而比較不好。因此有許多的科學家，致力於改善偵測極限的研究，常用的方法有下列幾種︰(一)將毛細管的光徑加大（81），例如使用 Z 形毛細管、直角毛細管，可增加吸收度；(二)利用多次反射槽 (multi-reflection cell)來增加光徑的距離，提高偵測靈敏度[82]；(三) 利用液相萃取或固相萃取的樣品前處理步驟，濃縮樣品的濃度[83]；

(四)使用功率較大的偵測器，例如使用雷射誘導螢光偵測器(Laser Induced Fluoresence, LIF)[84]，其偵測極限可達到 10^-10M 以下，但本身具有螢光性質的分析物並不多，通常分析物需經過衍生的處理步驟才能偵測；（五）或是採用複雜的使用技術，如電化學偵測法、質譜分析法，但這些方法都有較多的困難存在。

因此有人提出了另一種增加CE 靈敏度且較簡單的方法為線上樣品堆積技術[85-86]，用來降低偵測極限，此方法既有效又經濟。樣品堆積的方法是先增加樣品的進樣時間，使樣品的總進樣量增加，則樣品區間亦隨之變長，再透過樣品區間的聚集濃縮，提高樣品的濃度。

由於不需預先於實驗前進行樣品濃縮，而是在整個實驗過程中，同時達成樣品堆積與分離，稱此技術為線上濃縮（on-line concentration）。

樣品堆積技術可根據緩衝溶液間形成之界面移動方式歸納成兩大系統：（1）移動界面堆積（moving boundary staking）：所有樣品區帶是以相同速度移動與（2）靜相界面堆積（stationary boundary staking）：

由 Chien 與 Burgi[87]在 CZE 模式中對帶電粒子所導入的電場放大樣

(23)

品堆積技術（field amplified sample staking），其中樣品區濃度較低，

緩衝溶液濃度較高，兩者之間形成的界面在電泳分析期間是保持不動的。一旦施加高電壓，帶電粒子受到電場增強效應而速度增加，之後在樣品與緩衝溶液的交接處堆積。這是因為緩衝溶液導電度大、電場較小，帶電粒子至此速度驟減而堆積。

後來 Terabe 以及許多科學家努力研究[88-97]，提出中性分析物的樣品濃縮方法－正向堆積模式，並開發出在 MEKC 下數種不同的線上濃縮模式，如表 2-4 所示，以下僅介紹本實驗過程中所採用的毛細管電泳掃集法（sweeping-MEKC）

表 2-4 各種毛細管電泳線上濃縮的模式

正向堆積模式

（Normal Stacking Mode, NSM）

反向電極極性堆積模式

（Reversed Electrode Polarity Mode, REPSM）

反向遷移微胞堆積

（Stacking with Reverse Migration Micells, SRMM）

場強放大樣品注射

（Field-Enhanced Sample Injection, FESI）

反向遷移微胞之場強放大樣品注射

（Field-Enhance Sample Injection with Reverse Migration Micells, FESI-RMM）

反向遷移微胞與水之堆積

（Stacking with Reverse Migration Micells and Water Plug, SRW）

掃集堆積模式

（Sweeping-MEKC）

陽離子選擇性注入掃集堆積模式

（CSEI-sweeping-MEKC）

(24)

2-4.1 毛細管電泳掃集法(sweeping)

1998 年 Quirino 與 Terabe 消除了 EOF 存在時可能帶來的影響，

發展出一種稱為掃集法的 MEKC 線上樣品堆積技術。該堆積模式特色在於樣品基質與分離緩衝溶液間維持相等的導電度。機制為先在毛細管中注滿低pH 值，含有微胞的緩衝溶液（micellar backgrand solution, BGS）以降低電滲流值幾近於零，然後進樣一段樣品基質，再將毛細管柱兩端置於BGS 溶液中，通高壓電後，來自 BGS 的微胞在電壓作用下會進入樣品區，當微胞經過樣品基質時，會與分析物結合，並將分析物掃集至一個狹窄的濃縮區。此過程就稱為掃集（sweeping），

當微胞通過樣品基質區以後，就以一般的 MEKC 模式，完成電泳分析。

分析物依據和微胞分布係數的不同與微胞結合，與微胞結合度越強的分析物，掃集的效果就越好，相對的，與微胞結合度差的分析物，

所堆積的譜帶較寬，分離效率較差。

一般而言，利用毛細管電泳掃集法可降低大約 3～4 個級數的偵測極限，可用來改善紫外光偵測器在低濃度的樣品分析時，無法偵測到訊號的缺點。

(25)

micelles >0 micelles=0

sample

concentration zone micelles=0

a

b

c

injection

detector

圖 2-9 毛細管電泳掃集模式

（a）毛細管內充滿酸性含有微胞的緩衝溶液(BGS)，將樣品配在導電度與緩衝溶液相同的基質中，進樣至毛細管中

（b）通負電進行電泳，微胞進入毛細管，與分析物結合開始掃集

（c）微胞通過樣品區帶後，以一般MEKC模式，完成電泳分析

(26)

2-5 77 K 低溫螢光光譜分析法

1960 年，Shpol’skii[98-99]等研究者首先發現利用長鏈的烷類（如 n-alkane）當作溶劑來測量有機化合物時，尤其是多環芳香族化合物

（PAHs），由於長鏈烷基在低溫時會形成 glasses（晶格狀），恰可將 PAHs 包住，使 PAHs 的分子與分子之間無法相互作用，電子的能量無法傳遞，只能利用螢光或磷光的形式放出，因此可增強螢光或磷光的強度，而可觀測到相當窄（高解析度）的譜線。並可由每個譜線間的差異得知分子各個振動能階的量值。所以，他們把這種在低溫下以長鏈烷類為基質的螢光光譜稱為 Shpol’skii 低溫光譜。因為室溫環境下螢光光譜振動譜寬太大（~50nm），僅能提供相當有限的振電躍遷的光譜資訊，而在液態氮（77 K）的溫度下，光譜的頻寬為 10-30 cm^-1，在液態氦（4.2 K）的溫度下，光譜頻寬更窄，可降至 1-10 cm^-1左右。

因此在低溫下，光譜的解析可以相當的窄（又稱 quasi-lines）[99]，

可以清楚的獲知分子的各個振動能態。圖2-10 為分子在室溫（如圖 a）

及0 K（如圖 b）時的振動能階示意圖。當電子吸收固定能量後，會躍遷至激發態，再經由緩解作用，以不同的方式放出螢光、磷光，甚至於以熱能形式放出。但由於在室溫下，分子的量子分佈呈現波茲曼分佈，並非全部都處於基態，所以當分子激發至激發態而放出螢光時，是以帶狀光譜的形式呈現，根本無法解析出分子的細微能階。但是，若將溫度降低至液態氮的溫度（77 K）甚至液態氦的溫度（4.2 K）

時，且溶於長鏈烷類基質或在低溫之下足以形成較佳晶格的溶液中，

則分子在基態的電子分佈範圍可較為一致，因此放出的螢光譜線較窄，可以得到較細微的電子振動能階資訊。

(27)

圖2-11 為 trans-resveratrol 溶於乙醇的室溫及 77 K 低溫螢光光譜 之比較。在室溫下測得的螢光光譜譜峰相當寬廣，且螢光量子產率

（ΦF）僅有0.05，為弱螢光性物質。但是將溫度降到液態氮的溫度時

（77 K），螢光量子產率驟增為 0.75，螢光強度明顯的增強，且容易觀測到清晰的譜峰。由於降低溫度可使化合物展現其特定的譜峰，因此對於相似異構物而言，藉由譜峰位置及強度的相對關係，可供給最佳的光譜指紋比對作為精確定性分析之用。

本研究結合毛細管電泳sweeping-MECK 以及 Shpol’skii 的低溫螢光光譜法的好處，發展出獨創的毛細管電泳掃集濃縮／77 K 低溫螢光光譜分析法，以電泳濃縮分離、瞬間冷卻、on-line 取得低溫螢光光 譜進行分析為實驗步驟，針對葡萄酒中 trans-resveratrol 化合物進行分 析研究，不僅可使分析物螢光強度增強，更可獲知更多更明顯的譜峰以供光譜指紋（spectral fingerprint）比對。

Laminar flow

EOF

Laminar flow

a b

EOF

Laminar flow

a b

a b

= 6 πη ×

πη

HV Detector

buffer

buffer sample

capillary

HV Detector

buffer

buffer sample

capillary

= ×

= 6 πη µ

ψ

ψ

ψ

ψ

ψ

r（μm）

ψ

ε ζ = 4 πδ ×

η ζ

µ

= ε ×

a

b

c

EOF

a

b

c a

b

c

EOF

EOF

影響因素 電場強度

緩衝溶液 pH

離子強度或緩 衝溶液濃度

溫度

有機修飾劑

表面活性劑

中性親水高分 子聚合物 共價鍵結

結果

●電滲流呈比例變化

●低 pH，EOF 降低

●高 pH，EOF 增加

●增加離子強度，zata 下降，

EOF 下降

●每℃黏度變化 2~3%

●改變 zata 電位及黏度，一般 使 EOF 下降

●透過疏水性或離子相互作 用吸附於毛細管壁

●透過疏水性相互作用吸附 於毛細管壁

●化學鍵結於毛細管壁

說明

●場強降低可能引起分離效率和 解析度下降

●場強增加可能引起焦耳熱

●改變 EOF 最方便有用的方法

●可能改變溶質的電荷或結構

●高離子強度產生較大電流引起 焦耳熱

●低離子強度產生樣品吸附問題

●樣品導電度不同引起譜峰變形

●低離子強度降低樣品堆積效果

●若由儀器控溫，改變溫度是有效 的方法

●變化複雜，需透過實驗確認

●可能改變選擇性

●陰離子表面活性劑增加 EOF

●陽離子表面活性劑減少 EOF 或 使之改變方向

●改變選擇性

●通過覆蓋表面電荷和黏度增加 降低 EOF

●多種可能影響(親水性或帶電性)

●穩定性常有問題

t＝0

t t t

ε ζ = 4 πδ ^×

= ε ^×

影響因素電場強度

離子強度或緩衝溶液濃度

中性親水高分子聚合物共價鍵結

●改變 zata 電位及黏度，一般使 EOF 下降

●透過疏水性或離子相互作用吸附於毛細管壁

●透過疏水性相互作用吸附於毛細管壁

●場強降低可能引起分離效率和解析度下降

●高離子強度產生較大電流引起焦耳熱

●若由儀器控溫，改變溫度是有效的方法

●陽離子表面活性劑減少 EOF 或使之改變方向

●通過覆蓋表面電荷和黏度增加降低 EOF