学 科 名 称 ： 农业生物技术 方案制作人：何 静 余 梅
前 言
《<农业生物技术>实践教学项目实施方案》是我校现代农艺技术专业 核心课程《农业生物技术》的实践教学项目实施方案。本方案于 2020 年 2 月修订。
本方案按照“项目为导向，能力为本位，结合生产实践”的教学目标 组织内容，注重引入了现代农业前沿科技实践，兼具科学性、实用性和针 对性。
项目方案内容有机融入了教育部 1+X 试点证书（粮农食品安全评价职 业技能证书）的相关标准、要求，并注重与射洪农度种植专业合作社的产 业对接。
本方案由何静和余梅编写。由学校现代农艺技术专业教学指导委员会 评审。
由于编者水平有限，难免有缺点、错误，希望师生提出宝贵意见，以 便后期进一步完善。
目 录
学科教学实践项目计划表 ... 1
项目一 农业生物技术实验室设备和一般操作技术 ... 2
任务一 实验室常用设备、仪器与器皿洗涤 ... 3
任务二 灭菌和无菌操作 ... 5
项目二 酸奶的制作与品评 ... 8
任务一酸奶的制作 ... 9
任务二 酸奶的品评 ... 10
项目三 微生物基础操作技术 ... 11
任务一 微生物培养基配制 ... 12
任务二 土壤中细菌的分离 ... 14
任务三 饮用水中菌落总数的测定 ... 23
任务四 微生物的生理生化反应 ... 25
任务五 微生物的液体培养技术 ... 27
任务六 菌种的保藏 ... 29
项目四 玉米杂交技术 ... 31
任务一 植株采粉授粉 ... 32
任务二 实验结果观察与记录 ... 33
项目五 植物组织培养技术 ... 34
任务一 MS 培养基的配制与分装 ... 35
任务二 培养基的制作与灭菌 ... 38
任务三 外植体初代培养 ... 41
任务四 继代增殖培养 ... 43
任务五 试管苗的生根与驯化移栽 ... 45
任务六 药用植物脱毒技术 ... 46
项目六 平菇的栽培与管理 ... 49
任务一 平菇接种 ... 50
任务二 平菇栽培与管理 ... 51
现代农艺技术专业
农业生物技术 实践教学项目训练计划
课程代码： 01020016
序 号
项 目
名 称 任务 课时
计划 训练
季节 训练学期 训练基地
1
农业生物技术实验 室设备和一般操作
技术
1.实验室常用设备仪器与器
皿洗涤 3 秋季 第一学期 农业生化实
训室
2.灭菌和无菌操作 3 秋季 第一学期 农业生化实
训室 2 酸奶的制作与品评
1.酸奶的制作 2 秋季 第一学期 农业生化实
训室
2.酸奶的品评 2 秋季 第一学期 农业生化实
训室
3
【1】微生物基础操 作技术
1.微生物培养基配制 3 秋季 第一学期 农业生化实训室 2 土壤中细菌的分离 3 秋季 第一学期 农业生化实
训室
【2】微生物培养技 术及菌种保藏
1. 饮用水中菌落总数的测
定 4 春季 第二学期 农业生化实训室
2.微生物的生理生化反应 4 春季 第二学期 农业生化实 训室
3.微生物液体培养技术 4 春季 第二学期 农业生化实训室
4.菌种的保藏 4 春季 第二学期 农业生化实
训室
4 玉米杂交技术
1.植株采粉授粉 3 春季 第二学期 四川乐禾种
业有限公司 2.试验结果观察与记录 3 春季 第二学期 四川乐禾种
业有限公司
5 植物组织培养技术
1.MS 培养基的配制与分装 4 夏季 第二学期 农业生化实 训室
2.培养基的制作与灭菌 4 夏季 第二学期 农业生化实训室
3.外植体初代培养 4 夏季 第二学期 农业生化实
训室
4.继代增殖培养 4 夏季 第二学期 农业生化实训室 5.试管苗的生根与驯化移栽 6 夏季 第二学期 农业生化实
训室 6.药用植物脱毒技术 4 夏季 第二学期 农业生化实
验室 7 平菇的栽培与管理
1.平菇接种 3 夏季 第二学期 农业生化实
训室 2.平菇采摘以及烘干 3 夏季 第二学期 农业生化实
训室
合计 70
修订机构：《 农业生物技术 》课程建设小组 修订时间：2020 年 1 月
项目一农业生物技术实验室设备和一般操作技术
一、项目训练目标：
（一）知识目标
掌握各实验设备的工作原理。
（二）能力目标
1、熟悉实验室常用设备及其用途。
2、掌握实验室常用器皿的洗涤。
3、掌握灭菌和无菌操作。
（三）素质目标
1.培养爱护公物的品质。
2.培养严谨细致的作风。
二、项目主要任务与课时安排：
序
号 主要任务 课时
1 1、实验室常用是设备｀仪器与器皿洗涤 3
2 2、灭菌和无菌操作 3
合计 6
三、学生分组：
5 人/组
四、实训地点：
农业生化实训室
五、实训主要设备、器材：
1、 器材：烧杯、锥形瓶、试管、量筒、移液管、容量瓶等。
2、 设备：高压灭菌锅、超净工作台等。
任务一、实验室常用是设备、仪器与器皿洗涤
一、 目的要求
1、熟悉实验室常用设备及其用途。
2、掌握、实验室常用器皿的洗涤。
二、 实验仪器与设备
吸量管、 烧杯、锥形瓶、试管、量筒、培养皿等。
三、 方法步骤
1、吸量管(刻度移液管) 微生物实验一般需备有 1ml，5ml，10ml 等规格吸 量管，使用时注意管上是有刻有“吹”字，如没，则表示不需吹出管尖液体。
2、试管 微生物学实验室所用玻璃试管，其管壁必须比化学实验室用的厚些，这样 在塞棉花塞时，管口才不会破损。试管的形状要求没有翻口，不然，微生物容易从棉塞 与管口的缝隙间进入试管而造成污染。此外，现在有不用棉塞而用铝制或塑料制的试管 帽，若用翻口试管也不便于盖试管帽。有的实验要求尽量减低蒸发试管内的水分，则需 使用螺口试管，盖以螺口胶木或塑料帽。
试管一般常用的有以下 3 种规格：
1)大试管(18×180mm)可盛倒培养皿用的培养基(如大肠菌群的检验);亦可作斜面 琼脂或样液稀释用;
2)中试管(约 13~15×100~150mm)盛液体培养基或做琼脂斜面用，亦可用于病毒等的 稀释和血清学试验。
3)小试管(10~12×100mm)一般用于糖发酵试验或血清学试验，和其他需要节省材料 的试验
3、三角瓶与烧杯 三角烧瓶有 100、250、500、1000ml 等不同的大小，常用来盛无 菌水、培养基和摇瓶发酵等。常用的烧杯有 50、100、250、500、1000ml 等，用来配制 培养基与药品。
4、培养皿 常用的培养皿皿底直径 90mm，高 15mm。培养皿一般均为玻璃皿盖，但 有特殊需要时，可使用陶器皿盖，因其能吸收水分，使培养基表面干燥，例如测定抗生 素生物效价时，培养皿不能倒置培养，则用陶器皿盖为好。
在培养皿内倒入适量固体培养基制成平板，用于分离、纯化、鉴定菌种、微生物计 数以及测定抗生素、噬菌体的效果等。
5、载玻片与盖玻片 普通载玻片大小为 75×25mm，用于微生物涂片、染色，作形 态观察等。盖玻片为 18×18mm。
（一） 实训室的清洁整理工作
根据实验室的具体情况对实验室进行清扫，使学生明确清洁是消毒和灭菌工作的 前提条件，只有在良好的卫生条件下才能达到消毒和灭菌的预期效果。
（二） 器皿的洗涤技术
1.新的玻璃器 m 使用前先用 1%稀盐酸浸泡 12-24h 用毛刷蘸洗衣粉水刷洗干净+流水 冲选 3 一次一最后用蒸帽水冲淋 1 海隙干后备用。
2.已用过的培养器皿除去容器内的残渣自来水冲洗浸泡在洗衣粉水中 15 - 30 min 一用毛刷刷洗干净+流水冲洗 3-4 次 一最后用蒸馏水冲淋 1 遍一晾干后备用。
3.已被霉菌等杂菌污染的器皿 121 C 高温高压蒸汽灭菌 30 min +趁热倒去残渣 自 来水冲洗-没泡在洗衣粉水中 15 -30 min 一用毛刷刷洗干净一流水冲洗 3-4 次最后用蒸 馆水冲淋 1 遍→晾干后备用。
4.移液管、量简等量器 铬酸洗涤液中浸泡 2h 以上一+取出后在流水中冲洗半小时
→蒸馏水冲淋 1 次→晾干后备用。
四、思考题
1、完成实训报告。
2、一般器皿的洗涤过程？
五、考核评价
序 号
考核内容 评分标准(满分 100 分) 得
正 分 确熟练
正 确不熟 练
在 指导下 完成
不 能完
成
1 一般器皿的认识 20 16 12 4
2 器皿洗涤操作 20 16 12 4
3 实验室的打扫 30 24 18 6
4
情感态度价值观 优
9-10 良 8 合 格 6-7
不 合格
4 5
作业与实训报告完成情况 优
18-20
良 16
合 格 12
不 合格
8 总 分
优秀:>90 分 良好:80-89 分 中等:70-79 分 合格:60-69 分 不合格:<60 分
六、注意事项
1．注意实验室的清洁状况
2．注意玻璃器皿的使用，避免打碎划破手指。
任务二、灭菌和无菌操作 一、 目的要求
1、 熟悉灭菌和无菌设备工作原理。
2、 掌握灭菌与无菌操作流程。
二、 实验仪器与设备 高压灭菌锅、超净工作台等。
三、 实验原理
1、高压灭菌锅的工作原理是很简单的，它由罐体、压力表、罐盖、排气阀、安全阀 以及电热丝组成，压力表主要是指示压力的，排气阀是用来排气，调节罐内压力的，安 全阀主要是防止压力过高的，当压力过高，安全阀就会打开排气;电热丝是用来加热的，
整个的构件是很简单的，原理也很简单，就是通过电热丝加热升温，产生蒸汽，并保持 在一定的温度压力下达到杀菌的目的，连芽孢都可以杀死，所以非常的常用。随着灭菌 锅的不断被应用，现在高压灭菌锅的样式也很多，有全自动的，有半自动的，小型的，
大型的都有，但是其原理是都一样的，操作方法也基本相同。
2、超净工作台的工作原理：超净台由三相电机作鼓风动力，功率 145～260W 左右，
宻的原理是空气通过由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，
形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，即所谓“高效的特殊空气”，它除去了大于 0.3μm 的尘埃、真菌和细菌孢子等等。超净空气的流速为 24～30m/min，这已足够防止 附近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本生灯对器械等 的灼烧消毒。工作人员就在这样的无菌条件下操作。
四、操作步骤
（一）、高压灭菌锅的使用
1、加水：先将排水阀关闭，调整总阀至“全排”。然后，开启进水阀，放蒸馏水至
蒸汽发生器内，待水进至距水表顶端大约 1～2cm 处时，关闭进水阀，并将总阀调至“关 闭”。
2、装锅：将待灭菌物品装入锅内，注意不要塞得过紧过满，盛有培养基的三角瓶 和试管应立放或适度倾斜．以免灭菌过程中培养基污染棉塞。
3、关门：按顺时针方向转动紧锁手柄，使撑挡进入门圈内。然后旋动八角转盘，
使门和垫圈密合，以灭菌时不漏气为度，不宜太紧，以免损坏垫圈。
4、通电加温：待电源控制开关的旋钮旋至“开”处，电源指示灯亮，表示已通电，
然后再按灭菌物品所需灭菌汽压将旋切旋至 0.07MPa、0.1mPa 或 0.14MPs 处。此时电热 指示灯亮，表示已通电加热。
5、保温保压：当蒸汽套层内的蒸汽随加热达到自动控制压力时，电热指示灯会白 动熄灭，表示停止加热。随着热力散发压力降低，电热指示灯再亮，表示继续加热，这 表明压力控制器工作正常。当套层内的蒸汽加热到所选择的控制压力时，即可将套层内 的蒸汽导入消毒室进行灭菌。此时应先将汽液分离器前的冷凝阀开放少许，然后将总阀 调至“消毒”，套层内的蒸汽即通过总阀进入消毒室进行消毒，冷凝水则通过汽液分离 器自动排出。这时蒸汽套层内蒸汽压力迅速下降，而消毒室内的蒸汽压力逐渐上升，消 毒室内的温度表也随着物品被蒸汽加热而上升。当表的温度升到所需消毒温度(一般为 121℃)时，开始计算灭菌时间，维持温度至灭菌完毕。
6、出锅：灭菌完毕后，立即切断电源，按灭菌物品性质和要求，决定消毒室内的 蒸汽是自然冷却还是采取“慢排”例如，器械、器皿、固体曲料、土壤、草炭等不致因 压力骤然下降而受影响的物品，可直接将总阀调至“慢排”使消毒室内蒸汽迅速排出。
当消毒室内压力下降至“0”时，方可缓慢转动锅门转盘并拨动紧锁手柄将门开启 5～10cm。
20～30min 后将灭菌物品取出，此时灭菌物品即较干燥。溶液及培养基等物品灭菌完毕 时，只能将总阀调至“慢排”，使消毒室内蒸汽慢慢排出，以免突然降低压力导致培养 基剧烈沸腾。也可在灭菌完毕后，关闭总阀，让灭菌物品自然冷却。消毒宝压力表降至
“0”时、再将总阀调至“慢排”数分钟取出灭菌物品。
7、连续操作：如灭菌物品较多需连续操作时，应先检查水位。有足够水量时，可 连续使用。如需加水、应把总阀调至“全排”，打开进水阀加水后继续操作。
8、保养：每次灭菌完毕后，关闭电源，停止加热，随后将总阀调至“全排”，排出 套层内的蒸汽。开启铂门少许，散发剩余蒸汽，使消毒室内壁经常保持干燥，同时排除 蒸汽发生器内的余水。
（二）、超净工作台的使用
1、使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒；
2、接通电源，提前 50 分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积 累的微生物，30 分钟后，关闭紫外灯，开启送风机；
3、工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰；
4、操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂 及消毒剂擦拭
五、注意事项
1、超净工作台使用注意事 项：（1） 超净工作台要求安装在无菌接种室内使用，
可以提高接种效 果和延长使用寿命。（2）工作台内需安装紫外线灯和日光灯。（3） 接 好电源进行调试，操作区的风速若小于 0.3 米/秒，应进行 检查。若风机反向运 转，
应调整电动机相线。（4）工作时，严防外界各种高速干扰气流，如来自门、窗、风扇、
送风口等处的高速干扰气流。（5）工作台使用一段时间后（一般预过滤器 3 ~6 月，高 速过滤器 1〜2 年或更长），应取出预过滤器，将滤料拆下，用温肥皂液浸泡， 然后平 整挤压数次，再用清水洗净晾干后装入柜体内使用。若有破损， 应予更换。因为过滤 器容尘会逐渐增加，容易造成操作区的气流速度 下降。
2、高压灭菌锅使用注意事项：
（1）、物品放置的要求整齐、稳定。并需要留出空隙。
（2）、加盖时将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，在一两两对称的方式 同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
（3）、灭菌结束时打开灭菌锅盖时，注意不要把脸靠近，否则蒸汽会对脸造成伤害。
六、作业与思考题 1．完成实训报告。
2．超净工作台的工作原理是什么？
3．高压灭菌锅的注意事项？
七、考核评价
序
号 考核内容
评分标准(满分 100 分) 正确熟练 正确不熟 得分
练
在指导下 完成
不能完成
1 高压灭菌锅的正确使用 40 35 25 10
2 超净工作台的正确使用 40 35 25 10 3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6 （ 不 合
格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
项目二酸奶的制作
一、项目训练目标：
（一）知识目标
掌握酸奶的制备和灭菌操作以及原理。
（二）能力目标 1、了解酸奶的种类。
2、掌握酸奶的制备原理。
3、掌握灭菌操作技术。
（三）素质目标
1.培养爱护公物的品质。
2.培养严谨细致的作风。
二、项目主要任务与课时安排：
序号 主要任务 课时
1 1、酸奶的制备 3
2 2、酸奶的品评 3
合计 6
三、学生分组：
5 人/组
四、实训地点：
农业生化实训室
五、实训主要设备、器材：
小锅，天平，电炉，蔗糖，新鲜牛奶，脱脂奶粉，乳酸菌种，纸杯，蒸馏水。
任务一、酸奶的制备
一、目的要求
1.了解酸奶的种类。
2.掌握酸奶的制备原理以及灭菌操作。
二、仪器、药品
小锅，天平，电炉，蔗糖，新鲜牛奶，脱脂奶粉，乳酸菌种等。
三、方法步骤
1.原料配比梯度 取新鲜牛奶 200mL，分别加入糖 10g，加入脱脂奶粉 4g。
装于 100mL 小罐头瓶中，没瓶大约 95mL，用双层玻璃纸包好。
2.原料处理 将装入原料的小瓶于 60℃水浴 10 分钟取出。
3.冷却 在超净工作台上冷却至 30℃。
4.接种 向试管菌种中放入 10mL 无菌水，配制成菌悬液，每瓶接 1～2mL 菌悬液，封口。
5.培养 40～42℃培养，每 6 小时观察一次。
四、作业与思考题 1．完成实训报告。
2．酸奶制备应该注意什么？
五、考核评价
六、注意事项
1．在使用电炉的时候注意用电的安全。
2．一定要冷却后才能接种，避免温度过高是菌种失去活力。
3．使用超净工作台时，注意无菌性。
序号 考核内容
评分标准(满分 100 分)
得 正确熟练 正确不熟 分
练
在指导下
完成 不能完成
1 酸奶的制备 40 35 25 10
2 超净工作台的使用 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
任务二、酸奶的品评
一、目的要求
熟悉酸奶的质量评价。
二、仪器、药品 纸杯、蒸馏水。
三．方法步骤
1．嗅觉检验 取培养好的酸奶，将瓶口放到鼻端，轻扇手掌，将气味送入 鼻内，仔细辨别，记录。
2．视觉检验 取酸奶瓶在自然光下观察，描述酸奶组织形态、颜色，并记 录。
3．味觉检验 取少量蒸馏水漱口，取少量气味、视觉正常的酸奶放入口中，
仔细品评，并记录。
四、作业与思考题 1．完成实训报告
2．为什么有的酸奶过酸？
3．气味、视觉不正常的酸奶有必要再进行味觉检验吗？
五、考核评价
项目三-『1』微生物基础操作技术
一、项目训练目标：
（一）知识目标
序号 考核内容
评分标准(满分 100 分)
得分 正确熟练 正确不熟
练
在指导下
完成 不能完成
1 酸奶的品评方法 40 35 25 10
2 实验态度 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合 格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
掌握微生物培养基配制方法，土壤中细菌的分离技术。
（二）能力目标
1、熟悉微生物基础培养基配方。
2、掌握基础培养基配制方法。
3、掌握土壤中细菌的分离技术。
（三）素质目标
1.培养爱护公物的品质。
2.培养严谨细致的作风。
3.培养学生动手操作能力。
二、项目主要任务与课时安排：
序号 主要任务 课时
1 微生物培养基配制 3
2 土壤中细菌的分离 3
合计 6
三、学生分组：
5 人/组
六、实训地点：
农业生化实训室
七、实训主要设备、器材：
小锅、灭菌锅、天平、电炉、漏斗、纱布、试管、培养皿、pH 试纸、橡 皮筋、报纸、棉花、烧杯、烘箱、移液器等。
任务一、微生物培养基配制
一、目的要求
1．熟悉培养基配方。
2．掌握培养基的配制方法。
二、仪器、药品
小锅、灭菌锅、天平、电炉、漏斗、纱布、试管、培养皿、pH 试纸、橡皮 筋、报纸、棉花、烧杯、烘箱、移液器、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、NaCl 等。
二、方法步骤
(一)、制备培养基
1. 称量药品 按照培养基配方称量药品，要求精确至 0.1g.需要注意的是，
牛肉膏要用小烧杯称重，称量净重。
2. 溶化药品 将药品放到小锅中，置于电炉上加热，直至琼脂溶解，加热 过程中要不断搅拌，防止沸腾溢出，同时要注意补水，防止糊锅。
3. 调节 pH 将溶液定容至 100mL，用 NaOH 或 HCl 调节 pH 至 7.0-7.2。
4. 过滤 将溶液用纱布过滤，直至培养基澄清。
5. 分装 将培养基分装于试管和三角瓶中，试管不得超过试管的三分之一，
三角瓶不得超过五分之一。
6. 加塞 将棉塞塞入试管和三角瓶中，应松紧适度。
7. 包扎 用牛皮纸包扎好，一般 7 支试管一包，一个三角瓶一包。
8. 灭菌 加水——装锅——加热排气（2-3 次）——升压——保压灭菌
（0.1MPa,121.5℃，20-30min）——降压——出锅——搁置斜面或倒平板——无 菌检查（37℃，24-48h）
（二）、包扎培养皿（倒平板使用）
将培养皿 10 个一包，用报纸包好。
（三）、包扎移液管
将移液管每支用报纸包好，然后再用报纸将所有的移液管包成一包。
（四）、制备无菌水
在三角瓶中加入自来水，包扎好。
细菌培养基：牛肉膏 3g,蛋白胨 5g，NaCl 0.5g,琼脂 20g,水 1000mL,pH 7.0-7.2。
四、作业与思考题 1.完成实训报告。
2.培养基配制时应该注意什么问题？
3.灭菌应该注意什么问题？
五、考核评价
六、注意事项 1. 药品称量要精确
2. 溶化药品时应注意搅拌，防止沸腾。
3. 要注意培养基的 pH 值。
4. 培养基的分装：试管不超过三分之一，三角瓶不超过五分之一。
5. 使用灭菌锅应注意加水和用电安全。
任务二土壤中放线菌的分离 一、实验目的
1．学习稀有放线菌的选择性分离方法。
2．从以上稀有放线菌中寻找新型抗生素。
二、实验原理
放线菌是新型生物活性代谢产物的重要来源。然而由于大多数放线菌菌株已 被反复研究过，从中发现新化合物的概率在逐渐降低。新菌种必然有新的基因，
新基因必然产生新的代谢产物，这一观点早已为微生物学及微生物药物工作者所 接受。由瓦克斯曼( Waksman)建立的抗生素筛选系统适于从土壤微生物（主要是 从链霉菌）的代谢产物中来寻找抗生素，但要用该法发现新抗生素已变得越来越 难。20 世纪 50 年代后，人们发现稀有放线菌也具有产生抗生素的潜力，如紫色 小单孢菌可产生庆大霉素，诺卡氏菌可产生利福霉素，马杜拉放线菌可产生马杜 拉霉素、洋红霉素等。此外，稀有放线菌也能产生酶、维生素、氨基酸等其他生 理活性物质，因此，从稀有放线菌中寻找新型生理活性物质已成为当今发酵研究
序号 考核内容
评分标准(满分 100 分)
得分 正确熟练 正确不熟
练
在指导下
完成 不能完成
1 培养基配制 40 35 25 10
2 高压灭菌锅的使用 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合 格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
的热点之一。
分离稀有放线菌的操作与实验 1-1 大致相同，只不过需要用更高选择度的分 离培养基和分离条件。样品需先经干燥及高温处理以杀灭不耐热、不耐干燥的非 目的菌，再根据稀有放线菌对某些化学药品的抗性较强这一原理，用这些化学药 剂处理样品稀释液，以杀死链霉菌属的放线菌。为了尽可能增加目的放线菌的数 量，在培养基中还可加入这类稀有放线菌特有的抗生素。
三、实验器材与试剂
各小组根据选择的目标稀有放线菌，在查阅资料的基础上确定所需要的器材 与培养基，按方案申请器材，并领用（负责保管）
器材按以下主要器材，数量、规格及说明列表申请，并于表格上注明小组信 息。
如：培养皿（D=90mm, 50×6 套），
移液管（1mL ，8×6 支）， 三角瓶(250mL, 8×6)，……
注：建议全班分 6 小组，各器材请按小组配置；
试剂：按培养基内容及预制数量申请，配制后灭菌备用。
常用稀有放线菌培养基配方如下：
(1) HV 琼脂培养基(HVA)： 腐殖酸 1.0 g，CaCO3 0.02 g，Na2 HPO40.5 g，
MgS04.7H20 0.5 g， KCl 1.7 g，FeS04.7H20 0.01 g，维生素 B2 0.5 mg，维 生素 B1 0.5 mg，维生素 B6 0.5 mg，烟酸 0.5 mg，肌醇 0.5 mg，泛酸 0.5 mg，
生物素 0.25 mg，对氨基苯甲酸 0.5 mg，琼脂 20 g，水 1000 mL， pH 7.2。
(2) LSV - SE 琼脂培养基：木质素 1.0 g，豆饼粉 0.2 g，CaCO3 0.02 g，
Na2HP040.5 g，MgSO4．7H20 0.5 g，KC1 1.7 g，FeS04. 7H2 O 0.01 g，维生 素 B2 0.5 mg，维生素 B1 0.5 mg，维生素 B6 0.5 mg，烟酸 0.5 mg，肌醇 0.5 mg，
泛酸 0.5 mg，生物素 0.25 mg，对氨基苯甲酸 0.5 mg，琼脂 20 g，水 1000 mL，
pH 7.2。
(3) 土壤浸汁琼脂培养基：把富含有机物质的园土风干后过筛，称细土 400 g 加至 900 mL 自来水中，121℃(0.1 MPa)下蒸煮 30 min，静置冷却（过夜），上 清液用滤纸过滤，取滤液 250 mL，加腐殖酸（或木质素）1 g，琼脂 20 g，定容 至 1000 mL，调 pH 至 7.2。
(4) 淀粉酪素琼脂培养基：可溶性淀粉 10 g，水解酪素 2g，琼脂 20 g，水 1000 mL，pH 7.2。
(5) GYEA 培养基：葡萄糖 20 g，酵母浸膏 10 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL，
pH 自然。
四、实验步骤
各小组按以下资料或自己查阅资料，针对某一种类的稀有放线菌，进行分 离设计。
（一）样品的采集
选取较干燥，有机物质丰富的土壤，铲去表层杂草及土粒，采取 5~ 20 cm 深的土壤数十克，装入灭过菌的牛皮纸袋或培养皿内，带回实验室分离；土样采 集后应及时分离，或者将土样放在通风干燥处风干并保藏备用，保藏时间不宜过 长。
若要采集湖泊沉积物样品，可用采泥器采集表层泥样，装入铝盒或培养皿内，
编号记录后带回实验室分离。若不能及时分离，应放于 4℃冰箱保存；若在较长 的一段时间内不能分离，最好将样品放于 20%甘油中，- 20℃冷冻保藏。
（二）目标菌的分离：
1．小单孢菌的选择性分离
小单孢菌（Micromonospora）的基内菌丝发育良好，菌丝纤细，直径 0.3~0.6 μm，有分枝，气生菌丝无或偶见稀疏气生菌丝；孢子单生，柄有或无。菌落小，
直径 2—3 mm，橙黄色或红色，边缘深褐黑色或蓝色，表面覆盖一层粉状孢子。
该属放线菌可产生多种氨基糖苷类抗生素（如庆大霉素等），目前发现的抗生素 种类仅次于链霉菌属。小单孢菌是一类好气性腐生菌，分布十分广泛，土壤、水 体、高低温环境及碱性环境中均有分布。特别是湖泊沉积物中，数量可占放线菌 总数的 30%以上，在物质循环及毒物分解过程中起着重要的作用。
小单孢菌耐干燥，对苯酚的抗性强，对衣霉素和萘啶酸具有较高的耐受性，
因此可利用衣霉素和萘啶酸来抑制细菌、真菌和非目的放线菌的生长，选择性地 分离出小单孢菌。
(1)配制 HVA 培养基，准备好培养皿、无菌水、移液管、涂布棒等，0.1 MPa 灭菌备用。
(2)待 HVA 培养基冷却到 50℃左右，放到 50℃水浴锅中，以无菌操作方式加
入萘啶酸和衣霉素，使它们的浓度达到 20 mg/L，加入放线酮，使其浓度达到 50 mg/L，混匀后倒平板，凝固待用；
(3)取自然风干的土样 5g，加至 45 mL 无菌水中，摇匀，制成 10-1 壤悬浮 液。静止 2 min 后，吸取上层菌悬液 0.5 mL 至 4 mL 无菌水中，摇匀后再加 0.5 mL 15%的苯酚溶液，制成 10-2 土壤悬浮液（含 1.5 %苯酚），30℃处理 30 min 后，吸取 0.5mL 10-2 悬浮液至 4.5 mL 无菌水中，制成 10-3 悬浮液，同法制成 10-4 悬浮液。
(4)吸取 10-3 和 10-4 稀释液各 0.2 mL 涂布 HVA 平板，30℃恒温箱中倒置培 养，5d 后逐日观察。根据菌落形态挑取小单孢菌（可占总菌落数的 60%以上）。
2．小双孢菌的选择性分离 小双孢菌（Microbispora）的基内菌丝不产生 孢子，而气生菌丝上可形成成对的孢子。大多数小双孢菌需要 B 族维生素，特别 是维生素 B1 才能生长。 小双孢菌的孢子耐干燥，耐高温，100℃干热处理 15 min 不死亡，对苯酚和葡糖酸氯己啶的耐受性也比细菌强，可根据这些特性来选择性 地分离小双孢菌。
具体步骤为：(1)配制 HVA 培养基，准备好培养皿、无菌水、移液管及涂布 棒等，0.1 MPa 灭菌备用。(2)待 HVA 培养基冷却到 50℃左右，放到 50℃水浴锅 中，以无菌操作方式加入萘啶酸，使 它的浓度达到 20 mg/L，加入放线酮．使 它的浓度达到 50 mg/L，混匀后倒平板，凝固后待用。
(3)取土样自然风干，研细，放于 100℃恒温干燥箱中干热处理 15 min，拿 出冷却后称取 5g 样品，加至 45 mL 无菌水中，摇匀，制成 10-1 土壤悬浮液。
静止 2 min 后，吸取上层菌悬液 0.5 mL 至 4 mL 无菌水中，摇匀后再加 0.5 mL 15 % 的苯酚溶液和 0.05 mL 3%葡糖酸氯己啶溶液，制成 10-2 土壤悬浮液（含 1.5%
苯酚和 0.03 %葡糖酸氯己啶），30℃处理 15 min 后，吸取 0.5 mL 10-2 稀释液 至 4.5 mL 无菌水中，制成 10-3 稀释液。
(4)吸取 10 -3 稀释液 0.2 mL 涂布 HVA 平板，30℃恒温箱中倒置培养，5d 后逐日观察。
3．链孢囊菌的选择性分离
链孢囊菌（Streptosporangium,）的基内菌丝多分枝，横隔稀少，气生菌丝 发育良好，丛生或散生，呈白色或有些粉红色。孢子丝盘卷后可形成大小不一的 球形孢囊，孢囊孢子成熟后由圆锥形
4．游动放线菌的选择性分离
游动放线菌（Actinoplanes）无气生菌丝，基内菌丝分枝，其上直接生出短 小的孢囊柄顶端形成球形或略显不规则的孢囊，大小不等，孢囊内可形成多个孢 子，孢子呈直链状、螺旋状或不规则排列，球形或椭圆形，通常会有棱角，直径 1~1.5μm，成熟后具有鞭毛，可用来游动，因此称为游动放线菌。游动放线菌分 布广泛，我国发现的第一个新抗生素—创新霉素就是由济南放线菌产生的。目前 已从该属放线菌中分离到 150 多种抗生素，此外某些游动放线菌还可用来生产酶 和酶抑制剂。
游动放线菌的孢囊能耐受一定的干燥，而当其与水接触时又会释放游动孢子。
根据这一特性，可用脱水一再水化法从土样、腐叶及其他固体天然物质中来富集 分离。具体操作如下：
样品在 30℃下干燥 1~2 周后，称取 0.5g 加至装有 50 mL 无菌水的三角瓶中，
30℃培养 1h，前 30 min 不时摇动，后 30 min 静止培养。吸取 0.1~0.2 mL 上清 液涂布在含 100 mg/L 放线酮（或制霉菌素）的土壤浸汁琼脂培养基或淀粉酪素 琼脂培养基平板上，28℃培养 2~4 周后观察。
由于游动放线菌的孢子囊能被 Cl-和 Br-吸引．因此还可以用趋化法来分离。
分离装置简单，需一无菌塑料块，塑料块上有 2 个小圆窝，通过一毛细通道连接
（图 1-2）。取 1 g 土样放在 2 窝内，从边缘加无菌水，30℃培养约 1 h 后，孢 子即可在水中自由移动。用吸管将 0. 01 mol/L 的 KCl 溶液加至中间通道中，再 培养 1h，游动放线菌的孢子就会积聚在毛细通道里。吸取毛细通道内的富集液，
稀释后涂布在淀粉酪素琼脂平板上，28℃培养 1~3 周即可观察。
5．马杜拉放线菌的选择分离
马杜拉放线菌（Actinom,adura）的基内菌丝发达，气生菌丝发育中等或稀 少，成熟时气生菌丝上形成分生孢子链，或短或长，直形、钩形或不规则螺旋形。
可产生马杜拉霉素、洋红霉素等抗生素。分离时可在分离培养基中加入链霉素、
柔红霉素、新生霉素等来抑制其他杂菌的生长。
大多数马杜拉放线菌能够耐受一定浓度的利福平，在葡萄糖一酵母浸膏琼脂 ( GYEA)培养基中添加适量的利福平可以有效地抑制细菌和非目的放线菌的生长，
利福平也可用新生霉素( 25 mg/L)代替。分离程序为：
土样风干→100℃干热处理 15 min→制备土壤稀释液（10-1，10-2，10-3）
→吸 10-3 稀释液 0.2 mL 涂平板（GYEA+放线酮 100 mg/L+利福平 5 mg/L）。
第一部分 （二）纯培养与形态观察
一、实验目的
1．学习放线菌的纯化和鉴定方法。
2．掌握放线菌的形态鉴定技术。
二、实验原理
从混杂微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法为分离。纯种（纯培养）是 指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生 的后代。由于它们很微小，因此人们的肉眼无法观察到它们的存在。将分离得到 的各种菌进行纯培养，而后鉴定。
放线菌是介于细菌和真菌之间的一大类原核微生物，在自然界中分布广泛，
种类繁多，经济价值较大，许多菌株已为人类做出重大的贡献和带来了巨大的的 经济效益。鉴定放线菌时形态特征和生理特征兼用，同时配合化学鉴定方法和分 子鉴定方法，才能准确鉴定到种或属。
三、材料和方法 1．菌种
实验第一部分 筛选得到的未知放线菌菌株；如天蓝色链霉菌（Streptomyces parvullus ）， 细 黄 链 霉 菌 （ S ． miroflavua ）， 珊 瑚 色 诺 卡 氏 菌 （ Nocardia corallina），青铜小单胞菌（Micrornonosporachalcea）。
2．培养基
高氏一号培养基(可溶性淀粉 20. 00 g，KN03 1.00 g，NaCI 0.50g，K2 HP04 0.50g，MgS04 0. 50 g, FeS04 0.01 g．琼脂 20g，水 1 000 mL, pH 7.2～7.4)
3．方法
(1)纯化方法：采用三区划线法，用接种针黏取放线菌的孢子在高氏一号平 板上划线，在 28 ℃恒温箱中培养 5—7 d，挑取单菌落，再划线，再挑取单菌落，
重复 3~5 次的挑取单菌落后，接种高氏一号斜面，该菌株被视为纯化菌株。
(2)培养特征鉴定方法：配制用于放线菌鉴定的培养基（培养基配方见参考 资料。），把纯化好的放线菌接种各种培养基上，置 28℃培养，分别在 7 d.14 d 和 28 d 观察其培养特征和颜色变化。取稳定成熟的颜色特征为其培养特征，作 为定种的依据。观察记录：
①气生菌丝体颜色（即孢子丝未形成前的颜色）；
②孢子丝和孢子的颜色（即孢子丝成熟形成孢子堆的颜色）
③基质菌丝体的颜色（即菌落或菌苔背面的颜色）；
④可溶性色素的颜色（指渗入到培养基内色素的颜色）o (3)形态鉴定方法
①插片法：用灭菌的镊子将无菌盖玻片以 45 0 倾斜角插入高氏一号培养基 琼脂平板内，插入深约为 1/2 或 1/3，然后将放线菌接种到盖玻片与平皿培养基 的界面上，倒置于 28 CC 恒温培养箱培养 3~7 d 后，小心取出盖玻片（此时该玻 片上已有放线菌），有菌面朝上，放在载玻片上，置显微镜下观察。
②压印法：在凝固的高氏一号培养基平板上用划线分离法得到单一的放线 菌菌落。用灭菌的小刀（或刀片）挑取有单一菌落的培养基一小块，放在洁净的 载玻片上。用镊子取一洁净盖玻片，在火馅上稍微加热（注意：勿将盖玻片烤碎）， 然后把玻片盖放在带菌落的培养基小块上，再用小镊子轻轻压几下，使菌落的部 分菌丝体印压在盖玻片上。将印压好的盖玻片放在洁净的载玻片上（菌体朝向载 玻片），然后放置在显微镜下观察。
③埋片法：在已凝固的琼脂平板上用灭菌小刀切开两条小槽，宽度小于 1.5 cm。把放线菌接种在小槽边上，盖上已灭菌的盖玻片 1~2 片，盖好培养皿盖。
将制作好的平板放在 28 C|C 恒温箱培养 3~4 d。取出培养皿，可以打开皿盖，
将培养皿直接置于显微镜下观察；也可以取下盖玻片，将其放在洁净载波片上，
放在显微镜下观察。
四、预期结果
1．记录各个放线菌菌株的培养性状和形态鉴定结果。
2．查阅放线菌的鉴定检索表，初步判断鉴定菌株的类型。
思考题
1．在培养基上如何区分放线菌和真菌、放线菌和细菌的菌落形态？
2．什么类型的放线菌的菌落与细菌相似，如何分辨这些相似的类型？
参考文献
[l]阎逊初编著．放线菌的分类与鉴定[M]．北京：科学出版社，1992．
[2]周德庆主编．微生物学实验教程．2 版[M]．北京：高等教育出版社，2006．
五、注意事项
1．生长抑制物的浓度不能太高，处理时间不能过长，否则稀有放线菌也容 易死亡。
2．许多放线菌在干热下 100℃处理 30 min 不会死亡，但在湿热下只能用 50~55 ℃处理 30 min。样品如果用湿热处理，温度不能太高，时间不能太长。
六、思考题
1．阐述每一类稀有放线菌筛选时的富集培养的设计思路。并查找资料佐证。
2．除涂布法外，你还知道哪些分离方法？比较各种分离方法的优缺点。
七、考核评价
序号 考核内容
评分标准(满分 100 分)
得分 正确熟练 正确不熟
练
在指导下
完成 不能完成
1 培养基配制 40 35 25 10
2 土样的采集 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合 格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
项目三-『2』微生物培养技术及菌种保藏
一、项目训练目标：
（一）知识目标
掌握微生物培养基配制方法，土壤中细菌的分离技术。
（二）能力目标
1、熟悉微生物基础培养基配方。
2、掌握菌落总数测定的方法
3、掌握平板培养技术和液体培养技术。
4、掌握俊宗保藏的方法。
（三）素质目标
1.培养爱护公物的品质。
2.培养严谨细致的作风。
3.培养学生动手操作能力。
二、项目主要任务与课时安排：
序号 主要任务 课时
1 饮用水中菌落总数的测定 4
2 微生物的生理生化反应 4
3 平板培养技术和液体培养技术 4
4 菌种的保藏 4
合计 16
三、学生分组：
5 人/组 实训地点：
农业生化实训室
实训主要设备、器材：
小锅、灭菌锅、天平、电炉、漏斗、纱布、试管、培养皿、pH 试纸、橡 皮筋、报纸、棉花、烧杯、烘箱、移液器等。
任务一饮用水中菌落总数的测定 一、实验目的
1.掌握饮用水菌落总数检测的程序和方法；
2.了解检测饮用水中菌落总数的卫生学意义；
3.能够对饮用水中菌落总数检测结果做出准确、
规范的报告。
二、实验内容
•利用平板计数法检测三种不同来源的水中的 菌落总数（分组进行）
一、四组：桶装水 二、五组：自来水
三、六组：池水（8 教前面小水池）
水样采取方法
•1、自来水样的采取：
先用火焰灼烧自来水龙头 3min（灭菌），然后打开水龙头排水 5min（排除管 道内积存的死水），再用无菌三角瓶接取水样（约 50ml）。
•2、池水：
采集表层水水样时,可用适当的容器如塑料筒等直接采取。
三、实验材料与试剂 1.仪器
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
1.1 恒温培养箱：36℃±1℃。1.2 冰箱：2℃～5℃。1.3 恒温水浴箱：46±1℃。
1.4 天平：感量为 0.1g。1.5pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸 1.6 磁力搅拌 器（能加热）1.7 微波炉
2.试剂
胰蛋白胨，酵母浸膏，葡萄糖，琼脂，蒸馏水，氯化钠 四、实验步骤
1、将试管和平板拆开，分别做好标记。
2、将无菌生理盐水分装于试管中，9ml/管，此时吸取 1ml 生理盐水到皿。
3、以无菌移液管吸取 25mL 样品置盛有 225LmL 生理盐水的无菌锥形瓶中，
充分混匀，制成 1:10 的样品匀液，此时吸取 1ml 稀释液到平皿。
4、用 1mL 无菌移液管吸取 1:10 样品匀液 1mL，沿管壁缓慢注于盛有 9mL 稀
释液的无菌试管中（注意：移液管尖端不要触及稀释液面），振摇试管使其混合 均匀，制成 1:100 的样品匀液，此时吸取 1ml 稀释液到平皿。
5、按上一步操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换 用 1 次 1mL 无菌移液管。
6、稀释样品后，依次将 3 个稀释度的样品匀液，在进行 10 倍递增稀释时，
吸取 1mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
7、及时将 15～20mL 冷却至 46℃的平板计数琼脂
培养基（可放置于 46±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，在台面上轻轻摇 动平皿使其混合均匀。
8、待琼脂凝固后，将平板翻转，36±1℃培养 48h±2h。
9、可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的 菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。(1) 选取菌落 30CFU300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30CFU 的平板记录具体菌落数，大于 300CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落 数应采用两个平板的平均数。
(2)其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落
生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中 菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以 2，代表一个平板菌落数。
(3)当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个 菌落计数。
五、作业与思考题
1、稀释分离时，为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到 46℃左右才能倾入 培养皿内？
2、完成实验报告。
六、考核评价
任务二微生物的生理生化反应
一、目的要求
1.了解细菌的一般生化反应；
2.了解细菌的生化鉴定方法其原理 二、实验材料
菌种：大肠杆菌；枯草杆菌。
培养基：淀粉培养基（黄色固体需融化倒平板）；葡萄糖蛋白胨水培养基（黄色 液体，甲基红用）。
试剂：碘液；甲基红试剂。
三、实验原理及方法
由于各种微生物的新陈代谢类型不同，因此，对各种物质利用后所产生的代谢产 物也不同，我们可以用化学反应来测定微生物的代谢产物，这种反应称为生化反
序号 考核内容 评分标准(满分 100 分) 得分
正确熟练 正确不
熟练
在指导 下完成
不能 完成
1 培养基配制 40 35 25 10
2 菌落总数计算的方法 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12 （ 合 格）
6（不 合格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
应。生化反应常用来鉴别在形态或其它方面不易区别的微生物，例如：肠道细菌 中，大肠杆菌和伤寒杆菌，二者在形态上不易区分，但前者能发酵乳糖，后者不 能。因此可以从它们能否发酵乳糖来区别它们，所以微生物的生化反应是微生物 分类鉴定的重要依据之一。
四、方法步骤
1．甲基红试验（M·R 试验）某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能产生大 量的酸，使 pH 降低至 4～5，它先产生丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、
乳酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示（有效 pH 范围为 4.2～
6.3）。细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的桔黄色，变为红色，即为甲基红 反应。
实验步骤：（1）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，一支接种大肠杆菌，第二支 接自己分离的大肠杆菌，第三支接枯草杆菌，第四支不接种，作空白对照。在各 试管上标明菌名和组别，置 37℃培养 24 小时。大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，
枯草杆菌，空白对照。
（2）培养后取出，沿管壁加入甲基红指示剂 3～4 滴上层呈红色者为阳性。
2．淀粉水解试验某些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶（胞外酶）， 使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再变蓝 色。
实验步骤：（1）淀粉培养基在水浴中融化后，冷至 50℃，以无菌操作制成平板。
用接种环取少量枯草杆菌在平板的一边划“+”字形接种（或点种），另取少量大 肠杆菌在平板的另一边接种，在各培养皿底部标明菌名和组别。置 37℃温箱中 培养 16～20 小时。大肠杆菌，枯草杆菌。
（2）观察结果：打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，
使碘液均匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解。透 明圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。
五、结果与思考题
1．将实验结果填于实验报告中。试验结果：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性 反应。
2．细菌的生化反应试验意义何在？
六、考核评价
任务三微生物液体培养技术 一、实验目的
1.掌握液体接种技术。
2.掌握发酵罐结构。
二、实验器材
三角瓶、接种环、振荡培养箱、酒精灯、移液枪、超净工作台、发酵罐等 三、实验方法和步骤
（一）摇瓶培养技术
1.技术路线 斜面接种—活化—摇瓶接种—振荡培养—收获
2.操作步骤 菌种活化—摇瓶接种（一般在 500mL 三角瓶中装液体培养基 100mL，接种量一般为 10%）—振荡培养及收获（细菌一般在 30℃，380～480r/min 振荡，培养 24～48h，真菌为 28℃，200～300r/min 振荡，培养 48～72h，就可 以收获了。）
（二）发酵罐液体深层培养技术
序号 考核内容
评分标准(满分 100 分) 正确熟练 正确不熟 得分
练
在指导下
完成 不能完成
1 高压灭菌锅的正确使用 40 35 25 10
2 超净工作台的正确使用 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合 格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
1.技术路线 斜面接种—活化—摇瓶种子培养—发酵罐接种—发酵与控制
—放罐—收获
2.操作步骤 菌种活化—摇瓶接种培养（同摇瓶培养技术）—发酵罐接种（发 酵罐接种一般在火环保护下接种，接种量一般为 10%，种子要求处于对数生长期 或者快速生长期）—发酵与控制（在发酵过程中，要进行控温、控 pH、控通气 量、控转速、中间补料及消泡等操作，及时检测生物量、残糖量、粗蛋白含量等 指标）—放罐与收获（通过各种指标的测定，综合判断发酵终点，收获发酵产物 或者进一步提取分离）
四、注意事项
1.摇瓶接种培养时，一定要注意防止杂菌污染，保证培养环境洁净。
2.发酵罐接种时，应注意保持罐压在 0.05MPa，停止搅拌，接种要快、准、
稳。
3.发酵罐培养过程中要注意防止杂菌污染，及时取样检查和测定各项指标，
保证发酵正常进行。
五、考核评价
任务四菌种保藏
一、目的要求
1.学习和掌握菌种保藏的基本原理。
2.比较几种不同的保藏方法。
二、仪器、药品
大肠杆菌，肉膏蛋白胨斜面培养基，LB 液体培养基，灭菌水，化学纯的液 体石蜡，甘油，95%乙醇，灭菌吸管，灭菌培养基，冰箱，低温冰箱（-30℃）。
三、方法步骤 (一)液体石蜡法
1.将液体石蜡分装于试管中，塞上棉塞并用牛皮纸包扎,121℃灭菌 30 min.
然后放在 40℃温箱中使水汽蒸发后备用。
2.将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基上培养，直到菌体健壮或孢子成 熟。3.用无菌吸管吸取无菌的液体石蜡，加人已长好菌的斜面上，其用量以高出
序号 考核内容
评分标准(满分 100 分)
得分 正确熟练 正确不熟
练
在指导下
完成 不能完成
1 发酵罐结构的认识 40 35 25 10
2 液体培养基接种操作技术 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合 格）
总 分
优秀:>90 分 良好:81-89 分 中等:71-80 分 合格:60-70 分 不合格:<60 分
