行政院國家科學委員會補助專題研究計畫成果報告
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人類角質層脂肪分子排列之探討
Molecular Organization of Human Startum Corneum Lipids
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計畫類別：V 個別型計畫
□整合型計畫
計畫編號：NSC89－2314－B－006－187－
執行期間：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日
計畫主持人：許漢銘
共同主持人：蔡瑞真，郭國華。張憲彰
協同主持人：王德華
協同研究人員：吳靖宙，陳姝妙
本成果報告包括以下應繳交之附件：
□赴國外出差或研習心得報告一份
□赴大陸地區出差或研習心得報告一份
□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份
□國際合作研究計畫國外研究報告書一份
執行單位：國立成功大學醫學院皮膚科
中
華
民
國
90 年
10 月
31 日
行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
計畫編號：NSC89－2314－B－006－187－ 執行期限：89 年 8 月 1 日至 90 年 7 月 31 日 主持人：許漢銘 國立成功大學醫學院皮膚科 共同主持人：蔡瑞真 國立成功大學醫學院臨藥所 郭國華 高雄醫學大學生物化學研究所 張憲彰 國立成功大學醫功工程研究所 計畫參與人員：吳靖宙 國立成功大學醫功工程研究所 陳姝妙 國立成功大學醫學院皮膚科 一、中文摘要 角 質 細 胞 間 隙 之 垂 直 厚 度 大 約 只 有 50~100nm，但是一個角質細胞與皮膚面平行的面積 大約是 1000μm2，目前人類對於角質層脂肪障壁 形態結構之研究僅及於上述垂直面而對於佔絕大 多數面積之平行面尚未有文獻加以探討，導致無法 由形態學之觀點來解釋許多經皮吸收之重要生理 現象。本計畫最主要之目的，即嘗試利用 ruthenium tetroxide 染色下的電鏡觀察，及配合原子力顯微鏡 和共軛焦顯微鏡，在不同切面下，由縱切、橫切及 斜切各種不同的層面來探討角質細胞間脂肪分子 之排列，以期能由對形態結構之釐清，而對 skin barrier 之功能有更進一步深入的瞭解。結果顯示人 類角質層脂肪分子的排列，無論在那一方向，皆呈 現規則之寬-窄-寬排列，顯示其具有優良之障壁功 能，但同時亦存在少數較不具障壁功能之相同寬度 或非定形排列之脂肪分子，後兩者在正常生理功能 或疾病狀態下所扮演之角色，直得進一步研究。 關鍵詞：角質層、脂肪分子、表皮滲透性障壁 AbstractThe corneocytes is a flat, hexagonal structure with a surface area of about 1000 µm2, and the thickness of the extracellular lipid bilayers is about 50-100 nm. At present, we have only fragmentary knowledge of the actual lipid barrier structures and its detail function. In the present work, we examined the molecular organization of the stratum corneum lipid by confocal microscopy, electron microscopy using ruthenium tetroxide staining and atomic force microscopy. The results revealed that the most frequently observed basic unit pattern was broad-narrow-broad lucent bands of repeating pattern measuring approximately 4nm-2nm-4nm, whereas uniform lucent bands or amorphous aggregations of lipids were also present. These morphological observations may provide some new information for understanding the barrier function of the human stratum corneum.
Keywords: stratum corneum, lipids, epidermal
permeability barrier 二、緣由與目的 角質層位於身體最外層，是陸棲的人類維持 生命所必須的一層薄膜，它主要的功能在於隔離 外界有害物質並讓水分保持於體內。 角質層大約是由 15%的水、70%蛋白質及 15%的脂肪所組成，它主要是由兩個部分所構成， 一個是內含角質蛋白的角化細胞（corneocyte）， 另一是位於角質細胞間的脂肪分子，它主要含有 ceramides (45%), cholesterol(25%)及 fatty acids (15%) (1),目前已知角質細胞間空隙是經皮水分散 失及物質經皮吸收的主要路徑。雖然 Breathnach 等學者在 1973 年利用 freeze fracture electron microscopy 已發現角質細胞間之脂肪分子形成多 層膜狀之排列(2)，但是一直要到 1987 年 Madison 等學者利用 ruthenium tetroxide 染色法(3)，才清楚 地觀察到脂肪分子在角質細胞間真正之分子排 列，而開啟了近年來對角質層脂肪分子排列之研 究熱潮。另一方面，x-ray diffraction, NMR, FTIR 及 atomic force microscopy(4-7)之研究亦顯示角質 層脂肪分子基本上為晶形之結構，此與上述形態 學上之研究有一致性之結果；但是目前對於脂肪 障壁結構之知識，仍然無法解釋許多角質層的生 理現象，由於人類角質層脂肪分子屬於長炭鏈 (C>20)之飽和脂肪酸，因此若完全呈晶形狀態排 列，將形成一完全不透水性之障壁，此與實際上 人類 EPB 能讓少量水分(4~10/m2/hr)經皮蒸發之生 理現象不一致；近年來 Forslind 提出一新模式 “Domain Mosaic Model”來解釋水分經皮散失及外 來物質經皮吸收之現象(8-10)，其基本架構為角質 細胞間之脂肪分子排列主要以規則排列之
crystalline/gel phase 存在，因此為不透水性，其間 則夾雜 liquid crystalline state（液晶）之脂肪分子， 體內水分的蒸發或外來物質（如保濕劑、清潔劑 等）的經皮滲透則沿液晶部分，以隨機不規則之 路徑移動，此一模式同時考慮到脂肪分子結構及 生理功能間密切之關連性，為繼“brick and mortar” model 後，有關角質層脂肪分子結構最大的進展之 一，然而 Domain Mosaic Model 雖然能解釋許多生 理及藥理動力學現象，卻缺乏形態學上之證據； 1997 年 Menon 及 Elias(11)提出 extracellular lacunar domains 可能是極性與非極性物質經皮吸收的主 要孔道(pore pathway)，然而此孔道並非液晶結構 之脂肪分子，而是被認為源於 desmosome，此顯示 Domain Mosaic Model 需加以修正或尚有其他未知 之結構做為經皮吸收或水分蒸發之孔道；另外最 近 Sznitowska 等學者(12)之研究認為角質層存在 兩種不同之路徑，一種為親脂性路徑，另一種則 為佔少數的親水性孔道；以上之推測是根據他們 由藥理學經皮吸收之數據所做之推論，但目前此 一觀點並沒有被廣泛的接受，最主要的原因在於 它缺乏形態學上之證據；最近 Forslind 亦言，目前 我們對於角質層脂肪障壁形態結構及其詳細之功 能只有片段性之瞭解(13)；一般而言一個角質細胞 周圍大致約有 5∼6 層之脂肪膜狀結構，角質細胞 間之垂直厚度只有 50∼100nm，但其與皮膚面平 行的面積大約是 1000μm2，其間並夾雜 desmosome 及一些未知之結構，而目前對於垂直面 之脂肪分子排列已有大致之瞭解，但是對於水平 面之形態結構尚未有文獻加以探討，而此一部份 佔有角質細胞間最大之比率，也正是我們找尋上 述各種 Model 之形態學證據最重要之部分。 本計畫最主要之目的，即嘗試利用 ruthenium tetroxide 染色下的電鏡觀察，及配合原子力顯微鏡 和共軛焦顯微鏡，在不同切面下，由縱切、橫切 及斜切各種不同的層面來探討角質細胞間脂肪分 子之排列，以期能由對形態結構之釐清，而對 skin barrier 之功能有更進一步深入的瞭解，因為形態 與功能是一體之兩面，兩者之關係密不可分。而 角質細胞間形態結構的研究，當有助於我們對外 來物質經皮吸收及水分蒸發之路徑及機轉的瞭 解，並可將之應用於臨床外用藥劑、保濕劑之經 皮吸收之探討，及異常角質層病態機轉之研究。 三、結果與討論 以 Nile Red 之中性脂肪染色法，利用共焦掃 瞄顯微鏡(Confocal microscope)之觀察，人類角質 層之脂肪無論身體任何部位，皆可見存在於角質 細胞之間 (Fig. 1a&b)，而形成 Michaels 等提出的 所謂 “bricks and mortar”(磚塊與泥漿)之結構，其 中磚塊是指角質細胞，而泥漿則為角質細胞間的 脂肪分子。為了進一步觀察脂肪分子之排列，我 們以 Ruthenium tetroxide (RuO4) 固定法染出脂肪 分子，以不同之切面，包括縱切、斜切及橫切， 在電子顯微鏡下來觀察不同角度之脂肪分子排 列，結果顯示角質層之脂肪分子存在於角質細胞 間 50∼100nm 之狹小空隙，在與皮膚面垂直之脂 肪分子排列主要呈現平行之脂肪膜狀結構，以寬-窄-寬之透明間隔(4nm-2nm-4nm)組成(Fig. 2)，此種 寬-窄-寬之排列，最近已有文獻證實與長碳鏈之 ceramide 1 的存在有密切觀係(14)；在體外之研究 顯示，寬-窄-寬之脂肪膜狀排列較傾向晶體狀態， 其重要性在於在防止水分通透的功能上明顯優於 液晶狀態的細胞膜，後者之脂肪分子分佈呈現不 規則，凌亂的排列，因此無法有效率的阻擋水分 的通透(14)，因此角質層脂肪分子排列的特殊性讓 它成為一非常有效率之水分通透障壁，而人類也 才有機會生存於乾燥之陸地。但是另一方面，對 於與皮膚面平形之水平面的脂肪分子排列，目前 尚未有文獻報告，一般認為在水平面的脂肪分子 排列類似細胞膜，也是呈現不規則，凌亂的排列； 而我們的觀察則有不同的結果，無論是斜面或水 平面，脂肪分子仍然呈現規則之排列(Fig. 3a)，且 維持寬-窄-寬之透明間隔(Fig. 3b)；若以 3M 膠帶 將角質細胞撕開，暴露出脂肪層，直接在原子力 顯微鏡(AFM)下觀察，同樣可以觀察到水平面的脂 肪分子呈現規則之排列(Fig. 3c)；因此綜合以上電 子顯微鏡及原子力顯微鏡之觀察，角質層脂肪分 子的排列，無論在那一方向，皆呈現規則之排列。 雖然以上寬-窄-寬之脂肪膜狀排列形式佔正常角 質層之絕大多數，在有些位置，仍然可以觀察到
另兩類較為少見之脂肪分子排列。一類之脂肪分 子亦為規則之平行脂肪膜狀排列，但具相同之透 明間隔(Fig. 4&5)，即沒有所謂的寬-窄-寬之排列， 此種形態結構常見於手掌、足底；最近在體外之 實驗顯示，此種相同間隔排列之脂肪分子傾向於 液體狀態(14)，也就是說其障壁功能劣於寬-窄-寬 排列之晶體狀態，此亦意謂足底及手掌之障壁功 能較差；另外，我們的研究亦顯示在疾病狀態如 乾癬之角質層也是以此種排列為主，此與乾癬障 壁功能之異常應有密切之關係。另一類之脂肪分 子為非定形之排列(Fig. 6)，此種情形在正常角質 層較為少見，但是正常皮脂(sebum)及脂肪細胞 (lipocyte)則全為此種非定形排列(15)，上述情形亦 可在紅皮症型乾癬、刺激型皮膚炎及有機溶劑處 理後之角質層觀察到(16)，就目前所知，唯有形成 平行脂肪膜狀排列者才具障壁功能，因此非定型 之脂肪分子排列應不具障壁功能。綜合以上之結 果，人類角質層脂肪分子的排列，無論在那一方 向，皆呈現規則之寬-窄-寬排列，顯示其具有優良 之障壁功能，但同時亦存在少數較不具障壁功能 之相同寬度或非定形排列之脂肪分子，後兩者在 正常生理功能或疾病狀態下所扮演之角色，直得 進一步之研究。 四、計畫成果自評 本計畫於執行期限內建立角質層脂肪分子三度 空間之排列；由以上之研究，確立人體表皮滲透 性障壁(Epidermal Permeability Barrier: EPB) 之形 態學基礎。由於表皮滲透性障壁在皮膚生理、經 皮物質之吸收以及一些重要的皮膚疾病，如乾 癬、異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎等皆扮演重要 之角色，我們期望能經由本研究之結果，將來進 一步在探討外用藥劑之經皮吸收及肥皂、界面活 性劑等刺激物對皮膚之作用機轉，以及乾癬、異 位性皮膚炎、接觸性皮膚炎等異常角質層病態機 轉之研究及臨床治療上，能有更好的進展。 五、參考文獻
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