第二章、 實驗部分
2-1 藥品及儀器
1. 碳六十：購自 Material and Electrochemical Research
2. Anti-Human IgG，Human IgG，Bovine serum Albumn 購自 sigma 3. Hemoglobin，Anti-hemoglobin，Gliadin，Anti-gliadin:購自 sigma 4. urea，uric acid，ascorbic acid，cystein，galactose，tyrosine 購自 sigma 5. methanol，ethanol，propanol，benzaldehyde，ammonia，phenol，
propanal，acetone 購自 Acros
2-2 實驗原理及目的
免疫分析技術主要是利用抗體和抗原間的專一性結合；本實驗利 用二次抗體(anti-IgG)和碳六十的結合，將碳六十/抗體(anti-IgG)固定 於石英晶片上，藉由自製的石英壓電系統來觀察碳六十及二次抗體
(anti-IgG)的結合。再將此探六十/抗體(anti-IgG)石英晶片用來偵測溶 液中之抗體(IgG)。此外，本實驗亦希望藉由石英壓電感測器偵測麥 膠蛋白抗體(anti-gliadin)及血紅蛋白抗體。將碳六十/麥膠蛋白固定於 石英晶片上，利用石英壓電感測器偵測麥膠蛋白抗體(anti-gliadin)。
偵測血紅蛋白的方法亦相同。
2-3 石英晶體的處理
本實驗室使用的石英晶片為市售 10MHz 之晶體，規格為 TXC，直徑 9mm，銀電極直徑 4.5mm，厚 0.18mm 之圓形 AT-cut 石 英晶片。外以金屬殼保護，使用前用鉅子將外殼鋸開取出晶片。
圖 2-1 石英晶片簡圖 Fig.2-1 Quartz crystal
2-4 石英晶體表面塗佈液(coating solution)
配製表面塗佈液，首先要考慮溶劑的選擇，適當得溶劑應具備：
(1) 易揮發，能完全乾燥不殘留 (2) 能適度溶解所塗佈的物質 (3) 最好是常見易取得
(4) 低毒性
本實驗塗佈配製液的過程：
取 10 mg 之黑色碳六十粉末攪拌溶於 10 mL 之甲苯溶解製成碳 六十溶液，因甲苯對碳六十有良好的溶解度，且本身也具有揮發性，
故使用甲苯為溶劑，碳六十的甲苯溶液其液體呈紫色。並將此液體置 於褐色瓶中保存。
2-4-1 表面塗佈法
石英壓電晶體的塗佈方式可分為手工塗佈及機械塗佈，為了使塗
佈物質均勻的附著在電極表面上，本實驗選擇用機械塗佈法之旋轉塗
佈方式，如圖 2-2。其操作是將空白的石英晶片放置旋轉軸上，調整
面版上的轉速(約 10cycle/sec)，再以微量針筒吸取碳六十塗佈液(0.2
μL)，滴於電極上，旋轉塗佈完成後，甲苯揮發後可留下碳六十在石
英晶片的表面。另一面亦以相同的方式塗佈。在塗佈前紀錄石英晶片
頻率值，且在塗佈後亦記錄石英晶片的頻率值，將石英晶片塗佈前後
的震盪頻率差值代入 Sauerbrey equation 計算後，即可得到石英晶片
的塗佈量。
2-5 實驗系統
本實驗利用 QCM 系統。QCM 主要包含有 74LS04 震盪線路、
74LS74、TC 9400 之頻率-電壓轉換器(工作範圍 0-100kHz)、電壓放 大器(OPA)、PI-216 high speed 12 bit 之類比/數位轉換器(A/D)及電 腦。使用石英壓電晶體以 74LS04 來啟動振盪，再以 10MHz 固定頻 率的振盪器 (oscillator) 做為參考頻率，經 74LS74 可得到約 10MHz 之固定頻率與石英晶體振盪頻率的差值，經 TC9400 轉換器得一電壓 訊號，再經 OPA 相減放大後，連接電腦，利用程式顯示於電腦，以 軟體 origin 6.0 處理分析數據。
圖 2-2 旋轉塗佈裝置 Fig.2-2 Spin coating system
power vacuum
start
emergency stop clean
spin rate
2-5-1 石英壓電晶體靜相實驗系統
本實驗中所使用的靜相壓電系統，將以旋轉塗怖法塗佈好碳六十 (1.4μg)的石英晶片，置入玻璃製的工作槽(20 mL)中，接著注入預偵 測的物質，由頻率變化觀察物質的吸附情形，經一段時間後，反應達 平衡，頻率不再變化，測得反應後頻率值與起始頻率差值。即可之知 反應的變化情形，實驗系統裝置如圖 2-3。
圖 2-3 石英壓電晶體之液相實驗系統
Fig.2-3 Experimental set-up of the piezoelectric crystal static detection system
Circuits of Oscillator Reference Crystal
74LS74
A/D conventer 9400 F/V
OPA
C coated crystal stirrer
water
inject enzyme solution
60
2-5-2 石英壓電晶體動相實驗系統
為了瞭解石英晶體的吸附狀況屬物理吸附或化學吸附，因此在本 實驗中設計了一個脫附裝置，若能完全脫附，則表示其吸附情形為物 理吸附；若不能完全脫附則表示，則有化學吸附的產生，因為化學吸 附為塗佈物與反應物之間有化學鍵結產生，所以以水流脫附是無法打 斷這個鍵結。實驗裝置如圖 2-4。
圖 2-4 石英壓電晶體的液相脫附裝置
Fig.2-4 Experimental set-up of piezoelectric crystal desorption system
inject antibody solution
waste Circuits of O scillator
Reference Crystal
74LS74
A/D conventer 9400 F/V
O PA
C 60 coated crystal stirrer
desorption cell
sample injection
2-6 實驗步驟
2-6-1 碳六十與抗體間作用力之研究
1. 將一 10M Hz AT 型石英晶片外殼鋸開，取 0.2μL 碳 六十(1 mg/mL)以旋轉塗怖法塗佈於石英晶體電極表 面。
2. 將此石英晶體接上自組的電子線路(圖 2-4)(包含振盪 線路、頻率/電壓轉換器、類比/數位轉換器之微電腦介 面)來記錄頻率變化。
3. 將石英晶體浸入已置 20 ml 溶液之工作槽中，待振盪 頻率穩定。
4. 頻率達一穩定值後，以注射針於工作槽側方注入 0.2ml 抗體溶液(Anti-IgG)，觀察其頻率變化。
5. 待頻率下降至一穩定值，於脫附系統中注入脫附液，
觀察其頻率變化。
6. 若碳六十與抗體間屬於化學吸附，於反應平衡時通入
大量的去離子水，將無法脫去吸附於碳六十表面的抗
體。若為物理吸附，便能以水洗去表面的抗體，使石
英晶片回復至起始值。
2-6-2 Anti-IgG 抗體和 IgG 抗體之研究
已吸附 C60-Anti-IgG 之石英晶片經過清洗之後，再將此晶片浸於 胎牛血清蛋白(BSA)中，利用胎牛血清蛋白覆蓋石英晶片未專一性結 合部位。此晶片再置入工作槽中。待頻率穩定之後，注入 IgG 抗體溶 液，觀察其頻率變化。實驗步驟如圖 2-5。
電極 石英晶體
電極 石英晶體
C60/Anti-IgG
C60/Anti-IgG
電極
