丙胺分解菌對人工合成廢水中丙胺去除之研究

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中華民國九十九年十一月十二、十三日屏東縣國立屏東科技大學環境工程與科學系 1

丙胺分解菌對人工合成廢水中丙胺去除之研究

陳秋豪，弘光科技大學環境與安全衛生工程系大專生王俊欽，弘光科技大學環境與安全衛生工程系副教授

計畫編號：NSC 98-2815-C-241-003-E 摘要

丙胺為常用之化學物質，為避免使用過程中造成生態影響及環境傷害，故本研究希望從環境中獲得可去除丙胺之純種菌株，亦即從都市污水處理廠、水性聚氨基甲酸乙酯樹脂製造廠廢水處理廠與水稻田中獲得污泥或土壤，將該污泥或土壤以丙胺馴養後，希望能從馴養之污泥中分離及篩選出可以去除丙胺的分解菌，

並探討丙胺分解菌對人工合成廢水丙胺之去除情形。結果顯示，從丙胺馴養過的混合族群中篩出獲得7 株菌，該 7 株菌經初步生長測試僅菌株 R-5 利用丙胺生長之情形最好。經批次實驗顯示菌株 R-5 可利用人工合成廢水中 1000mg/l 以下之丙胺生長，且對1000 mg/l 以下之丙胺有 100％之去除率。

關鍵字：丙胺、生物分解、批次實驗 一、前言

丙胺(N-propylamine)屬脂肪單胺，廣泛應用於製藥、塗料、農藥、橡膠、纖維、紡織物處理劑、石油添加劑、防腐劑和化學試劑等(上海協辰貿易發展有限公司，2009)。丙胺經微生物分解後會產生氨氮[氨氮會消耗水中溶氧，危害魚貝類的生存、與氯作用生成致癌前驅物質(三鹵甲烷)、促進水中植物與藻類的生長，加速水體優氧化、經過硝化作用後會轉變成硝酸鹽氮及亞硝酸鹽氮，可能導致藍嬰症(變性血色蛋白血症)(Shuval and Gruener, 1977)及產生致癌、致突變及致畸形之亞硝胺、濃度超過1 mg/l 時會引起銅管腐蝕]，故含有丙胺之廢水，若未經妥善處理就予以放流或釋放，對人類健康、生活環境與環境生態會造成重大影響(Cornelis et al., 2008)。

學者Cornelis等人從荷蘭Duiven之污水處理廠的活性污泥中，分離得到一株菌BERT，該菌株利用正辛胺(octylamine)生長後，可氧化含3至18烷基鏈之烷基胺；此外，氧化正己胺(hexylamine)、正辛胺、正葵胺(decylamine)時，菌株之活性較高，約76-88 nmol/min/mg protein；但氧化丙胺時，菌株之活性較低(7 nmol/min/mg protein)(Cornelis et al., 2008)。由學者Cornelis等人之研究可知，丙胺利用微生物去除效果較差，因此本研究希望從環境中獲得可去除丙胺之純種菌株，亦即從都市污水處理廠、水性聚氨基甲酸乙酯樹脂製造廠廢水處理廠與水稻

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田中獲得污泥或土壤，將該污泥或土壤以丙胺馴養後，希望能從馴養之污泥中分離及篩選出可以去除丙胺的分解菌，並探討丙胺分解菌對人工合成廢水丙胺之去除情形。

二、實驗方法

1.污泥(土壤)來源

本研究採用(1)都市污水處理廠之活性污泥槽、(2)水性聚氨基甲酸乙酯樹脂製造廠廢水處理廠活性污泥槽、(3)水稻田之污泥進行丙胺分解菌之分離。

2.污泥(土壤)馴養

將從都市、水性聚氨基甲酸乙酯樹脂製造廠廢水處理廠及水稻田中取回之污泥，裝入一個反應槽中，並於反應槽中進流含不同濃度丙胺之人工合成廢水[磷酸鹽緩衝液(PBM)]，以進行丙胺混合族群馴養。PBM 之成份及濃度(王等，2007) 如表1 及表 2 所述。

表1、磷酸鹽緩衝液(PBM)之成份及濃度化合物名稱濃度

K2HPO4 1.5 g/l

KH2PO4 1.5 g/l

MgSO4．7H2O 0.2 g/l CaCl2．2H2O 0.02 g/l

微量元素 10 ml/l

表2、微量元素之成份及濃度化合物名稱濃度

FeSO4．7H2O 300 mg/l MgCl2．4H2O 180 mg/l CoCl2．6H2O 106 mg/l Na2MoO4．2H2O 34 mg/l

ZnSO4．7H2O 40 mg/l 3.菌種分離及篩選

將取回之污泥經上述方法馴養後，以下列步驟進行分離。首先配製僅含丙胺為基質之培養基及R2A 培養基，爾後將馴養之污泥依 10 倍稀釋方式進行稀釋系列配製，然後以抹碟方式將不同濁度(吸光度值)之污泥，於僅含丙胺為基質培養或R2A 培養基上塗抹，塗抹後將培養皿置於 30℃下培養以獲得單一菌落(株)。

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4.菌種測試

純種菌株獲得後則進行初步測試，以瞭解篩選所得之菌株確實可以去除丙胺，測試方法如下：以無菌棉花棒移植培養皿上的純菌至磷酸鹽緩衝液(PBM)的無菌燒杯中，並以分光光度計於波長600 nm 下調整菌液吸光值為 0.1～0.2，再於120 ml 血清瓶中加入 40 ml 之上述含菌 PBM，並加入適當濃度之丙胺，置於 30℃恆溫下以 120 rpm 振盪培養 1～7 天，觀察培養液是否呈現混濁。若菌液呈現混濁，則抽取菌液，加以OPA 衍生化反應，再以 0.22μm Millipore PVDF 濾膜過濾後，以HPLC-FL 分析丙胺是否去除。若有丙胺減少，則初步顯示該純種菌株能利用丙胺為基質進行生長。

5.純種菌株去除人工合成廢水中丙胺之批次實驗

將菌種測試中，利用丙胺生長情形較好的純種菌株進行純種菌株去除人工合城廢水中丙胺之批次實驗。首先將利用丙胺生長情況較好之菌株接種於培養基上，並將該培養皿置於30°C 下培養 1 天，然後以無菌棉花棒移植培養皿上的純菌至磷酸鹽緩衝液(PBM)的無菌燒杯中，並以分光光度計於波長 600 nm 下調整菌液吸光值為0.1～0.2，再於 120 ml 血清瓶中加入 40 ml 之上述含菌 PBM，並分別加入適當濃度之丙胺，再以 Teflon/Silicon 之墊片加上鋁蓋予以密封後。置於30℃恆溫下以 120 rpm 振盪培養，並定期採樣分析。分析項目包括丙胺濃度、

酸鹼度值、吸光度值。

6.分析條件 (1)丙胺

以丙胺為基質之批次實驗是以液相層析儀-螢光偵檢器[High Performance Liquid Chromatography-Fluorescent Detector(HPLC-FL)，HITACHI L-2485]進行分析。將實驗過程中定期所取之樣品，加以 OPA 衍生化反應後，以 0.22 μm(Millex®-GV、PVDF)濾膜過濾，再以微量針筒(廠牌 HAMILTON、型號 80465) 抽取濾液20μL 注入 HPLC-FL 分析，分析條件如表 3 所示。

表3、利用HPLC-FL分析丙胺之條件

分析管柱 Both are C18

馬達流速 1.0 mL/min

流動相乙腈70%+去離子水30%

OPA試劑

二硫基乙醇 60 mM OPA 4 g/L 四硼酸二鈉 90 mM Ex / Em 334/458 nm

樣品量:OPA試劑 1:1

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(2)菌群 O.D.600值

菌群O.D.600值是以單光束分光光度計(型號 UV-7504C)於波長 600 nm 下監測菌株之吸光度值變化。

(3)菌液 pH 值

監測pH 值變化所用之 pH meter METTLER TOLEDO、型號 SevenEasy，而電極之型號為lnLab®R413。

三、結果與討論

1.純種菌株以丙胺為基質進行生長之初步試驗結果

為瞭解本實驗篩選所得之純種菌株確實可以去除丙胺，故進行此研究。表4 為純種菌株利用丙胺生長之初步實驗結果。由表4 可知，菌株 R-1 至 R-4 與菌株 P-2 無法利用丙胺生長，而菌株 R-5 利用丙胺生長之情形最好，因此後續實驗則以菌株R-5 為主。

表4、純種菌株利用丙胺生長之初步實驗情形

菌株編號生長試驗

50 mg/L 200 mg/L R-1 — △ R-2 — △ R-3 — △

R-4 — —

R-5 △ ＋＋

P-1 △ △

P-2 — —

—：菌株沒有生長或菌株最高 O.D.600值與初始O.D.600值之差值＜0.05。

△：菌株最高O.D.600值與初始O.D. 600值之差值達0.05~0.1。

＋：菌株最高O.D. 600值與初始O.D. 600值之差值達0.1~0.2。

＋＋：菌株最高O.D. 600值與初始O.D. 600值之差值達0.2~0.3

菌株R-N 為本實驗進行時，利用以 R2A 培養基分離所得的純種菌株，菌株 P-N 為本實驗進行時，利用僅含丙胺為基質分離所得的純種菌株。其中 N 表阿拉伯數字。

2. 純種菌株去除人工合成廢水中丙胺之批次試驗結果

圖1 為純種菌株 R-5 對人工合成廢水中 200 mg/l 丙胺之去除情形。由圖中可知，200 mg/l 丙胺於 20、36 及 52 小時被去除 21.2、47.6 及 71%，至 56 小時完全去除。pH 值隨丙胺被去除有些微下降之趨勢，至 56 小時為 6.92。菌株 O.D.600

(5)

值隨丙胺被去除而增加，至56 小時為 0.542。

0 50 100 150 200 250

0 10 20 30 40 50 60

time (hr)

propylamine (mg/l

0 1 2 3 4 5 6 7 8

pH, O.D.600×10

propylamine pH O.D.600

圖1、純種菌株對人工合成廢水中 200 mg/l 丙胺之去除情形

純種菌株R-5 對人工合成廢水中 400 mg/l 丙胺之去除情形如圖 2 所示。由圖中可知，400 mg/l 丙胺於 26、50 與 74 小時被去除 28.6、64.6 與 95.9%，至 76 小時完全去除。菌株 O.D.600值與 pH 值亦隨隨丙胺被去除而上昇或下降，至 76 小時分別為0.564 與 6.75。

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

0 10 20 30 40 50 60 70 80

time (hr)

propylamine (mg/l

0 1 2 3 4 5 6 7 8

pH, O.D.600×10

圖3 為純種菌株 R-5 對人工合成廢水中 600 mg/l 丙胺之去除情形。由圖中可知，600 mg/l 丙胺於 64、84 及 98 小時被去除 60.4%、72.7%及 96%，至 112 小時完全去除。菌株 O.D.600值與 pH 值亦隨隨丙胺被去除而上昇或下降，至 112

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小時分別為0.599 與 6.8。

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0 20 40 60 80 100 120

time (hr)

propylamine (mg/l

0 1 2 3 4 5 6 7 8

pH, O.D.600×10

純種菌株R-5 對人工合成廢水中 800 mg/l 丙胺之去除情形如圖 4 所示。由圖中可知，800mg/l 丙胺於 60、96 與 118 小時被去除 23.9%、73.8%與 75.9%，至 166 小時完全去除。菌株 O.D.600值與pH 值亦隨隨丙胺被去除而上昇或下降，至 166 小時分別為 0.553 與 6.85。

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

time (hr)

propylamine (mg/l

0 1 2 3 4 5 6 7 8

pH, O.D.600×10

圖5 為純種菌株 R-5 對人工合成廢水中 1000 mg/l 丙胺之去除情形。由圖中可知，1000 mg/l 丙胺於 72、96 及 118 小時被去除 36.5%、66.7%及 90.5%，至

(7)

166 小時完全去除。菌株 O.D.600值與pH 值亦隨隨丙胺被去除而上昇或下降，至 166 小時分別為 0.576 與 6.7。

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

time (hr)

propylamine (mg/l

0 1 2 3 4 5 6 7 8

pH, O.D.600×10

圖5、純種菌株對人工合成廢水中 1000 mg/l 丙胺之去除情形四、結論

1.從丙胺馴養過的混合族群中篩出獲得 7 株菌，該 7 株菌經初步生長測試僅菌株 R-5 利用丙胺生長之情形最好。

2.菌株 R-5 可利用人工合成廢水中 1000mg/l 以下之丙胺生長，且對 1000 mg/l 以下之丙胺有100％之去除率。

五、誌謝

本研究承國科會提供經費(計畫編號：NSC 98-2815-C-241-003-E)，方得以順利完成，謹此致謝。

六、參考文獻

1. 上海協辰貿易發展有限公司。2009。

網址：http://www.xiechen.com/Products/ProClass036.html。

2. Shuval, H. I., Gruener, N., 1977. Infant methemoglobinemia and other healtheffects of nitrate in drinking water. Progress in water technology.8,183-193.

3. Cornelis, G. van G., Annemarie, L., Bert, van der T., 2008. Substratespecificity of a long-chain alkylamine-degrading Pseudomonas spisolatedfrom activated sludge.

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Biodegradation. 19, 129-136.

4. 王俊欽、曾俊賢、葉宛琦，2007 “人工合成廢水中二甲胺及二乙胺去除之研究”，中華民國環境工程學會第十九屆年會暨各專門學術研討會論文摘要集，

第129 頁，高雄市。