國立宜蘭大學食品科學系（研究所）碩士論文 Department of Food Science National Ilan University Master Thesis

(1)

國立宜蘭大學食品科學系（研究所）

碩士論文

Department of Food Science National Ilan University

Master Thesis

不同成熟度金柑抗氧化活性及其有效成分之研究

Studies on Antioxidant Activities and Functional Constituents of Kumquat with Different Maturities.

指導教授：駱錫能博士

Shyi-Neng Lou, Dr. rer. nat.

研究生：江佩錚

Pei-Jheng Jiang

中華民國九十六年七月

(2)

摘要

本研究以宜蘭縣員山鄉地區所產之不同成熟度的長實金柑

（Fortunella margarita Swingle , FMS）與圓金柑（Fortunella japonica Swingle, FJS）為原料，將新鮮果實區分成果皮與果肉兩部份，分別探討其抗氧化能力及相關物質含量之變化，藉以了解抗氧化活性物質在金柑抗氧化力上所扮演之角色與其在加工過程中可能之變化。

實驗結果顯示，金柑果皮及果肉清除DPPH 自由基能力為甲醇萃取物>水萃取物>乙酸乙酯萃取物。圓金柑果皮與果肉甲醇萃取物之還原力、DPPH 自由基清除能力與亞鐵離子螯合能力，均較長實金柑為佳。

長實金柑果皮萃取物之 DPPH 自由基清除力隨著成熟度的增加明顯下降，而以成熟度 30%的圓金柑效果最好，其能力達 92.2%。果皮萃取物的螯合亞鐵離子能力明顯大於果肉 3 至 7 倍之多，顯然，圓金柑果皮具有較佳之抗氧化能力。

而不同成熟度的金柑成分分析結果顯示，總多酚含量介於 653.91-2132.42 mg/ 100g，總類黃酮為 82.53-1351.40 mg /100g，及總類胡蘿蔔素含量介於2.45–72.03 mg/100g 之間，均為圓金柑含量高於長實金柑，果皮含量高於果肉。花青素含量則在 15.97mg/100g 以下，亦以圓金柑果皮為最高。總多酚含量隨成熟度增加而減少，圓金柑果皮總類黃酮則隨成熟度增加而大幅增加。而圓金柑果皮花青素在 50%成熟度時最高，而成熟度 70%之後，果肉則中未檢出。總類胡蘿蔔素含量以成熟度 30%的圓金柑果皮含量為最高，含量隨成熟度增加而先減再增至完熟之65.36 mg/100g。

此外，金柑之醣類組成為葡萄糖、果糖與蔗糖，其含量分別介於

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金柑中含微量之酒石酸與蘋果酸，果皮之有機酸組成主要為草酸與抗壞血酸，其含量分別介於 267.14-511.46 mg/100g 及 221.08-1013.88 mg/100g 之間，隨果實之發育，果皮中抗壞血酸的的含量逐漸減少。果肉的有機酸組成主要為草酸、抗壞血酸與檸檬酸，其含量分別為 259.12-438.87 mg/100g、86.23-407.93 mg/100g 以及 1034.01-3409.17 mg/100g，抗壞血酸與檸檬酸的含量隨金柑成熟的增加而逐漸減少。

長實金柑中類黃酮含量以 Diosmin 含量最高，其次為 Quercertin，

其含量分別介於40.31-70.93 mg/100g 和 32.97-42.40 mg/100g 之間，以成熟度 50%的果皮中含量最高。而圓金柑則以 Hesperidin 含量最高，

其次為Neohesperidin 與 Quercertin，其含量分別為 2.57-65.51 mg/100g、

4.29-49.80 mg/100g 以及 14.33-42.35 mg/100g 之間，以成熟度 30 %之果皮所含 Hesperidin 含量為最高。不同成熟度長實金柑之總多酚、總類黃酮與總類胡蘿蔔素等與其 DPPH 自由基清除能力之相關性密切。而圓金柑果皮之 DPPH 自由基清除能力與其有機酸與總類胡蘿蔔素含量有較密切的關係（P < 0.05）。

此外，長實金柑在製成蜜餞的過程中，其清除DPPH 自由基之能力由生鮮產品之 90.32%持續下降至成品的 48.95%，總類黃酮含量亦由 294.89 mg/100g 減少至 138.45mg/100g，兩者間呈現正相關，相關係數 r = 0.9094。分析結果顯示糖漬加工過程是造成類黃酮流失的主要步驟，主要流失的成分為Diosmin 及 Quercetin。

綜合以上可知，長實金柑與圓金柑果皮甲醇萃取物具有良好的抗氧化能力，可能與其類黃酮含量有關，此外，就自由基清除能力而言，

生鮮金柑較加工產品為佳，此點可提供業者加工製程改良之參考。

關鍵字：長實金柑、圓金柑、成熟度、抗氧化活性、類黃酮

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Abstract

The purpose of this study were to determine the levels of bioactive compounds and the antioxidative ability of （Fortunella margarita Swingle and Fortunella japonica Swingle with different maturities. The results showed that the order of DPPH radical scavenging activity were methanol extract >water extract >ethyl acetate extract, the following experiments, therefore, were carried out by methanol extract.

The reducing power, scavenging activity of DPPH radical and Fe²⁺

chelating power of FJS were higher than those of FMSThe scavenging effects on DPPH radical of extract from peel decreased during the increasing maturity degree of FMSMethanol extract of FJS with 30%

maturity had the highest radical-scavenging activity(92.2%). Chelating effects on Fe²⁺ of extracts from peel was 3 to 7 times of that from pulp.

Collectively, the peel from FJS extracts showed higher antioxidant activities than pulp.

The contents of total polyphenol, total flavonoids and total caroteneoids were distributed from 653.91-2132.42 mg/ 100g, 20.02-450.47 mg /100g, and 2.45–72.03 mg/100g, respectively.The levels of these three components of FJS were higher than those of FMS, while those of peel were higher than those of pulp. The contents of total anthocyanin were lower than 15.97mg/100g. The total polyphenol contents decreased and the total flavonoids increased along with the increasing of maturity of kumquat. The peel of FJS with 50% maturity had the highest contents of total anthocyanin, however, no anthocyanin was with maturity above 70%. The peel of FJS with 30% maturity had the highest contents of the caroteneoids contents and which reduce and than increase along with the increasing of mature degree of kumquat.

(5)

The contents distributed from 0.02-0.18 mg/mg, 0.02-0.20 mg/mg and 0.00-0.26 mg/mg, respectively. The levels of total sugar of FMS were more than which of FJS, and the contents of peel were higher than that of pulp, which increase along with the increasing of Maturity of FJS The main organic acids in peel of kumquat were oxalic acid and ascorbic acid, which contents distributed from 267.14-511.46 mg/100g and221.08-1013.88 mg/100g, respectively. The tartaric acid and malic acid were also found in kumquat with low magnitude. The ascorbic acid contents of peel reduce along with the increasing maturivity of kumquat. Oxalic acid, ascorbic acid and Citric Acid were the main organic acids in the pulp of kumquat , witch contents distributed from 259.12-438.87 mg/100g, 86.23-407.93 mg/100g and 1034.01-3409.17 mg/100g , respectively. Ascorbic acid and citric acid contents of peel reduce along with the increasing maturity of kumquat.

Diosmin and quercertin were the higher level of flavonoids in FMS Both of its contents distributed from 40.31-70.93 mg/100g and 32.97-42.40 mg/100g, respectively. The peel of FMS with 50% maturity had the highest contents of these two flavonoids. And then hesperidin was the highest concentration of flavonoids in FJS, and next were neohesperidin and quercertin. All of its contents distributed from 2.57-65.51, 4.29-49.80 and 14.33-42.35 mg/100g, respectively. The peel of FJS with 30% maturity had the highest contents of hesperidin. There was a strong correlation between Scavenging effects on DPPH radical and total polyphenol contents, Total flavonoids contents, the caroteneoids contents of the extracts from FMS with different maturities. And the correlation between Scavenging effects on DPPH radical and organic acid contents and Total caroteneoids contents of the extracts from FJS with different maturities wrew also significance.

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in fresh FMS fruit to 48.95% in final product during the process of candied fruit, and total flavonoids contents decrease from 294.89 mg/100g to 138.45mg/100g. In this result, a positive correlation (r=0.9094) was found between DPPH radical scavenging effects and total flavonoids contents. It wsa found that sugaring is the major step of resulted in the loss of flavonoids, especially Diosmin and Quercetin.

Collectively, the results of present study indicated that the extracts from peel and pulp of kumquat contained large amounts of flavonoids and exhibited a strong antioxidant activity. The extracts from fresh fruit had higher DPPH free radical scavenging activities than processing product from kumquat.

Key words：Fortunella margarita Swingle, Fortunella japonica Swingle , Maturity, antioxidative activity, Flavonoids.

(7)

目錄

摘要 ... II 英文摘要 ... 錯誤! 尚未定義書籤。

目錄 ... VII 表目錄 ... IX 圖目錄 ... XI

壹、前言 ... 1

貳、文獻整理 ... 3

ㄧ、金柑 ... 3

（一）金柑品種... 3

（二）產量及其分布... 4

（三）開花習性及果實成熟情形... 7

（四）藥理特性與食療... 8

（五）相關研究... 9

二、抗氧化機制與相關物質 ... 12

（一）抗氧化機制... 12

（二）植物抗氧化相關物質... 13

三、柑橘類之類黃酮 ... 21

（一）Flavonoids 的基本結構... 21

（二）類黃酮之分類與飲食來源... 22

（三）柑橘類類黃酮之生理活性... 27

叁、材料與方法 ... 32

ㄧ、實驗架構 ... 32

二、材料 ... 33

（一）金柑... 33

三、藥品及器材 ... 35

（ㄧ）藥品... 35

（二）器材... 35

四、實驗方法 ... 36

（一）不同萃取條件之影響... 36

（二）抗氧化活性測定... 36

（三）一般成分測定... 38

（四）抗氧化相關成分分析... 39

五、抗氧化有效類黃酮之分析 ... 42

（ㄧ）類黃酮組成分之分析... 42

(8)

六、金柑蜜餞加工過程的類黃酮與抗氧化性變化 ... 44

肆、結果與討論 ... 46

一、不同萃取條件對金柑萃取物清除 DPPH 能力之影響 ... 46

（ㄧ）不同萃取溶劑之影響... 46

（二）萃取方式之影響... 47

二、不同成熟度金柑抗氧化特性之比較 ... 47

（ㄧ）清除 DPPH 自由基能力... 47

（二）還原力... 48

（三）螯合亞鐵離子能力... 49

三、不同成熟度金柑之成分變化 ... 50

（ㄧ）一般成分... 50

（二）總酚類化合物... 51

（三）總類黃酮含量... 52

（四）總花青素含量... 53

（五）類胡蘿蔔素... 54

（六）醣類... 55

（七）有機酸... 56

四、不同成熟度金柑成分變化與抗氧化活性之相關性 ... 58

（ㄧ）長實金柑果皮... 58

（二）長實金柑果肉... 59

（三）圓金柑果皮... 60

（四）圓金柑果肉... 60

五、不同成熟度金柑類黃酮組成變化與抗氧化活性之關係 .... 61

（ㄧ）類黃酮組成變化... 61

（二）類黃酮組成與抗氧化性之相關性... 64

（三）以 DPPH 自由基檢測類黃酮之抗氧化活性... 65

六、金柑蜜餞加工過程中類黃酮含量與抗氧化活性之變化 .... 67

（ㄧ）總類黃酮含量之變化... 67

（二）類黃酮組成之變化... 68

（三）DPPH 自由基清除能力之變化 ... 68

伍、結論 ... 70

陸、參考文獻 ... 72

柒、表 ... 84

捌、圖 ... 104

(9)

表目錄

附表一、台灣地區最近三年長實金柑在各縣市種植面積與收量... 5

附表二、台灣地區最近三年圓金柑在各縣市種植面積與收量... 6

附表三、長實金柑與圓金柑營養成分... 11

附表四、多元酚的基本結構成分與代表植物... 14

附表五、七類類黃酮的化學結構與其主要食品來源... 24

附表六、柑橘類類黃酮之醣苷與配醣體結構特性... 26

附表七、不同種類類黃酮的抗菌、抗真菌與抗病毒活性... 31

表一、完熟長實金柑不同溶劑萃取物之DPPH 自由基清除能力... 84

表二、長實金柑不同萃取方法之萃取物DPPH 自由基清除能力... 85

表三、完熟長實金柑果皮及果肉萃取物清除DPPH 自由基能力之 IC50 值... 86

表四、不同成熟度金柑一般成分分析... 87

表五、不同成熟度金柑果皮與果肉甲醇萃取物之總多酚含量... 88

表六、不同成熟度金柑果皮與果肉甲醇萃取物之總類黃酮含量... 89

表七、不同成熟度金柑果皮與果肉甲醇萃取物之總花青素含量... 90

表八、不同成熟度金柑果皮與果肉甲醇萃取物之總類胡蘿蔔素含量 ... 91

表九、不同成熟度金柑果皮與果肉甲醇萃取物之果糖、葡萄糖和蔗糖含量... 92

表十、不同成熟度金柑果皮甲醇萃取物之草酸與抗壞血酸含量... 93

表十一、不同成熟度金柑果肉甲醇萃取物之草酸、抗壞血酸與檸檬酸含量... 94

表十二、不同成熟度長實金柑果皮與果肉甲醇萃取物之成分變化與抗氧化活性之相關性... 95

(10)

表十三、不同成熟度圓金柑果皮與果肉甲醇萃取物之成分變化與抗氧化活性之相關性... 96 表十四、不同成熟度長實金柑果皮與果肉甲醇萃取物之類黃酮組成

... 97 表十五、不同成熟度圓金柑果皮與果肉甲醇萃取物之類黃酮組成... 98 表十六、不同成熟度長實金柑果皮甲醇萃取物之類黃酮成分變化與抗

氧化活性之相關性... 99 表十七、不同成熟度長實金柑果肉甲醇萃取物之類黃酮成分變化與抗

氧化活性之相關性... 100 表十八、不同成熟度圓金柑果皮甲醇萃取物之類黃酮成分變化與抗氧

化活性之相關性... 101 表十九、不同成熟度圓金柑果肉甲醇萃取物之類黃酮成分變化與抗氧

化活性之相關性... 102 表二十、長實金柑蜜餞加工過程中類黃酮含量之變化... 103

(11)

圖目錄

附圖一、長實金柑... 3

附圖二、圓金柑... 3

附圖三、花青素類之化學結構... 16

附圖四、ß-胡蘿蔔素抑制油脂氧化連鎖反應的機制 ... 18

附圖五、維生素E 氧化和抗壞血酸及麩胱甘_氧化還原之循環圖.... 20

附圖六、類黃酮的基本結構... 21

附圖七、不同成熟度長實金柑... 34

附圖八、不同成熟度圓金柑... 34

附圖九、長實金柑蜜餞製作流程圖... 45

圖一、不同成熟度金柑果皮與果肉甲醇萃取物 DPPH 自由基清除率 ... 104

圖二、不同成熟度金柑果皮與果肉甲醇萃取物還原力... 105

圖三、不同成熟度金柑果皮與果肉甲醇萃取物螯合亞鐵離子能力. 106 圖四、長實金柑果皮之甲醇萃取物 DPPH 自由基作用後類黃酮的變化 ... 107

圖五、長實金柑果肉之甲醇萃取物 DPPH 自由基作用後類黃酮的變化 ... 108

圖六、圓金柑果皮之甲醇萃取物DPPH 自由基作用後類黃酮的變化 ... 109

圖七、圓金柑果肉之甲醇萃取物DPPH 自由基作用後類黃酮的變化 ... 110

圖八、長實金柑蜜餞加工製程中總類黃酮含量之變化... 111

圖九、長實金柑蜜餞加工製程中DPPH 自由基清除率之變化... 112 圖十、長實金柑蜜餞加工過程中類黃酮含量變化與 DPPH 自由基清除

(12)

壹、前言

隨著國民生活水準提升，人們對於吃不再僅止於溫飽，如何吃得健康日漸受到重視，因此食品在提升人體免疫力、防癌、抗癌、降血脂、

降血壓及抗氧化等保健機能更是受到矚目。金柑具有生理活性早有所聞，民間傳聞利用於止咳潤喉尤具成效。明朝李時珍所著本草綱目卷三十中亦有記載：金橘（氣味）酸甘、溫、無毒。主治：下氣快膈、

止渴解醒、辟臭、皮尤佳。文中明確指出，金柑之果皮效果更好。在流行病學研究中指出食用柑橘類能有效降低冠狀動脈心臟病（Cheong et al.,1998）、降低人體血液中的總膽固醇與低密度脂蛋白的含量（Hou et al.,2001 ）、預防心血管疾病與降低中風的發生率（ Cheong et al.,1998），更能有效預防癌症發生（Majo et al., 2005），顯示金柑有效成分具有相當研究之潛力。

金柑（Kumquat），果實為柑橘類中最小，一般均連皮食用，國內主要種植在宜蘭縣海拔 500 公尺以下的山坡地，栽種面積約為 280 公頃，占全國栽種面積90％以上，總產量更高達 95%以上。宜蘭地區栽 種的金柑品種以長實金柑（Fortunella margarita Swingle）為主，此品 種果實形狀較長，皮厚且略帶苦味，果肉酸味強，主要供作加工蜜餞之原料，少數於生鮮市場販售。其生理活性功能並未被重視，對於金柑產業之經濟價值殊為可惜。

因此，深入研究金柑之相關生理活性功能物質，以提升金柑之保健利用價值意義重大，且目前關於金柑之相關研究較少，僅有 1985 年 Huyskens 研究指出隨金柑果實成熟度增加時，其總類胡蘿蔔素含量會先減少而後增加，且成熟果皮中總類胡蘿蔔素含量高於果肉。2005 年

(13)

其之影響並無相關研究可尋。因此本研究擬探討金柑果皮與果肉的抗氧化活性物質組成與抗氧化性之差異，同時分析不同成熟度金柑抗氧化能力及抗氧化相關物質之變化。期能近一步確認及篩選金柑抗氧化活性物質，以提升金柑之附加價值。另外並針對金柑蜜餞加工過程之抗氧化活性變化加以探討，期能以保健功能之角度提供金柑加工利用的最佳選擇。

(14)

貳、文獻整理

ㄧ、金柑

（一）金柑品種

金柑，為芸香科（Rutaceae）多年生常綠灌木或小喬木金柑屬（Fortunella Swingle）（朱, 1957），與柑橘類同屬於芸香科植物。植株是柑桔類果樹中最矮小者，金柑屬亦為柑橘中果實最小者，品種有金彈（Fortunella crassifolia Swingle）、長壽金柑（Fortunella obovata Tanaka）、長實金柑

（Fortunella margarita Swingle）、金豆（Fortunella hindsii Swingle）、圓金柑（Fortunella japonica Swingle）與長葉金柑（Fortunella polyandra Tanaka）

等六種，依不同品種金柑之果實形狀有圓、橢圓或卵形，果皮厚為橙黃色，

油胞分明，平滑，略帶甘味，果肉汁酸、皮肉均可食用，為中國特產（朱, 1957；呂，1993 ），有些金柑品種果實適合直接食用或用作加工原料，有些品種則常用於盆栽觀賞。

金柑原產於中國南方浙江、福建省一帶，日人田代氏於 1906 年自日本引進台灣栽種（李, 1997），目前台灣地區主要做為經濟栽培的品種為長實金柑（附圖一）與圓金柑（附圖二）。

附圖一、長實金柑附圖二、圓金柑

(15)

（二）產量及其分布

長實金柑（Fortunella margarita Swingle）又名金棗或金橘，該品種的果實為呈橢圓形，果實大小類似四季桔，果皮表面光滑呈金黃色，稍帶甘苦味，果肉酸味強，較少直接生食，主要用作製作蜜餞（金棗糕）、果醬、

桔餅等原料原料。

台灣地區主要栽培於宜蘭縣海拔500 公尺以下的山坡地，總栽種面積約為 280 公頃，占全省種植面積的 90％以上，總產量更達 95%以上，其中又以員山鄉、礁溪鄉和冬山鄉最多（附表一）（行政院農業委員會農業產銷班資訊服務-果樹類產銷資料服務系統，2007）。

圓金柑（Fortunella japonica Swingle）又名金桔或四季桔，與柑橘類同屬於芸香科植物。因台灣地區其別名金桔中的金代表黃金，桔代表大吉大利之意思，故金桔成為春節期間最具年味且最受歡迎的觀果植物，四季桔除了利用於盆栽及庭園佈置以外，由於近年來台灣地區飲用桔茶及金桔檸檬茶的風氣盛行，圓金柑成為台灣重要的飲料作物，故鮮果用量大增，因而使其栽培形態逐漸由小規模的庭院觀賞用植物轉變為大規模的經濟栽培（邱，2000）。

目前台灣地區主要栽培於屏東地區（附表二），種植面積約 160-200 公頃，約佔全台總栽培面積之 72%以上，產量更達 81%以上，主要集中於長治、麟洛、鹽埔、內埔等鄉鎮（行政院農業委員會農業產銷班資訊服務，果樹類產銷資料服務系統，2007）。

(16)

附表一、台灣地區最近三年長實金柑在各縣市種植面積與收量

Table 1. Fortunella margarita Swingle cultivars area（hectare） among 2004 to 2006 in Taiwan

種植面積收量

縣市名稱

公頃公斤

年份 93 年 94 年 95 年 93 年 94 年 95 年台北縣 0.53 0.53 0.43 6,070 6,070 5,670 宜蘭縣 276.59 282.24 287.25 3,839,248 3,136,382 4,968,531 新竹縣 0.72 0.72 0.72 9,482 8,620 7,200 苗栗縣 1.90 2.68 2.68 36,840 32,085 34,125 彰化縣 12.58 13.95 14.47 72,000 48,000 207,000

南投縣 0.30 - - 1,920 - -

雲林縣 1.18 0.60 0.50 9,720 7,800 7,250 高雄縣 0.80 1.80 1.90 11,240 11,623 12,214 花蓮縣 0.90 2.20 2.20 8,100 14,850 13,013 高雄市 0.09 0.09 - 1,300 1,300 -

台東縣 1.60 1.60 1.60 7,080 12,960 9,150 全省 297.19 306.61 311.87 4,003,000 3,279,690 5,264,153

（行政院農業委員會農業產銷班資訊服務 http:// 210.69.71.26 /afa/

afa_frame.jsp 果樹類產銷資料服務系統，2007）

(17)

附表二、台灣地區最近三年圓金柑在各縣市種植面積與收量

Table 2. Fortunella japonica Swingle cultivars area（hectare） among 2004 to 2006 in Taiwan

種植面積收量

縣市名稱

公頃公斤

年份 93 年 94 年 95 年 93 年 94 年 95 年宜蘭縣 1.42 2.42 2.42 16,460 19,293 22,668 桃園縣 2.55 2.90 1.90 8,925 15,500 23,250 新竹縣 28.44 28.27 22.17 87,295 116,676 342,735 台中縣 1.32 1.32 0.90 30,375 25,110 18,225 彰化縣 12.43 9.78 10.55 194,360 66,272 171,350 南投縣 1.20 1.20 1.10 17,568 16,344 14,383 嘉義縣 1.50 3.55 2.90 6,030 9,028 9,200 台南縣 0.03 0.26 0.46 780 780 4,800 高雄縣 11.08 15.85 13.06 37,018 27,730 54,258 屏東縣 158.35 194.42 200.71 2,215,179 1,939,844 2,953,170 台東縣 0.61 0.61 0.21 5,856 5,490 2,016 台南市 0.05 - 0.15 1,500 - 2,400

全省 218.98 260.58 256.53 2,621,346 2,242,067 3,618,455

（行政院農業委員會農業產銷班資訊服務 http:// 210.69.71.26 /afa/

afa_frame.jsp 果樹類產銷資料服務系統，2007）

(18)

（三）開花習性及果實成熟情形

長實金柑的開花習性特殊，每年的6 月下旬至 9 月中旬，開花 3 至 4 次，以蘭陽地區為例，長實金柑主要開花時間可區分成三個時期，第一次開花期在6 月下旬至 7 月中旬，結果後至完熟所需時間為 115~132 天，較早期開花的金柑果實較小，品質也較差，第二次開花期為 7 月中旬至 8 月上旬，第三花期為7 月下旬至 8 月中下旬，結果後至完熟所需的時間分別為145~173 天與 192~199 天，第二及第三開花期之結果果粒較大，品質也較佳。果實成熟所需的時間會隨著開花期增加而增加，主要的原因為宜蘭地區秋冬季氣溫逐漸降低，導致成熟所需的時間拉長（李, 1995）。

宜蘭地區長實金柑的採收期在每年的 11 月上旬至翌年 2 月中旬，盛產期在每年的 12 月翌年 1 月下旬，果農一般會選擇在天晴時採收金柑，

其主要為避免因採收金柑時因空氣中水氣多，若採收過程中不慎使果蒂處果皮裂開、汁液外流，溼度過高的條件下，金柑在採收時所使用的軟質布袋中互相擠壓的結果，會使果實在隔天腐爛發霉的比率提高，影響金柑品質（李，1995）。

由於金柑每年開花3~4 次的特殊開花習性，導致果實成熟度不一致，

加上金柑果實較小、採收費人力等原因，導致決定可採收時的金柑成熟依據困難，而為了節省採收所需的時間與人力，果農會將成熟度不相同的金柑一次採收，所採收之金柑果實以七、八分熟所佔比率最多，由於金柑主要用作為蜜餞加工等原料，當金柑果皮尚未成熟的綠色部分經加工後會呈暗褐色，影響最終產品的品質，故欲做為蜜餞加工原料之金柑，採收後會利用乙烯催色，使金柑完全呈金黃色，提高加工後之產品品質（李，1995）。

(19)

花期，盛產期則集中於七月至翌年1 月，果實小、球形、果面光滑、果皮薄、肉質柔軟多汁、酸味強，依不同的目的來判斷適合的採摘時期，例如一般鮮食搾汁用的圓金柑果實於果皮呈現淺綠色、有光澤，且以手指按壓有彈性時為最佳採收期，此時所採收的圓金柑果實腐爛率可大幅降低；四季桔除了可鮮食利用以外，亦可製作成桔餅或桔醬等加工產品，為避免加工產品最終的顏色變暗，以提高加工產品的品質，會選用果實果皮呈現金黃色且果肉組織軟熟的圓金柑作為較佳加工原料（邱，2000）。

（四）藥理特性與食療

許多中醫食療的文獻提到金柑的生理功能，在金柑果肉的部份，本草綱目記載：柑果利腸胃中熱毒，解丹石，止暴渴，利小便。崔禹錫的食經提到其具有食之下氣，主胸熱煩滿的功能。醫林纂要描述其能除煩，醒酒。

中藥大辭典中也記載其具有生津止渴，醒酒利尿的功能。在金柑果皮的部份，本草綱目：味甘寒，無毒..治下氣調中，解酒毒及酒渴，..產後肌浮..

傷寒飲食勞復..治咽喉痛。崔禹錫的食經中記載其主上氣煩滿。中藥大辭典也敘述金柑果皮有下氣調中，化痰醒酒。治病後飲食失調，上氣煩滿，

傷酒口渴的功能(陳，2007)。而許多民間食物療法提到柑桔皮具有順氣化痰、治乳腺炎，治療咳嗽和喉痛很有效，一天吃二至三個金柑對胃潰瘍也有療效。（食療篇── 金柑可治胃潰瘍， http://www.tbi.org.hk/tbnews/

eathealth343.htm，2007）

金桔有理氣、補中、解郁、消食、散寒、化痰、醒酒等作用，可用於治療胸悶鬱結、酒醉口渴、消化不良、食慾不振、咳嗽哮喘等症。患有膽囊炎、肝炎、胃病、氣管炎、高血壓、血管硬化者，也可以常吃金桔或者

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由新鮮金桔加工成的金桔餅，對病有輔助的治療作用（中華名優土特產網，http://www.myttc.cn/showroom/tcshow.jsp?id=3207，2007）。

由於歷代醫學書籍中記載金柑果皮與果肉均具有許多藥理功能，

金柑在民間傳統食療上亦被認為有極佳的效果。為了解金柑果皮與果肉之成分，藉以增加金柑相關之基本資料來佐證表達其功效。

（五）相關研究

但目前關於金柑的相關研究較少，根據行政院衛生署的公布的「台灣地區食品營養成分資料庫」顯示，金柑除富含膳食纖維外，更富含維生素 A、C 及多種微量元素含量（附表三）。

在金柑的抗氧化特性研究中顯示，金柑除富含維生素A、C外，並含有豐富的類胡蘿蔔素（Huyskens et al., 1985），根據1995年Huyskens研究四個不同成熟度的金柑果實之總類胡蘿蔔素與葉綠素變化，結果顯示隨金柑果實成熟度增加時，其總類胡蘿蔔素含量會先減少而後增加。葉綠素則隨成熟度增加而減少，完全成熟時葉綠素幾乎消失，此時果皮呈現金黃色色澤，此色澤的來源是由於類胡蘿蔔素的存在，長實金柑的成熟果皮中總類胡蘿蔔素含量172 mg/100g，遠高於成熟果肉中總類胡蘿蔔素含量8.4 mg/100g。

此外，許多柑橘類的果皮是天然類黃酮的豐富來源，流行病學研究指出柑橘類中的類黃酮能有效降低冠狀動脈心臟病，更能有效預防癌症發生

（Majo et al., 2005）。2007年Wang等人研究台灣地區椪柑、桶柑、茂谷柑、

文旦、白柚、金桔、柳橙與檸檬等八種柑橘類水果，研究中顯示長實金柑中總多酚含量僅次於檸檬，為52.3 mg/g，此外，金柑中類黃酮成分分析結

(21)

果顯示，其中包括黃烷酮、黃酮與黃酮醇三大類類黃酮物質，而diosmin 為金柑中含量最多的類黃酮。

2005年Kondo等人研究結果指出，不同的種植條件如光合作用光子流量密度（Photosynthetic photon flux density，PPFD）、果樹上果實的密度與在栽種過程中使用的生長激素均會影響金柑的抗氧化性。

(22)

附表三、長實金柑與圓金柑營養成分

Table 3. Proximate composition analysis of Fortunella margarita Swingle and Fortunella japonica Swingle

營養成分單位（100g）長實金柑圓金柑

熱量（kcal） 50 32

水分（g） 86 91

粗蛋白（g） 0.9 0.7

粗脂肪（g） 0.2 0.2

碳水化合物（g） 12.7 7.6

粗纖維（g） 1 0.5

膳食纖維（g） 3.7 2.2

灰分（g） 0.4 0.5

膽固醇（mg） - -

維生素A 效力（RE） 100.6 21.7

維生素E 效力（α-TE） - -

維生素B1 （mg） 0.02 0.01

維生素B2 （mg） 0.06 0.04

菸鹼素（mg） 0.6 0.4

維生素B6 （mg） - 0.01

維生素B12 （ug） - -

維生素C （mg） 39 38

鈉（mg） 4 4

鉀（mg） 100 110

鈣（mg） 38 68

鎂（mg） 11 13

磷（mg） 14 15

鐵（mg） 0.3 0.3

鋅（mg） 0.1 0.1

（台灣地區食品營養成分資料庫，2007）

(23)

二、抗氧化機制與相關物質

（一）抗氧化機制 1、自由基

自由基（free radical）為一種高反應性，且具有一個或一個以上未配對電子的原子或分子（Halliwell 1994）。由於含有未配對電子，使其擁有極不穩定的性質，極容易由四周的原子或分子中擷取電子，使自身達穩定狀態，而被奪走電子的原子或分子變的不穩定，成為新的自由基（Aust et al., 1993），如此傳遞下去造成氧化鏈鎖反應（chain reaction），促使自由基不斷產生。自由基種類很多，但主要會對人體產生不良影響的有活性氧物質（reactive oxygen species；ROS）及活性氮物質（reactive nitrogen species；RNS）（Fang et al., 2002），化性活潑且具有強大破壞力，其引發之人體生理損害狀態被稱為氧化壓力（oxidative stress）。學者的研究亦指出自由基攻擊細胞所產生的代謝產物與人體老化速度有顯著相關性，此外，自由基還與許多疾病、細胞損害及基因突變等息息相關，這些疾病包含：阿茲海默氏病、心血管疾病、胰臟炎、風濕性關節炎、自體免疫疾病、胃潰瘍、尿毒症、糖尿病、癌症、過早衰老等（Aruoma, 1994；

Kehrer, 1993；Gutteridge, 1993； Toyokuni, 1995； Gerlach et al., 1994；

Haliwell, 1989）。

2、抗氧化機制

活性氧與自由基可造成生物體氧化壓力的存在，甚至導致人體老化及疾病產生，所幸蔬果中所含之抗氧化物質相當豐富，包括：維生素B2

（riboflavin）、維生素C （ascorbic acid ）、維生素E （tocopherol），

另外還有類胡蘿蔔素（ carotenoid ）、類黃酮（flavonids）等可提供抗氧

(24)

化力，保護生物體避免氧化傷害，並修補自由基所造成之損害（ Sies 1991）。

而1986年Dziezak依照抗氧化劑之作用原理進行分類，將抗氧化劑分成下列四大種類：（1）自由基終止劑（free radical terminator）即所謂的一級抗氧化物質（primary antioxidants），這類抗氧化劑主要是提供氫原子後形成穩定的共振形式，以達到延遲及干擾自由基連鎖反應，甚至終止氧化反應的進行，維生素E及大部分酚類化合物（phenolic compond）屬於此分類。（2）氧原子清除劑（oxygen scavenger）這類抗氧化劑的作用在於消耗氧原子，例如維生素C可與氧作用而消耗密閉空間中殘留的氧，而具有抗氧化作用。（3）金屬螯合劑（chelating agent），金屬離子種類很多，其中以鐵離子及銅離子的促氧化活性最強，此類抗氧化劑可與金屬產生螯合作用而減緩氧化作用的進行，檸檬酸及大部分類黃酮皆具有這類能力。（4）單態氧抑制劑（singlet oxygen inhibitor），能破壞單態氧而抑制光氧化的進行，由於β-胡蘿蔔素屬於光敏感物質，能吸收環境中的光，使其不傳遞給氧分子，避免光氧化的進行。

（二）植物抗氧化相關物質 1、多酚類物質

多酚類化合物為構成植物成分中含量僅次於纖維素、半纖維素、木質素的物質，植物體內所含數個羥基（-OH）的物質總稱為多酚類化合物，

幾乎存在於所有的陸上植物，在生物體內具有防禦紫外線傷害、調節生長機能，抵抗細菌與病蟲害與抑制植物體過氧化反應等功能，其色素的表現

(25)

由於多酚種類很多，為了避免混淆，則將多酚分成單元體多酚

（monomer polyphenol）及聚合體多酚（polymer polyphenol），其中聚合體多酚又可區分為加水分解型及不能被酸、鹼或酵素分解的縮合型（附表四），而類黃酮則屬於此分類中的單元體多酚類。

附表四、多元酚的基本結構成分與代表植物 Table 4. The basic structure of polyphenol and plants

（黃，2003）

經動物試驗的結果證實，攝取植物性的食物能顯著地降低癌症的罹患率（Hallwell, 1997）；而流行病學研究亦結果顯示，飲食中提高蔬果類的攝取量可有效降低許多由氧化所引起的疾病發生率(郁，1999；錢，1995) 此攝食蔬果所提供的保護作用可能與其中所含之微量營養素

（micronutrient）或是植物化學物質（phytochemicals）有關（Paolini and

(26)

Nestle, 2003）。植物中的多酚類化合物可當做生物內的還原劑，金屬螯合劑以及活性氧清除劑等（黃，2003），其可終止自由基引起的油脂過氧化反應，故在生物體中具有非常好的防預禦系統來保護生物體受到活性氧引起之氧化壓力所帶來的傷害（Devi et al., 2000）。

2、花青素

花青素（anthocyanins）是多酚類化合物中類黃酮家族之天然色素，廣泛存在於花卉及蔬果中，其為水溶性的色素，顏色受環境的pH所影響

（Kang et al., 2003）。花青素為具生物活性的植物類化學物質，共有兩百多種，結構如附圖三所示。最常見的花青素是在位置3 或3, 5 之位置發生醣苷鍵結（Stintzing and Carle, 2004）。

1997年Gasiorowski等人進行花青素清除超氧陰離子等抗氧化性實驗，推測花青素能干擾自由基的生成。而1999年Pool-Zobel等人利用葡萄所含的花青素，進行螯合金屬離子及抑制脂蛋白氧化試驗，其指出，植物 中的花青素對活體外（in vitro）的氧化壓力影響不大，對於活體內（in vivo）

而言，花青素則為有效的抗氧化劑。

(27)

（Stintzing and Carle, 2004）

附圖三、花青素類之化學結構

Fig.3. The chemical structure of anthocyanins.

(28)

3、類胡蘿蔔素

類胡蘿蔔素在食品工業上，被廣泛用作食品著色劑，其呈色以黃色、

橘色和紅色為主，是蔬果中主要的天然色素成分，特別是在橙、綠和黃色蔬果中（顏，1997），其含量僅次於葉綠素。根據Liebler 和McClure （1996）

的研究顯示類胡蘿蔔素除了具有維生素A 的活性外，亦可與自由基反應，形成不活化產物，並降低油脂氧化連鎖反應所生成之自由基攻擊細胞膜的機會。此外，類胡蘿蔔素也可以螯合單相態氧（singlet oxygen）而達抗氧化及抗癌的功能。

目前已有七百多種的類胡蘿蔔素被分離鑑定出來，一般的類胡蘿蔔素的構造是由八個異戊二烯（2-methyl-1,3-butadiene）所組成，均含有長鏈的共軛雙鍵，此類型的結構使其具有相當高的抗氧化活性。而且隨著共軛雙鍵數目的增加，其抗氧化性亦增加（Lee and Min 1990）。類胡蘿蔔素屬於脂溶性色素，分為兩類，一類為只含碳氫的化合物，稱為胡蘿蔔素

（carotene），如α-胡蘿蔔素，β-胡蘿蔔素及γ-胡蘿蔔素等。另一類為含氧的衍生物，稱為葉黃素（xanthophyll），其依含氧的數目又可分為單羥葉黃素、雙羥葉黃素和聚氧葉黃素。

近年來，類胡蘿蔔素已受到重視，Kotake 等人（2001）之研究顯示，

增加膳食中類胡蘿蔔素的攝取量，可有效的預防癌症、心血管疾病及白內障的發生比率。此外，許多研究報告指出，ß-胡蘿蔔素可與自由基反應

（Willis and Wians 2003），形成不活化產物，減少油脂氧化連鎖反應形成的自由基攻擊細胞的機會（Burton and Ingold 1984）（附圖四），進而預防許多慢性疾病的發生率。

(29)

（Burton and Ingold 1984）

附圖四、ß-胡蘿蔔素抑制油脂氧化連鎖反應的機制 Fig. 4. ß-carotene: An unsual type of liquid antioxidant.

(30)

4、抗壞血酸（Ascorbic acid）

1928 年發現新鮮蔬果中含有抗壞血酸的成分，1932年命名為維生素 C，其為許多食品中常用之水溶性的抗氧化劑。由於維生素C是最不穩定維生素，在有氧氣或催化劑的條件下，容易氧化形成去氫抗壞血酸

（dehydro ascorbic acid ）。

由於抗壞血酸容易氧化的特性，故若與其它較易氧化的化合物同時存在時，抗壞血酸會先行氧化而避免其他化合物氧化。抗壞血酸可當做金屬螯合劑，與金屬形成複合物，而使其較不易與氧作用。在去除活性氧分子方面，抗壞血酸補捉單激態氧（singlet oxygen）及超氧陰離子而產生抗壞血酸自由基（Sies and Stahi, 1995）。而抗壞血酸或去氫抗壞血酸均能與脂質過氧化自由基作用生成LOOH （Frei et al., 1989）且其能力優於其他水溶性抗氧化物質。此外，除了清除自由基的能力之外，抗壞血酸最重要的功能之一是能還原氧化態的維生素E（附圖五）。

Vit C 也具有助氧化性質（pro-oxidant）。當Vit C 與Fe³⁺各別存在時對DNA 不會造成傷害，但同時存在則會引起DNA 傷害，這是因為 Fe³⁺被還原的過程中產生羥自由基的結果。健康的個體中沒有游離的金屬離子，因此產生自由基和過氧化物的反應也相對減少（Kitts, 1997）。

5、類黃酮

類黃酮物質大量存在於蔬果中，尤其柑桔類水果，其含量可達1% 以上（Yusof et al., 1990），其為一種植物表皮細胞的色素，是植物之二次代謝產物，具有遮斷紫外線的功能，經UV-B 照射可誘發類黃酮物質的累積（蔡, 2006）。在最近幾年的研究中更顯示其具有抗癌、抗氧化、抗過

(31)

（Kitts, 1997）

附圖五、維生素 E 氧化和抗壞血酸及麩胱甘肽氧化還原之循環圖

Fig.5. Schematic diagram of cy-tocopherol oxidation and the redox cycle with ascorbic acid and glutathione. LOO, peroxyl radical; CSH , glutathione;

CSSG ,oxidized glutathione.

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三、柑橘類之類黃酮

（一）Flavonoids 的基本結構

許多流行病學研究結果顯示，飲食中提高蔬果類的攝取量可有效降低許多退化性疾病的發生(蔡，2006)，此結果與蔬果中可能含有某些具抗氧化及其他生物活性的植物化學物質有關（Ruidavets et al. 2000），許多研究顯示其中的類黃酮（flavonoids）較受重視。

類黃酮為植物中的多酚類物質（polyphenolic compounds），其名稱源自於拉丁語之flavus，為黃色的意思，是普遍存在於植物細胞的一種黃色色素（Macheix et al., 1990），其為植物之二次代謝產物。類黃酮為含15 個碳的芳香族化合物，1983年 Waiter de Gruyter 學者定義類黃酮物質為自然界中一群含有苯基之有色物質。附圖六為類黃酮主要化學結構，

2-phenyl-benzo-α-pyrones，由A與B 兩個苯環（benzene rings）與一個C雜哌喃環（heterocyclic pyran or pyrone ring）相連結，構成一 C6-C3-C6的骨架（Heim et al., 2002）。

附圖六、類黃酮的基本結構

Fig.6. Chemical structure of flavonoids.

(33)

（二）類黃酮之分類與飲食來源

類黃酮為天然抗氧化物，其為蔬果、堅果、咖啡、茶、紅酒等飲品中最普遍之多酚類化合物（Hollman and Katan, 1997），美國估計每人每日約攝取1 g 的類黃酮物質（Kuhnau, 1976; Scalbert and Williamson, 2000）, 但因其雜環上取代基之不同，有超過 8000 種以上不同結構的化合物被某些學者認定其為類黃酮物質（Beecher, 2003），使得近年來的研究報告不斷的改變飲食中類黃酮的每日攝取量。

2006年Moon等人依結構差異性將類黃酮物質分成七大類（附表五），

分別為查酮（ chalcones）、黃酮（flavones）、黃酮醇（flavonols）、黃烷酮

（flavanones）、黃烷醇（flavanols）、花青素（anthocyanins）與異黃酮類（isoflavones）等。

類黃酮物質大量存在於蔬果中，尤其柑桔類水果，其含量可達1% 以上中，柑桔類中主要含有 flavanones、flavones 和flavonols三大類類黃酮其中flavanones、flavanone glycosides 和 polymethoxylated flavones屬於柑橘類中特有(Rouseff et al., 1987)，很少在其他植物中被發現（Calabro et al., 2004）。柑橘類水果為台灣地區農業主要的經濟產物，耕種的品種也相當多，許多研究指出，柑橘類水果含豐富的酚類化合物，如酚酸與類黃酮物質，其中柑橘類的類黃酮主要分佈在果皮中，其含量高於種子與果肉

（Yusof et al., 1990），但是柑橘類水果通常去皮去籽食用，故減少許多飲食中類黃酮的來源。目前在柑橘類中偵測到六十種以上的類黃酮，依據 2006年Moon等人類黃酮物質分類方法，柑橘類類黃酮可歸類為四大類，

其中Flavanone、Flavone、Flavonol等三大類為最重要，其結構及官能基如附表六所示。

(34)

黃烷酮為柑橘類水果中含量豐富的類黃酮物質，以醣苷或配醣體的形式存在（Gionfriddo et al., 1996），其中naringenin與Hesperetin為柑橘類水果中最重要的黃烷酮醣苷，而黃烷酮配醣體（7-O-glycosylflavanones）於所有的柑橘類水果中（Park et al., 1983），如檸檬中的glycosidic flavonoids 和佛手柑、葡萄柚與有苦味的柳橙果汁中neohesperidoside flavanones、

naringin、neohesperidin與 neoeriocitrin均屬於此類物質(Wu, et al., 2007)。

(35)

附表五、七類類黃酮的化學結構與其主要食品來源

Table 5. The chemical structures and major food sources of the 7 major flavonoid subgroups

Structure Example Major food sources

Basic structure of flavonoids

Chalcone

Hop chalcones （xanthohumol and dehydrocyclo -xanthohumol

hydrate）

Hops, beer

Flavone

Apigenin

Acacetin, Apigenin, Baicalein, Chrysin, Diosmetin, Luteolin, Tangeretin

Parsley, thyme,celery, sweet red peppers, honey, propolis

Flavonol

Kaempferol

Galangin, Kaempferol, Morin, Myricetin, Quercetin

Onions, kale, broccoli, apples, cherries, berries, tea,

red wine

(36)

續上表

Flavanone

Naringenin

Eriodictyol, Hesperetin, Homoeriodictyol, Naringenin

Citrus

Flavanol

Epicatechin

Catechin, Epicatechin, Proanthocyanidins

Cocoa, green tea, bilberry, chocolate, red wine,

hawthorn, motherwort and other herbs

Anthocyanin

Cyanidin

Cyanidins, Pigmented, compounds

Cherries, grapes, berries, red cabbage

Isoflavone

Genistein

Biochanin A, Genistein,

Diadzein, Equol, Formononetin

Red clover, alfalfa, peas, soy

and other legumes

(37)

附表六、柑橘類類黃酮之醣苷與配醣體結構特性

Table 6.Structural characteristics of Citrus flavanoids in the aglycone and glycoside forms

（Gionfriddo et al., 1996）

(38)

（三）柑橘類類黃酮之生理活性 1、抗氧化

類黃酮作為抗氧化劑的主要功用為（Bombardelli & Morazzoni, 1993）：（1）抗自由基活性（antiradical activities）：氫氧自由基（OH^●）、

氧氣、單重態氧（¹O₂）、超氧化物（O^2-）等自由基。（2）抗脂質氧化（anti-lipoperoxidation activities）：R^., ROO^. , RO^.自由基。（3）金屬離子螯合劑。

類黃酮被譽為自由基的清除者其主要之原因為其具有提供氫質子

（hydrogen-donating）的能力，以終止自由基之生成與穩定自由基。類黃酮的抗氧化活性會受到其濃度與化學結構上的差異所影響，如 Kaempferol在60-100μM的濃度下才具有對抗superoxide ion的能力。此外，類黃酮具有三個用來評估其抗氧化能力的官能基結構：（1）B環上的鄰位羥基（ortho-dihydroxy）結構。（2） C環上的2,3-雙鍵與4-oxo 結構。（3）同時具有3-OH與5-OH的結構。

根據Finotti 與 Di Majo在2003年得研究中指出，所有的柑橘類類黃酮在親水性的環境下均具有抗氧化能力，但是在親油性的環境中，有些類黃酮物質如neohesperidin、hesperetin、didymin以及isosakuranetin 的抗氧化活性會下降，此外naringin、narirutin、naringenin、neoeriocitrin 與heridictyol甚至會反轉本身的性質形成前氧化物（Prooxidants）。

Rutin 屬於類黃酮化合物分類中的黃酮醇類，最早於 1842 年由 Wesis 等人自芸香中分離出來，流行病學研究指出 Rutin 能有效降低血脂及抗氧化作用（Li & Zhang, 2001）。Kaempferol 與芸香素、槲皮素等黃酮醇化合物一樣具有具有抗氧化等生理活性功能（Larson,1988）。

Naringin 亦具有很強的抗氧化性（Jeon et al.,2002）。

(39)

人體中的肥大細胞（mast cell）與嗜中性白血球（neutrophil）含有許多發炎介質。當此其受到刺激後，細胞會釋放出某些發炎介質，導致血管擴張、細胞通透性增加、支氣管平滑肌收縮與組織傷害等症狀。

所以如果化合物能抑制嗜中性白血球及肥大細胞之活化，或阻止發炎介質的產生，就能對發炎及過敏症狀加以控制，以達到預防與治療的效果（Schwartz, et al., 1984）。

柑橘類類黃酮能有效抑制許多控制酵素如蛋白質激酶 C（protein kinase C）、磷酸二酯酶（Phosphodiesterase）、磷脂酶（phospholipase）、

脂氧化酶（lipoxygenase）與環氧合酶（cyclooxygenase）等酵素的活性已達免疫與抗發炎的效果（Manthey and Grohmann, 2001）。

2003年Sakata等人利用老鼠的巨噬細胞進行hesperidin之抗發炎實驗，結果顯示其能有效的抑制發炎反應中脂多醣類（lipopolysaccharide, LPS）所誘發的環氧化脢2（cyclooxygenase-2, COX-2）而達抗發炎的效果。Asongalem 等人於2004年利用大鼠進行進行hesperidin之抗發炎實驗顯示，hesperidin確實具有顯著的抗發炎效果。

Quercetin 主要存在於植物的花與葉等外部組織，故均存在於一般蔬菜中，屬於類黃酮化合物分類中的黃酮醇類，具有抗發炎、抗過敏等生理活性（Kuhlman et al., 1998；Zava et al.,1997）。而 Kaempferol 與芸香素、槲皮素等黃酮醇化合物一樣具有具有抗發炎等生理活性功能（Larson,1988）。此外，Hesperidin 為柑橘類水果中重要的類黃酮成分，具有抗發炎、抗過敏等的生理活性功能（Cheong et al.,1998）。

3、預防動脈粥樣化

動脈粥樣硬化（atherosclerosis）又稱硬化性心臟病，是一種脂質與發炎細胞的聚積並伴隨著平滑肌細胞增生與細胞外間質液分泌所引起的細胞內膜纖維變性。雖然這種阻塞性的血管疾病在是造成死亡及殘

(40)

廢的主要原因，但我們對此疾病發生的機轉仍然知道有限。流行病學的研究已經証實有許多因素會導致冠狀動脈疾病危險性的增加。

1938 年，Szent-Gyorgyi 首度探討微血管的脆性與出血與飲食中的類黃酮有絕對的關係，按時的攝取維生素P，可降低年長男性冠狀動脈疾病的發生。此外，在兔子（Lee. et al.,2001）和大鼠（Jung.et al.,2006）

的飼養過程中添加柑橘類類黃酮，同樣也顯示，其能有效降其血液中低及極低密度脂蛋白（VLDL）、膽固醇與三酸甘油脂的量並降低動脈粥樣化發生的比率。

Hesperidin 為柑橘類水果中重要的類黃酮成分，可預防心血管疾病與中風的發生率（Cheong et al.,1998），其在腸胃道內可以被細菌代謝成橙皮苷元（Hesperetin）（Romanova et al., 2001）， Hesperetin 除了具有清除自由基與抗氧化之功能之外（Chao et al., 2002；Landolfi et al., 1984 ），亦具有降低人體血液中的總膽固醇、低密度脂蛋白與三酸甘油脂，亦能增加血液中高密度脂蛋白含量（Sher et al., 1992；Hou et al., 2001）。而 Naringin 能有效降低血漿及肝臟中的膽固醇（da Silva et al., 2001）。

4、預防癌症的發生

飲食中類黃酮化合物被認為是化學預防（chemopreventive）與抗癌製劑。推測其抗癌機制來至於其選擇性地對癌細胞產生毒殺、抑制癌細胞增殖（antiproliferative）與細胞凋零（apoptosis）等作用。而柑橘類黃酮的可預防細胞DNA的傷害、抑制腫瘤細胞的增生與擴散而達抗癌的效果（Manthey et al., 2001）。

類類黃酮可藉由清除活性氧自由基與吸收紫外線，以避免人體的 DNA受到傷害（Stapleton & Walbot, 1994），Naringenin 與Rutin 可對

(41)

的修復作用以避免細胞突變。此外，類黄酮可扮演自由基清除者的角色，避免自由基引起的DNA突變（Shimoi et al., 1994）。Hesperetin與 naringenin可抑制乳癌細胞的增生（So et al., 1996），Naringenin在濃度 0.71-2.85mmol可抑制HT-29 結腸癌細胞的增生（Elisa et al., 2007）。

Hesperidin 為柑橘類水果中重要的類黃酮成分，不僅能減少癌症發生的機率，對於癌細胞增生亦具有明顯抑制效果（Cheong et al., 1998）。 Naringenin 與 Naringin 同樣具有很強的抗氧化性，對於抗胃潰瘍也有很好的效果（Kroyer et al.,1986；Parmar et al., 1983），此外柚皮苷元能有效抑制乳房腫瘤細胞增生（So et al.,1996）。而臨床研究指出，Diosmin 能有效治療痔瘡，靜脈曲張等慢性靜脈功能不全等症狀(No authors listed. 2004)，對於淋巴癌也有預防的效果（Nieto, et al., 1993）。

5、抗菌

如附表七所示，不同種類的類黃酮分別具有抗菌、抗病毒與抗真菌的效果，如 Quercetin 可抑制 Staphylococcus aureus、Escherichia coli 與 Bacillus subtilis 等細菌。對於其他病毒與真菌也有很好的控制效果

（Rajnarayana, 2001）。

(42)

附表七、不同種類類黃酮的抗菌、抗真菌與抗病毒活性

Table.7. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of various flavonoids

Organism Flavonoids Antibacterial activity:

Staphylococcus aureus Quercetin, Baicalin, Quercetogetin, Hespertin, Fisetin, iso-liquiritigenin, Naringin+rutin, Naringin+ Hespertin

Staphylococcus albus Fisetin Streptococcus pyogenes Apigenin Streptococcus viridans Apigenin Streptococcus jaccalis Chrysin Streptococcus baris Chrysin Streptococcus pneumoniae Chrysin

Shigella boydii Hespertin, Naringin+Rutin, Naringenin+Hespertin Pseudomonas aeruginosa Rutin, Naringin, Baicalin, Hydroxyethylrutosine Escherichia coli Quercetin

Bacillus subtilis Quercetin Bacillus anthracis Rutin Proteus vulgaris Datisetin

Clostridium perfingens Hydroxyethylrutoside Antiviral activity:

Rabies virus Quercetin, Quercetrin, Rutin Herpes Virus Quercetin

Para influenza virus Quercetin, Rutin

Herpes simplex virus type Galangin, Quercetin, Kempferol ,Apigenin, Chrysin

Potato virus Morin, Rutin+Quercetin Influenza virus Rutin+Quercetin

Herpes simplex virus type 2 Quercetin

Respiratory syncytial virus Quercetin, Naringin Immuno-deficiency virus

infection

Apigenin

Auzesky virus Quercetin, Quercetrin, Morin, Apigenin, Luteolin Polio virus Quercetin

Mengo virus Quercetin Pseudorabies virus Quercetin Antifungal activity:

Candida albicans Chloroflavonin Candida tropicalis Quercetin Fusarium solani Chrysoeriol Botrytis cinerea Chrysoeriol Verticillium dahliae Chrysoeriol

Azotobacter vinelandii Quercetin, Rutin, Epicathenin Alternacia tennisima Apigenin, Echinacin

(43)

叁、材料與方法

ㄧ、實驗架構

不同成熟度長實金柑與圓金柑

一般成分分析

甲醇萃取物

抗氧化性評估 1. DPPH 自由基清除

能力

2. 螯合亞鐵能力 3. 還原力測定

相關成分分析 1.總多酚含量 2.總類黃酮含量 3.總花青素含量 4.總類胡蘿蔔素含量 5.有機酸分析

6.醣類分析

抗氧化有效成分相關性評估

抗氧化有效成分之初步判定

蜜餞加工過程中抗氧化有效成分

之變化 1.原料

2.鹽漬 3.漂水 4.殺菁 5.糖漬 6.烘乾

(44)

二、材料

（一）金柑

本實驗所使用長實金柑（Fortunella margarita Swingle）與圓金柑

（Fortunella japonica Swingle）樣品採購自宜蘭縣礁溪鄉旭工實業有限公司，採收自宜蘭縣員山鄉，採收日期為民國 94 年 11 月，採收之長實金柑平均大小與重量為 3.87±0.30cm 及 18.77±3.60g，圓金柑平均則為2.5±0.4cm。金柑樣品經由農民與旭工實業有限公司依照農民一般交易經驗先行分類，長實金柑成熟度分為50%、60%、70%、80%、90%

及100%等六類，圓金柑則分為 30、50、70 及 100%等四類，再於實驗室依照判定參考圖（如附圖七、八）詳加分類，即得各不同成熟度金柑。

(45)

附圖七、不同成熟度長實金柑

Fig.7. Fortunella margarita Swingle with different maturities

附圖八、不同成熟度圓金柑

Fig.8. Fortunella japonica Swingle with different maturities

2.5 cm 3.8 cm

(46)

三、藥品及器材

（ㄧ）藥品

抗壞血酸（ascorbic acid）、硫氰酸銨（ammonium thiocyanide）、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯醋酸、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、FeCl₂‧4H₂O

（iron choride tetrahydrate）、FeCl3‧6H2O、K3Fe（CN）6、DPPH（α，

α-diphenyl-β- picrylhydrazyl）、Ferrozine、α-生育醇（α-tocopherol）、ferrous ammonium sulfate 、 phenazine methosulphate （ PMS ）、 β-dihydronicotineamidadenine dinucleotide （ β-NADH ）、 nitroblue tetrazolium（ NBT）、 thiobarbituric acid（ TBA）、 trichloroacetic acid

（TCA）、Tween 20、HCl、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、氫氧化鈉、草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、BHA、BHT、Quercertin、

Naringin、Hesperetin、Hesperidin、Naringenin、Neohesperidin、Rutin、

Diosmin與Kaempferol，分別購自Sigma, St. Louis,（MO, USA.）及Merck

（ Darmstadt, Germany）。

（二）器材

真空凍結乾燥機（TLSHIN LAB CO LTD,KOREA）

快速粉碎機（FRITSCH PU14,GERMANY）

恆溫振盪機（YIH DER Instrument co LTD,TAIWAN）

超音波振盪機（Bransonic 3510R-DTH,TAIWAN）

分光光度計（HITACHI U-2001,US）

高效能液相層析儀（SHIMADZU SPD-H10A,JAPAN）

桌上型冷凍離心機（SANYO HARRIER 181GOK,U.K）

減壓濃縮機（BUCHI-WaterbathB-480,SWEDEN）

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Sweden）

四、實驗方法

（一）不同萃取條件之影響 1、樣品製備

將生鮮長實金柑洗淨後，置於-25℃冷凍一小時後，於室溫五分鐘後剝皮並取出種子。分別將果皮（peel）與果肉（pulp）置於真空凍結乾燥機（-55℃、壓力 5 tor）凍乾 96 小時後，用快速粉碎機磨成粉末狀，倒入加蓋褐色瓶中，置於-25℃冷凍庫凍藏備用。

2、萃取溶媒之探討

取金柑果皮與果肉凍乾粉末各 5g 於 250mL 錐形瓶中，分別添加 50mL 甲醇、水與乙酸乙酯等三種溶劑，於恆溫震盪機（ YIH DER,TAIWAN）中，在 25℃，90 rpm 條件下震盪萃取一小時後過濾，

殘渣部分重覆萃取兩次，合併三次萃取濾液，經減壓濃縮後，定容到一定體積後凍藏備用，並稀釋成不同濃度進行 DPPH 自由基清除能力之分析，以探討不同萃取溶媒之影響。

3、萃取方法之探討

分別取凍乾後金柑果皮與果肉粉末各5g 於 250mL 錐形瓶中，添加 50mL 甲醇，分別於恆溫震盪機（YIH DER, TAIWAN）中，在 25℃，

90 rpm 條件下震盪萃取二十四小時後過濾，收集濾液。另外採萃取一小時後。殘渣部分重覆兩次萃取一小時，將萃取24 小時之濾液與萃取一小時之濾液分別經減壓濃縮後，定容到一定體積後凍藏備用，並稀釋不同濃度進行DPPH 自由基清除能力之分析，比較萃取方法之差異。

（二）抗氧化活性測定

(48)

50mL 甲醇，於恆溫震盪機（YIH DER, TAIWAN）中，在 25℃，90 rpm 條件下震盪萃取一小時後過濾，殘渣部分重覆兩次萃取一小時，合併三次萃取濾液，經減壓濃縮後，定容到一定體積後凍藏備用，並稀釋成 10、3.3、1.25、1、0.83 mg/mL 等不同濃度進行下列各種抗氧化性之分析。

1、DPPH 自由基清除能力測定

參考Shimada 等人（1992）所述之方法加以修飾，取不同濃度金柑果皮與果肉之甲醇萃取液1.5mL，加入 1mL 新鮮配製的 0.5 mM DPPH 甲醇溶液，混合均勻後，於室溫下靜置30 分鐘，使用分光光度計檢測 517nm 之吸光值。

清除率（scavenging effect %）＝［1-（樣品於 517 nm 的吸光值-背景吸光值）/ （未添加樣品之控制組 517 nm 的吸光值）］×100%］。

2、還原力的測定

參考Oyaizu（1986）所述的方法加以修飾，取 2.5 mL 金柑果皮與果肉之甲醇萃取液，加入2.5 mL 0.2 M pH6.6 之磷酸緩衝溶液與 2.5 mL 1 % K₃Fe（CN）₆溶液，置於50 ℃水浴中反應 20 分鐘後迅速冷卻，加入2.5mL10%三氯醋酸溶液，以 3000 rpm 離心 10 分鐘後，取 5 mL 上清液，加入5 mL 的去離子水及 1 mL 0.1% FeCl₃‧6H₂O 溶液後，混合均勻，靜置反應 10 分鐘後，使用分光光度計檢測 700 nm 之吸光值，

以吸光值大小表示還原力大小。

3、螯合亞鐵離子能力的測定

參考Shimada（1992）所述的方法加以修飾，取 2.5 mL 金柑果皮與果肉之甲醇萃取液，加入8 mL 甲醇與 0.25 mL 2 mM FeCl₂，反應 30 秒後再加入0.5 mL 的 5 mM ferrozine，靜置 10 分鐘，以分光光度計測

(49)

螯合亞鐵離子能力（chelating effects）= [空白組 A562nm-樣品 A562nm）

/（空白組 A562nm）] ×100%。

（三）一般成分測定 1、水分含量測定

根據AOAC（1984）分析方法，秤取 0.5 g 長實金柑與圓金柑精秤至小數點後四位，置入已秤重且事先乾燥達恆重之坩鍋中，再將坩鍋加蓋放入烘箱以 110 ℃乾燥 24 小時。取出坩鍋置於乾燥皿中，待溫度降至室溫秤其重量，直到恆重為止，此時減去的重量即為水分含量。

水分（%）=100×（W1 - W2）/（W1 - W0）

W0：坩鍋恆重（克）

W1：坩鍋 + 樣品重量（克）

W2：W1 乾燥至恆重的重量（克）

2、灰分含量測定

參考AOAC （1984）分析方法。坩鍋與其蓋子經洗淨後置於 105℃

烘箱中烘乾，取出置於乾燥皿內冷卻並秤重量為 X1，精秤金柑 1g 於坩鍋中秤重為X2，將其置於灰化爐中，於 550 ℃灰化至樣品成灰白色粉末狀（約需 6 小時，若灰化不完全，則先取出坩鍋冷卻，加少許蒸餾水潤濕，再繼續灰化至完全）。關掉灰化爐，使其溫度下降至100~200

℃左右，取出坩鍋，置乾燥器內冷卻，並秤重，設重量為X3，計算出灰分如下：

灰分（%）＝[（X3－X1）/（X2－X1）]×100 3、粗蛋白含量測定

參考AOAC （1984）分析方法。取 5 g 金柑粉末於分解瓶，加入

(50)

濃硫酸，放入消化爐加熱分解至澄清，取出冷卻，在未產生沈澱以前，

沿管壁慢慢加入70 mL 蒸餾水，均勻混合後 5 置於全氮蒸餾器進行蒸餾。

蒸餾步驟如下，取4 % H3BO3溶液20 mL 於 250 mL 之三角瓶中，加 methyl red-bromocresol green 混合指示劑 2~4 滴，使溶液呈紫紅色，放置於蒸餾機冷凝接受氨氣位置，加40 % NaOH 溶液約 15 mL 於分解瓶中，加熱蒸餾至氨完全被H₃BO₃吸收至溶液成藍綠色，用已標定之0.1N 硫酸溶液滴定至成紅色為止。其計算如下：

粗蛋白（%）＝[（H₂SO_{4 Sample}－H₂SO_{4 Blank}）× 0.1N×0.014×6.25/樣品重

（g）]×100

4、粗脂肪含量測定

參考AOAC（1984）分析方法。將圓底燒瓶置於烘箱中，經 105 ℃ 烘乾後恆重，秤其重量設為X1，樣品磨碎均勻混合，精秤樣品 3~5g，

設重量為X2，將樣品置入圓筒濾紙中，置入索氏萃取器，並於抽氣櫃中加入約200 mL 的乙醚溶劑，連續萃取 16 小時之後，將圓底燒瓶置入烘箱50 ℃約 2 小時，取出置於乾燥器皿冷卻後秤重並恆重為 X3。

其計算如下：

粗脂肪（%）＝[（X3－X1） / X2] × 100 5、碳水化合物含量

碳水化合物含量的計算：

碳水化合物（%） = 100%–水分（%）–粗脂肪（%）–粗蛋白（%）–

灰分（%）

（四）抗氧化相關成分分析

(51)

類黃酮含量依Christel（2000）等人之方法進行。取 1 mL 之金柑甲醇萃取物，加入1 mL 2% Methanolic AlCl3．6H2O，在室溫下靜置十分鐘後，使用分光光度計檢測430 nm 之吸光，另取 1 mL 不同濃度（2、

4、6、8、10、20 ppm）之 quercetin 標準品製作標準曲線，測得之吸光值再與 quercetin 標準曲線對照定量，然後再依甲醇萃取液之製備條件，換算成每克金柑乾物之類黃酮化合物含量。

2、總多酚含量測定

參考 Singleton（1965）等人及 Christel（2000）等人所述之方法加以修飾。均勻混合7 mL 去離子水、0.5 mL Folin 試劑及 0.5 mL 之金柑甲醇萃取液，加入2 mL 20% Na₂CO₃溶液兩分鐘後，立即置於 100℃水浴一分鐘後，置於暗室中冷卻。使用分光光度計於750 nm 下測定吸光值，並與20 ppm、 40 ppm、 60 ppm、 80 ppm、 100 ppm 與 200 ppm 等濃度沒食子酸（gallic acid）作為標準品所得之標準曲線對照定量，

計算成每克金柑乾物之總酚類化合物含量。

3、總花青素含量的測定

參考 Fuleki（1968a）等人之酸鹼度差額法，取 5 g 金柑粉末，以 50 mL 含 0.1 ％鹽酸之甲醇萃取溶劑，於避光條件下震盪萃取（90 rpm）

一小時後過濾，殘渣部分重覆萃取兩次，合併三次萃取濾液，經減壓濃縮後，精確定量上述所收集的濾液，得體積V，分別從濾液中吸取 2 mL 試樣，以濃鹽酸及 1N 氫氧化鈉溶液調整其 pH 值為 1.0 與 pH 4.5。

利用分光光度計測其在 520 nm 的吸光值，所得吸光值 A1 與 A2，再以下列公式計算每100 克金柑中所含總花青素毫克數。

總花青素含量（mg 花青素/100g 金柑乾重）：

（A1-A2）×MW×V×100/ε×ω A1：為樣品在 pH1.0 的吸光值

(52)

A2：為樣品在 pH4.5 的吸光值

MW：花青素分子量，以 cyanidin 之分子量 340 計算 V：總抽出液體積（mL）

ε：花青素之莫耳吸光係數（Molecular extinction coefficient），以cyanidin 在含0.1％鹽酸的甲醇溶液中之吸光係數 ε 值 24600 計算。

ω：金柑總重（g）

4、總類胡蘿蔔素含量測定

參考Simon （1980）等人所述之方法加以修飾，取 2 g 金柑粉末，

以甲醇於室溫下萃取一小時後過濾，殘渣部分重覆前步驟兩次，合併三次萃取濾液，精確定量上述所收集的濾液至100 mL，再以分光光度計測得在450 nm 吸光值，並與各濃度（20、40、60、80、100 ppm）β- 胡蘿蔔素（β-carotene）作為標準品所得之標準曲線對照定量，計算成每克金柑乾物之總類胡蘿蔔素含量。

5、單糖及雙糖含量分析

（1）樣品溶液製備

參考中國國家標準 N6223 方法加以修飾，取 1 g 不同成熟度的長實金柑及圓金柑果皮與果肉凍乾粉末，以10 mL 甲醇溶劑萃取，於避光條件下萃取一小時後過濾，殘渣部分重覆萃取兩次，合併三次萃取濾液，經真空濃縮後，以甲醇精確定量上述所收集的濾液，經0.45 μm 濾膜過濾，進行HPLC 分析。

（2） HPLC 條件

高效液相層析儀為Shimadzu LC-20AT 幫浦，配有 ELSD 訊華積分軟體與 SPD-M10A 偵測器，空氣壓力 3.0 bar，溫度 40 ℃。管柱為 LiChrosorb NH₂ （250 x 4.6 mm，Merck），移動相為AeCN：Water=80：

(53)

（500、1000、1500、2000、2500 ppm）葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、

木糖、蔗糖作為標準品所得之標準曲線對照定量，計算成每克金柑乾物之各糖類含量。

6、有機酸成分分析

（1）樣品溶液製備

參考Nisperos-Carriedo （1992）等人方法加以修飾，取 1 g 不同成熟度的長實金柑及圓金柑果皮與果肉凍乾粉末，以10 mL 甲醇萃取溶劑，於避光條件下震盪萃取（90 rpm）一小時後過濾，殘渣部分重覆萃取兩次，合併三次萃取濾液，經減壓濃縮後，以0.2 %偏磷酸精確定量上述所收集的濾液，利用 0.45 μm 濾膜過濾，進行 HPLC 分析，比較草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、維生素C 含量之變化。

（2） HPLC 分析

高效液相層析儀為Shimadzu L-10AT 幫浦，配有 CLASS-M10A 積分儀與 SPD-M10A 可變波長偵測器。其中有機酸的偵測波長為 210nm，管柱為 C18e 管柱（ 250 mm x 4.6 mm，Merck）。移動相為0.2%

偏磷酸水溶液，沖提流速為1 mL/min，管柱溫度 35℃，樣品注射體積為20 μL，並與各濃度（3000、6000、9000、12000、15000 ppm）之草酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、維生素 C 等五種有機酸所得之標準曲線對照定量，計算成每克金柑乾物之有機酸物質含量。

五、抗氧化有效類黃酮之分析

（ㄧ）類黃酮組成分之分析 1.樣品溶液製備

參考Schieber（2001）等人方法加以修飾，取 1 g 不同成熟度的長

(54)

光條件下震盪萃取一小時後過濾，殘渣部分重覆萃取兩次，合併三次萃取濾液，經減壓濃縮後，以甲醇精確定量上述所收集的濾液，利用 0.45 μm 濾膜過濾，進行 HPLC 分析，比較九種類黃酮含量之變化。

2. HPLC 分析

高效液相層析儀為Shimadzu L-10AT 幫浦，配有 CLASS-M10A 積分儀與 SPD-M10A 可變波長偵測器。其中黃烷酮與黃酮醇的偵測波長為280nm，黃酮於波長 340 nm 下測定吸收值。管柱為 LiChrospher 100 RP-18e （250 x 4.6 mm， 5 μm，Merck）。沖提流速為 1 mL/min，樣品注射體積為20 μL，並以沖提液作梯度沖提。其中沖提液為（A）（B）

兩種溶液組合， solvent A 為 2 %醋酸水溶液，solvent B 為 1：1 的 0.5

%醋酸水溶液與氰甲烷。並與各濃度（25、50、100、200、400 ppm）

Quercertin 、 Naringin 、 Hesperetin 、 Hesperidin 、 Naringenin 、 Neohesperidin、Rutin、Diosmin、Kaempferol 等九種類黃酮所得之標準曲線對照定量，計算成每克金柑乾物之類黃酮物質含量。

高效液相層析之溶液梯度條件：

Time（min） Mobile phase A （%） Mobile phase B（%）

0 95 5

10 90 10

40 60 40

55 45 55

60 20 80

65 0 100

70 0 100