第五章 結論
5-1 HPLC 和 CE 分析方法的比較
目前中藥的化學品質評估，以高效液相層析法（high-performance liquid chromatography，HPLC）及毛細管電泳分析法（capillary electrophoresis，
CE）最為理想。兩者同屬液相分離技術，各有不同的分離機制及優缺點。
高效液相層析法（HPLC）分析技術，自 1930 年發展至今，軟硬體均 臻成熟，應用上也很廣泛。近年來，又發展出與質譜儀的銜接介面，可以 直接獲得有關組成化合物的分子量及結構方面的資料，已廣為運用到中藥 的分析上，惟當用於高極性或離子化合物時，須添加鹽類或配對離子，對 系統的平衡或管柱的壽命都有相當不利的影響。毛細管電泳（CE）分析技 術具有省時、樣品與溶劑用量少、易清洗等優點，尤其適合於離子化物質 的分析，是值得推廣的分析工具。表5-1-1 分類說明兩儀器的優缺點。
表5-1-1 HPLC 與 CE 的比較
HPLC CE
優點 1. 偵測極限值較小
2. 梯度沖提模式發展成熟 3. 分析樣品結構與分析方
法相關性發展較完全 4. 系統穩定性較佳
1. 管柱的個別差異較小 2. 分析時間短
3. 分析物的範圍較大 4. 分離模式選擇性大 5. 分析成本較低 6. 廢液較少 7. 理論板數較高
8. 電滲流流形(EOF)訊號對 稱性極佳，如圖5-1-1.a。
缺點 1. 不同分離管柱有個別的 差異，因此更換管柱常 造成分析圖譜不一致。
2. 管柱易因試劑長時間沖
1. 再現性較差
2. 樣品的偵測極限值較大 3. 梯度沖提方法尚未發展成
熟
3. 壓力驅動流形(層流)容 易 使 訊 號 變 寬 ， 如 圖 5-1-1.b。
4. 分析時間較長 5. 自動化限制多 6. 分析成本高。
本研究已完成桂皮、牡丹皮中單寧成分之中藥分析方法，可作為中藥 品質評估的工具及辨識中藥材基原的另類選擇。
5-2 桂皮藥材之分析
5-2-1 桂皮藥材之 HPLC 及 CE 分析
桂皮為樟科植物的乾燥根皮，含cinnamaldehyde、cinnamyl alcohol、
cinnamic acid、cinnamyl acetate、coumarin、tannin 等類化合物。Tannins 是 很多藥材共有的組成，有一定的生物活性，我們以其中七個tannin 為指標，
利用高效液相層析與毛細管電泳進行評價。實驗結果顯示，利用磷酸鹽與 氰甲烷混合液為移動相，HPLC 可在 60 分鐘內成功地分析出這七個成分；
CE 則以硼酸鹽及 SC 配製而成的緩衝溶液，以 MEKC 可達到分離七個成 分的目標。
茲就HPLC 與 CE 兩分析方法，依序比較如下：
一、系統之適宜性
針對桂皮藥材HPLC 及 CE 的分析方法，將分析條件及其適宜性作比 較，評估結果如表 5-2-1。在偵測極限上，以 HPLC 方法較好，但若考慮 樣品的注射量，則以CE 較佳，再現性方面，以 HPLC 優於 CE 方法。
表5-2-1 桂皮單寧之 HPLC 和 CE 分析方法比較
HPLC CE
偵測極限(µg/mL) 0.14 – 3.30 0.28 – 10.6 滯留 Intraday 0.11 – 0.55 % 1.12 – 1.95 % 再現性
(RSD，%) 時間 Interday 1.67 – 2.19 % 2.20 – 3.18 % 回收率 95 – 101 % 96 – 102 %
樣品注入量 10 µL 7.5 µL
二、分析時間
HPLC 的分析方法需要 60 分鐘才能完成，CE 的分析方法則只需 40 分 鐘。另考慮系統的平衡和沖洗時間，則此兩種分析方法所需的時間，如表 5-2-2 所示。
表5-2-2 HPLC 與 CE 操作時間（min）之比較
HPLC CE
每日儀器的前置作業 60 20
前洗時間 15 (此為平衡時間) 10
分析時間 60 40
後洗時間 無 19
一次檢測所需的時間 75 69
每日儀器後置作業 60 5
表中數據顯示，以單一次所需的分析時間而言（包括平衡或前洗、後 洗時間），HPLC 在 75 分鐘分析出七個成分，CE 在 69 分鐘分析出七個成 分，差異不大，但須有較長的後置作業。
三、理論板數
CE 特有的扁平流形( flat flow profile )，是 CE 高效的主要原因；HPLC 中移動相的流動是由泵控制，在正常的操作之下，這種壓力控制的流形呈
效率，圖5-2-1 表示 CE 與 HPLC 的不同流形。
圖5-2-1 CE 與 HPLC 之流形示意圖(a.電滲流流形 b.層流) [23]
在HPLC 及 CE 的最佳分析條件下，桂皮各成分的理論板數如表 5-2-3 所示，整體而言，CE 分析方法的理論板數普遍較高。
表5-2-3 各成分以 HPLC 及 CE 分析時的理論板數(N×104) Compounds HPLC CE
1 13.83 20.34 2 11.66 13.11 3 11.78 13.78 4 10.51 11.67 5 4.14 13.14 6 3.95 8.60 7 3.50 6.36
5-2-2 桂皮之萃取液分析
第二章第一節利用HPLC 分析桂皮之單寧成分，在標準品的分析上雖 有不錯的分離，但在藥材方面由於組成成分太多而使吸收峰無法回到基線 且單寧Procyanidin B-1 (3)、Procyanidin B-2 (4)化合物成分在桂皮藥材中 含量很少，加上單寧的吸收峰在210nm，使得基線非常不平整，對定量結 果的精確性有很大影響，因此在HPLC 分析中，若要得到良好的基線，藥 材萃取液須經適當的前處理。
5-3 牡丹皮藥材之分析
5-3-1 牡丹皮藥材之 HPLC 及 CE 分析
牡丹皮為毛茛科植物的乾燥根皮，含 paeonol、paeoniflorin、
campesterol、benzoyioxy-paeoniflorin、benzoylpaeoniflorin、tannin 等類化 合物。Tannins 是近十數年來才大量確認的組成，有一定的生物活性，我們 以其中8 個 tannin 為指標，利用高效液相層析與毛細管電泳進行分析。實 驗結果顯示，利用磷酸鹽與甲醇混合液為移動相，HPLC 可在 60 分鐘內成 功地分析出這8 個成分；CE 則以硼酸鹽及 SDS 配製而成的緩衝溶液，利 用MEKC 模式可達到分離 8 個成分的目標。
茲就HPLC 與 CE 兩分析方法，依序比較如下：
一、系統之適宜性
針對牡丹皮藥材HPLC 及 CE 的分析方法，將分析條件及其適宜性作 比較，評估結果如表5-3-1。在偵測極限上，以 CE 方法較好，再現性方面，
以HPLC 優於 CE 方法。
HPLC CE 偵測極限(µg/mL) 0.04 – 0.93 0.02 – 0.36
滯留 Intraday 0.28 – 0.56 % 0.50 – 0.96 % 再現性
(RSD，%) 時間 Interday 0.22 – 0.95 % 1.25 – 2.76 % 回收率 97 – 103 % 96 – 103 %
樣品注入量 10 µL 7.5 µL
二、分析時間
HPLC 的分析方法需要 60 分鐘才能完成，CE 的分析方法則只需 50 分 鐘。另考慮系統的平衡和沖洗時間，則此兩種分析方法所需的時間，如表 5-3-2 所示。
表5-3-2 HPLC 與 CE 操作時間（min）之比較
HPLC CE
每日儀器的前置作業 60 20
前洗時間 15 (此為平衡時間) 10
分析時間 60 50
後洗時間 無 19
一次檢測所需的時間 75 79
每日儀器後置作業 60 5
表中數據顯示，以單一次所需的分析時間而言（包括平衡或前洗、後 洗時間），HPLC 在 75 分鐘分析出七個成分，但 CE 在 79 分鐘分析出七個 成分。以HPLC 分析牡丹皮樣品較省時。
三、理論板數
CE 特有的扁平流形( flat flow profile )，是 CE 高效的主要原因；HPLC 中移動相的流動是由泵控制。在HPLC 及 CE 的最佳分析條件下，牡丹皮 各成分的理論板數如表5-3-3 所示，整體而言，CE 分析方法的理論板數普 遍較低，原因在CE 緩衝溶液中的 SDS 比例較高，所以滯留時間較長，以 致於理論板數較低。
表5-3-3 各成分以 HPLC 及 CE 分析時的理論板數(N×104) Compounds HPLC CE
1 13.72 6.35 2 11.61 6.10 3 11.58 4.74 4 10.54 4.52 5 5.14 3.83 6 6.66 5.33 7 5.44 6.75 8 6.00 8.46
5-3-2 牡丹皮之萃取液分析
表5-3-4 牡丹皮藥材萃取液之回收率（％）
化合物 1 2 3 4 5 6 7 8 回收率
（％） 90 80 90 84 89 80 84 97
牡丹皮藥材利用70％MeOH 為萃取液時單寧成分的含量較多；但是用 Silica 的 Sep-pak ，以 70%甲苯沖提的萃取液有較平穩基線，且回收率都 達到80％以上，如表 5-3-4 所示。所以本實驗用 Silica 的 Sep-pak 以 70%
甲苯處理做為牡丹皮藥材之萃取液方法。
牡丹皮為水解型單寧，在HPLC 及 CE 的最佳條件下，CE 分析方法的 單寧含量與HPLC 分析方法的單寧含量相差約八倍，原因是 CE 需在高電 場中分析各種分析物，所以水解型單寧易分解，以致於CE 分析方法的單 寧含量較低。若要定量水解型單寧選擇HPLC 較佳。
本研究收集川丹皮（Paeonia suffruticosa Andrew）、西昌丹皮(Paeonia delavayi Franch)共 23 批進行單寧成分的定量，利用定量結果之化學數據鑑 定不同品種的基原。實驗結果列於表5-4-1 中。
表5-4-1 川丹皮、西昌丹皮之定量結果
川丹皮（n=13） 西昌丹皮（n=10）
層 析 圖
3,4,6-tri-GG(5)無法偵測 10 成分皆有明顯吸收峰 譜 PN > Pf Pf 波峰突出
Pf > PN 平均總含量
0.561 ± 0.065 mg/g 1.390 ± 0.476 mg/g 定 3,4,6-tri-GG(2)平均含量
量 0.032 ± 0.009 mg/g 0.028 ± 0.012 mg/g 結
果 3,4,6-tri-GG(5)平均含量
≈ 0 0.175 ± 0.165 mg/g
paeonol（PN）平均含量
0.110 ± 0.031 mg/g 0.093 ± 0.059 mg/g
paeoniflorin （Pf）平均含量
0.035 ± 0.020 mg/g 0.125 ± 0.031 mg/g 單寧平均總含量
0.416 ± 0.089 mg/g 1.172 ± 0.176 mg/g 非單寧平均總含量
0.145 ± 0.053 mg/g 0.219 ± 0.069 mg/g
3/2*比值
<11.4 >15.2
*3,4,6-tri-GG(2)、1,2,3,4,6-penta-GG(3)
根據以上結果，可在川丹皮與西昌丹皮的定量數據中找出規則，作為 牡丹皮基原辨別時之化學依據。結果如表5-4-2。
表5-4-2 牡丹皮基原之化學辨識（西昌丹皮 vs. 川丹皮）
辨識依據
川丹皮
Paeonia suffruticosa
西昌丹皮 Paeonia delavayi
層析圖譜
3,4,6-tri-GG(5)無法偵測 滯留時間 35.2 分鐘處無 吸收
各成分皆有明顯吸收峰
總含量 0.561 ± 0.065 mg/g 1.390 ± 0.476 mg/g
3,4,6-tri-GG(5) 無法偵測 0.175± 0.165 mg/g
PN/Pf* > 1 < 1
3/2* <11.4 >15.2
*3,4,6-tri-GG(2)：41.4min
1,2,3,4,6-penta-GG(3)：44.1min
*paeoniflorin （Pf）、paeonol（PN）
