大學工程生物教育整合型研究計畫---融合分子生物科學與工程之生物分子工程學程研究(I)

行政院國家科學委員會專題研究計畫 期中進度報告

融合分子生物科學與工程之生物分子工程學程研究(1/2)

計畫類別： 整合型計畫

計畫編號： NSC93-2522-S-011-001-

執行期間： 93 年 08 月 01 日至 94 年 07 月 31 日 執行單位： 國立臺灣科技大學化學工程系

計畫主持人： 李振綱

共同主持人： 楊銘乾，林陳涌 計畫參與人員： 楊佩芬 簡良榮

報告類型： 精簡報告

處理方式： 本計畫可公開查詢

中 華 民 國 94 年 6 月 13 日

1

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 成果報告 □ 期中進度報告■

九十三年度【大學工程生物教育整合型研究計畫－融合分子生物 科學與工程之生物分子工程學程研究(1/2) 】

計畫類別：□ 個別型計畫 □ 整合型計畫 計畫編號：NSC 93－2522－S －011－001－

執行期間： 93 年 8 月 1 日至 94 年 7 月 31 日

計畫主持人：李振綱

共同主持人：楊銘乾、林陳湧

計畫參與人員： 陳秀美、曾文祺、楊佩芬、簡良榮

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：■精簡報告 □完整報告

本成果報告包括以下應繳交之附件：

□赴國外出差或研習心得報告一份

□赴大陸地區出差或研習心得報告一份

□出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份

□國際合作研究計畫國外研究報告書一份

處理方式：除產學合作研究計畫、提升產業技術及人才培育研究計畫、

列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

□涉及專利或其他智慧財產權，□一年□二年後可公開查詢

執行單位：台灣科技大學

中 華 民 國 94 年 5 月 31 日

2

一、 中文摘要

整合台灣科技大學化學工程及高分子工程學系大學部及研究所原有之生物相關課程，設 計規劃一「生物分子工程學程」，將學程課程內容設計為符合本校化學相關工程與生命 科學之跨領域教育，幫助工程背景學生學習生命科學相關基礎學科，並教導學生利用已 具備之化學相關工程背景知識，以實作課程學習解決生物領域相關工程問題，使學生具 備有解決生物科技產業化可能面臨之問題的能力，以因應未來生物科技相關產業快速發 展的世界。

二、英文摘要

Most of the undergraduate students of National Taiwan University of Science and Technology have no enough biological science knowledge because there is no biology related courses offered during their study in the senior high technical-school. In order to extend student’s future career in the field of biotechnology-related industry, in this project we proposed a bio molecular engineering program for our students mostly from Department of Chemical Engineering and Department of Polymer Science because those students have better chemistry background. Students in this program are required to take Biology, Biochemistry, and Biotechnology courses in order to intensify their lacked modern biotechnology knowledge. In addition, students are required to learn basic hand-on bio-laboratory techniques by taking Fundamental Biomolecular Engineering Laboratory. After the students acquired enough modern biotechnology knowledge and experimental techniques, the students are required to accomplish a biological process project by using integrated engineering and biology knowledge. In this proposed biomolecular engineering program project, some basic lab works and bioprocess projected are designed and the related experimental procedures and background knowledge will be written to provide students a better learning process. We hope this program will prepare engineering students for entering the booming modern biotechnology industry.

Keywords: biomolecualr engineering; integrated engineering and biology education, technical university student, biotechnology.

3

二、 報告內容

前言

近年來隨著人類基因解碼的完成，國內外醫藥生物相關技術產業都蓬勃發展，因 應此趨勢的發展，國內各大學紛紛成立生命科學或生物技術相關系所，培育生物科學 研究人才，少有學校培育能與生物科技結合的跨領域人才，若無互補性跨領域之工程 背景人才參與，生物科技產業之製造程序無法有效控制管理，生產製造無法最適化，

技術產品不易推廣應用，產品商業化的目的無法順利達成，因此培育能與生物科技互 補結合的跨領域工程人才參與生物科技產業的發展是十分迫切。

目的

一般科技大學工學院的學生因為在分科較早，大多數學生的生物科學的知識多只 停留在國中程度，因此本研究計畫之目的，在規劃可以兼顧科技大學工程學院學生的 背景知識與未來生涯發展需求的生物科技課程，使工學院大學部學生能夠對生命科學 及生物技術的基本知識和未來發展有基本的認識與了解，使研究所的研究生能夠具有 發覺並解決與生物相關的工程問題的能力。

規劃方向

生物科技的領域十分廣泛，從農業、食品、一直到醫療都包括在其中，但回歸到 生物的基本結構來看，其實都是在探討研究相同的生物分子如 DNA、 RNA、蛋白質、

多醣類等，因此本教育計畫是以生物分子為主要基礎來規劃、設計工程生物的整合教 育課程，本計畫之總體目標為建立融合分子生物科學與工程之生物分子工程學程教 育，生物分子工程(biomolecular engineering) (有關生物分子工程的重要可考 ”Recent progress in biomolecular engineering” Biotechnol. Prog. 2000, 16, 2-16.)是融合了分子生 物技術、細胞科學、及工程的一門新且重要的領域，此領域主要是探討如何利用生物 分子（如核酸、蛋白質等）及生物分子程序（生物分子之間交互作用、催化反應等）

去發現高價值的生物分子，或者是如何去利用各種細胞做為高價值的生物分子的生產 工廠，更有效率的產生出此高價值的生物分子，所運用的生物知識與技術主要是包括 生物化學、分子生物學、蛋白質化學，基因重組技術，蛋白質工程等，所運用的工程

4

知識與技術則包括了動力學、動量、質量、及能量的輸送現象。由於生物分子工程與 化學工程領域息息相關，國外不少化學工程系所(U. Illinois, Urbana Champagne; Cornell U.)已改名附加上生物分子工程，朝向生物分子工程方向積極發展。本校之化工及高分 子工程，其必修科程中已經包括有生物分子工程中所需之工程與技術知識，因此針對 本校工程學院之化工、高分子等領域的學生規劃設計生物分子工程學程，以期增加學 生在生物科技上之知識與技能，拓展其就業領域，並為國家生物產業之發展提供所需 之高級人才。

實行方法

學程課程規劃 科目總表:

A. 大學部需修滿學程課程 13 學分，包括專業科目生物工程 (3 學分)及生物分子 工程基礎實驗(1 學分)兩門，基礎課程包括師大生科系支援教授之普通生物 學、生物化學，基礎分子生物學、生物技術(各三學分)至少三門。

B. 研究所學程則需修滿學程課程 10 學分，包括專業科目生物分子工程 (3 學分) 及生物分子工程實驗(1 學分)兩門，及其他專業相關課程應用微生物、基因重 組技術、酵素工程至少兩門。

學程時間表

學期 課程 一下 普通生物 二上 生物化學

二下 生物化學 生物技術

三上 基礎分子生物學 三下 生物分子工程基礎實驗 四上 生化工程 研究所上 生物分子工程、酵素工程 研究所下 應用微生物、基因重組技術 研究所暑假 生物分子工程實驗

大學部學程學生需以生物工程相關專題完成本校必修之專題研究課程，此學程之評量 重點之一在於專題研究成果之展示：

實驗專題成果海報展

本學程計畫中最主要的部分是增添本校所最欠缺的生物相關實驗規劃，此實 驗內容包括兩部分一為基礎核心的生物分子實驗，另一為需做出實物成品的 應用專題實驗，因此在學期末課程結束時將要求學生以專題實驗海報展的方 式呈現其學習成果，並作為此學程的評量特色之一。

此外也將編撰學程教材，其成果也將上網展示

5

有關『生物分子工程學程』的課程，將由任課教師負責教材編撰，亦將推動 教材上網，透過此方式普遍傳達生物工程慨念。並將架設台科大生物分子工 程學程網站，增進國內外此學程之交流。

三、 計畫成果

第一年計有四年制及二年制化工系學生二十名加入學程，93 年度寒假期間(1/20-1/26/2005) 全天進行生物分子工程基礎實驗，所編撰完成之實驗教材如附件一，實驗流程安排及學生 分組，學生完成之報告已公告陳列在所建構之生物分子學程網頁 http://140.118.6.141/其首 頁如下。此外學程之專題研究題目介紹及學生專題研究題目之分組也已完成，各組之專題 研究也正在進行中，相關資料也都呈現於網頁中。

Biomolecular Engineering Laboratory Fundamental Lab Work

基礎生物分子工程實驗

一、基礎實驗項目 1. Pipet 使用

2. 分光光度計原理及使用 3. 無菌操作及滅菌釜操作

4. 培養皿劃菌、篩菌、活菌菌落數(CFU) 5. 搖瓶培養菌體生長曲線

6. 菌液離心回收菌體細胞打破 7. 蛋白質及 DNA 電泳

8. DNA 質體回收純化

9. 蛋白質離子交換層析分離 10. 蛋白質金屬層析分離

11. 酵素活性測定(initial rate of absorbance increase) 二、生物分子工程實驗專題

1. Biological Fuel Cell

2. Bacterial Cellulose Production and Applications

3. Antibiotic Peptides Production by Lactic Acid Bacteria

4. Immobilized Enzymes or Cells as Biocatalyst for Biotransformations

三、實行方式

九十三學年寒假期間利用兩星期時間，每日上午兩小時課堂講解原理，其 餘時間進行實驗，下學期學期中及暑假時進行各組所選定之專題，暑假中 旬八月初各組報告並貼出海報進行觀摩。

【一般規定】

1.上課第一天請先熟悉環境，察看緊急沖洗站、洗眼站、滅火器、急救箱 及安全梯等的位置，牢記「安全」是進行任何實驗最重要的考量。

2.在實驗室內請穿著實驗衣（最好長及膝蓋下），避免穿著涼鞋、拖鞋（腳 趾不要裸露），配戴眼鏡或安全護目鏡。留有長髮者，戴帽套將頭髮捲 入套內，或以橡皮圈束於後，以防止引火危險或污染實驗。

3.在實驗室內禁止吸煙、吃東西、飲食、化妝、嚼口香糖、嬉戲奔跑，食 物飲料勿存放於實驗室的冰箱中，實驗桌上勿堆放書包、書籍、衣服外 套及雜物等。

4.實驗前詳閱實驗內容，瞭解實驗細節的原理及操作，注意上課所告知的 注意事項。實驗進行中有任何狀況或疑問，隨時發問，切勿私自變更實 驗程序。打翻任何藥品試劑及器皿時，請隨即清理。實驗後，適切記下 自己的結果，嚴禁抄襲，確實關閉不用之電源、水、酒精燈及瓦斯等。

5.實驗完畢，請清理實驗室、倒垃圾、滅菌、關閉燈光及冷氣，離開實驗 室前記得洗手。

【藥品】

1.使用任何藥品，請先看清楚標示、注意事項，翻閱物質安全資料表或 Merck Index，查明是否對人體造成傷害，使用完畢請放回原位。

2.新配製的試劑請清楚註明內容物、濃度、注意事項及配製日期，為避免 污染，勿將未用完的藥劑倒回容器內。

3.揮發性、腐蝕性、有毒溶劑（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、鹽酸、硫酸、

β-mercaptoethanol、formaldehyde、酚等）要在排煙櫃中戴手套量取配製，

取用完應隨即蓋好蓋子，若不小心打翻試劑，馬上處理。

4.有毒、致癌藥劑例如 acrylamide（神經毒）、ethidium bromide（突變劑）、

SDS（粉塵）請戴手套及口罩取用，並勿到處污染，脫下手套後，養成 洗手的好習慣。

5.接觸到病原材料或細菌，應迅速消毒。所有被污染的物品，在丟棄或重 覆使用前均需先滅菌，欲高壓滅菌之物品，應放在專用的收集桶內。固 體培養基或洋菜膠不得倒入水槽或下水道中。

6.使用刻度吸管取物時，切勿用嘴吸取，請用自動吸管唧筒或安全吸球。

【Pipet 使用】

微量吸管 (micropipet) 是進行生化實驗或分子生物學實驗的必備工 具，然而使用方法的正確與否，以及微量吸管的準確性，都直接影響了實 驗結果的正確性，故請對你持有之微量吸管作深入的認識。

A. 基本使用方法

1.選擇適當的 Pipetman：不同型號的微量吸管，各有其吸取體積範圍，請 依取用溶液體積取用適當的微量吸管。

2.設定體積：設定体積時，由低旋轉至高值，須先超越所欲設定值至少三 分之一轉後，再反轉至設定值；由高旋轉至低值，則直接轉 至設定值即可。請勿將体積調整圈轉到超過最低或最高的使 用範圍。

3 套上微量吸管頭，吸取溶液： 吸取溶液時，尖端請先套上微量吸管頭 (tip)，P1000 使用藍色微量吸管頭，P100 使用黃色微量吸管頭，P10 使用白色微量 吸管頭。將按鈕壓至第一段，儘可能保持 微量吸管垂直，將微量吸管頭尖端浸入溶 液，再緩慢釋放按鈕。釋放按鈕不可太 快，以免溶液衝入吸管柱內而腐蝕活塞。

4. 釋放溶液：將微量吸管頭與容器壁接觸，慢慢壓下按鈕至第一段，停一 兩秒再壓至第二段把溶液完全壓出。

A, 保持微量吸管垂直，將按鈕壓至第一段；B, 微量吸管頭尖端浸入溶液，緩慢釋放按 鈕；C,持微量吸管垂直，將微量吸管頭與容器壁接觸，慢慢壓下按鈕至第一段；D, 壓 至第二段把溶液完全釋放出；E, 釋放按鈕回原狀。

B.使用注意事項

1.勿將微量吸管本體浸入溶液中。

2.吸取黏度高之試液，請先將微量吸管頭尖端以刀片或剪刀將出口切大，

並先行預潤後再吸取。

3.微量吸管的任何部份切勿用火燒烤，亦不可吸取溫度高於 70℃ 的溶液，

避免蒸氣侵入腐蝕活塞。

4.將調整後體積的 Pipetman 使用過後，應調整回該 Pipetman 的最大容許 值，避免 Pipetman 內彈簧彈性疲乏。

C.實驗方法步驟

1.請取六支微量離心管，分別標上 A~F。

2.以正確使用方法，依下表所列體積吸取不同溶液至各管中。

單位 　　L A B C D E F

Solution 1 900 495 999 90 99 5

Solution 2 100 5 1 10 1 5

總體積 1000 500 1000 100 100 10

3.將管蓋蓋好，置入微量離心機，離心數秒使溶液混合並集中於管底。

4.將適當微量吸管之體積調整圈調至總體積處，以乾淨的微量吸管頭吸取 管中的溶液，並檢查：

(i) 微量吸管頭尖端是否剛好充滿溶液或留有一些空間？

(ii) 離心管中是否有溶液殘留？

【分光光度計使用】

A.吸光度測定流程

1.打開右側方之電源開關。

2.點選桌面上之 Spectra manager 開啟程式。

3.進入畫面之 Environment，點選 Hardware setting 將 Deuterium 取消(如果 使用波長大於 340nm)。

4.隨之點選畫面之 Fixed wavelength measurement 進入定波長測定。

5.在點選 measurement 之 parameters，將 wavelength 該為欲測之波長，之後 按 OK 即可。

6.將空白樣品放入待測槽中，按下 Autozero 歸零即可偵測待測物之吸收值 大小。

B.使用注意事項

1.測定 UV 範圍(<340nm )請用石英測光管。

2.測定之吸光值若超過 0.8，請將溶液稀釋後再測。

3.光度計上請勿放置任何物品，尤其是溶液。亦請勿在光度計上操作實驗。

4.放入測光管前，請將測光管外壁擦拭乾淨，不可有任何液體殘留。

5.使用後測光管必須立即以蒸餾水沖洗乾淨，拭乾後置回原位。

6.使用完畢務必關掉燈泡及電源開關。

C.測定溶液之吸光值

1.秤取 1mg 之牛血清蛋白 BSA 溶於 10mL 蒸餾水，當作 BSA 標準液。

2.將 BSA 標準液以蒸餾水稀釋成不同濃度(0.05、0.01、0.005、0.001、

0.0005、0.0001 mg/mL)

3.再將分光光度計定波長設為 OD₂₈₀。

4.將上依步驟混合之液體靜置，即放入分光光度計進行偵測不同蛋白質濃 度之吸光值。

5.紀錄不同濃度所得之吸光值，並以濃度與吸光值作圖，建立 BSA 檢量線，

觀測其線性迴歸 R²~0.999，即可得知操作者 pipet 使用是否正確及分光 光度計之使用。

【培養皿製作、劃菌及勾菌】

A.培養基之配製

LB agar plate : 1% (w/v) Bacto tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 1% NaCl，

以 5 N NaOH 調至 pH 7.0 後，加入 1.5% (w/v) Bacto agar 1.培養基配置如上所示，配製完後以濕式滅菌法滅菌約 30 分鐘。

2.待冷卻至 50℃左右於無菌操作台內加入所需抗生素，同時攪拌均勻，並 依次倒入培養皿中即可。

B.劃菌

1.取一個加有 Kanamycin 之 LB plate (LB+Kan)，在培養皿底部標明組別及 日期，並寫上菌株名稱。

2.將生長有菌株之培養皿蓋子拿起，以滅菌牙籤輕輕碰觸刮下菌落，並將 培養皿蓋子置回。

3.打開空白的 LB+A plate，將沾有菌落的滅菌牙籤於其上輕輕連畫數條橫 線 (Streak 1) 後，將培養皿蓋子置回。

4.將培養皿旋轉約 60 度，畫第二次線 ( Streak 2)。

5.重複上一步驟之操作，畫第三次線 (Streak 3)。

6.將培養皿倒置，於 37℃ 培養箱中培養過夜。

C.勾菌培養

LB 培養液：1% (w/v) Bacto tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 1% NaCl，

以 5 N NaOH 調至 pH7.0 後，以溼熱法滅菌。

1.取一支 15 mL 試管，並以 pipet 吸取 3 mL LB 培養液於試管中，請寫上 菌株、標明組別及日期。

2.打開試管蓋 (一手握住試管，並以拿著竹籤那隻手的小指旋開蓋子)，將 管口在酒精燈上過火。將沾有菌落的竹籤伸入培養液中並輕敲管壁使菌 落脫離。將管口再次在酒精燈上過火後，將蓋子置回。

3.將試管置於 37℃ 培養箱或水浴中震盪培養過夜。

Streak 1 Streak 2 Streak 3

※與細菌接觸過的任何容器或培養基，使用後須經過滅菌才可丟棄。

【菌株生長曲線之測定(diauxic growth)】

When exposed to glucose + lactose, E. coli does not consume lactose until glucose is exhausted, resulting in two exponential growth phases separated by a lag. This is called the diauxie or “double growth.” Diauxie occurs because synthesis of lactose permease and β-galactosidase is somehow abolished in the presence of glucose.

1.取兩個 250 mL 之滅菌過三角錐瓶，利用吸量管吸取 30ml 滅菌後之 LB 培養基於此兩三角錐瓶，其中一個加入滅菌過之 glucose 溶液(0.5%)，另 一個加入等濃度之 glucose(0.5%)和 lactose(1%)，請標明組別。

2.取昨天接種並經過夜培養的菌液 1 mL，加入三角錐瓶中，混合均勻後，

吸出 1 mL 於微量離心管中，置於冰浴中。 三角錐瓶則置於 37℃ 震 盪培養。

3.其後每隔約 60 min 吸出 1 mL 菌液，直至菌株生長持平，吸出之菌液 皆暫置於冰浴中。

4.所有取樣之樣品，皆利用分光光度計測不同時間吸出菌液之 OD₆₀₀，請以 LB 培養液作為 Blank。

5.最後將菌液以高速離心方式進行分離。

6.以時間為 X-軸，OD₆₀₀作圖，比較此兩瓶生長曲線之不同。

【革蘭氏染色法】

A.原理

鑑別染色需用經熱固定之抹片，且連續使用三種化學藥劑。最初試劑是 所謂初染劑，其目的使細菌著色。為形成顏色對比，第二試劑為脫色劑。

依細胞化學組成之不同，脫色劑可完全除去初染或僅除去部份細胞構造 之顏色。最後試劑是謂複染劑，與初染呈對比顏色。脫色時若初染未洗 去，則複染不能吸收，細胞與其組成將保留初染顏色。若初染脫色，則 細胞組成即吸收複染之對比顏色。因此細胞之形成或其構造，可依保留 之染色劑而鑑別之。用於細菌學上最重要之鑑別染色法是謂革蘭氏染 色。此法乃微生物分類與鑑別之主要工具，可將細菌區分為兩大組，即 革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌。本法使用四種不同試劑，茲將其作用機 轉分別簡述如下：

初染劑：初染劑乃結晶紫(crystal violet)，係步驟中最先使用之試劑，使細 菌染成紫藍色。

媒染劑：乃革蘭氏碘液(Iodine)，可與初染劑結合而形成不溶性複合物。所 形成之結晶紫碘（CV-I）複合體藉以加強染料顏色，此時所有細 菌均成紫黑色。

脫色劑：乃 95%乙醇，此試劑具有脂溶性與蛋白質脫水劑之雙重功能。其 作用依微生物細胞壁所含脂肪濃度而定。格蘭氏陽性菌之脂質含 量低乃保留 CV-I 複合體之主要因素因少量之脂質經乙醇作用，

立刻溶解，形成細胞壁之細孔，但此細孔隨即因乙醇之脫水作用 而封閉，以致緊密結合之初染劑不易移去，終於保留紫色。革蘭 氏陰性菌細胞壁中之外層含高量之脂質，易為乙醇溶解，形成大 孔。即使引起細胞壁蛋白之脫水也不易封閉該孔，因此有利於 CV-I 複合體之釋出，致使菌體成無色。

複染劑：最後試劑為番紅(safranin o)，凡經上述脫色之細菌，被此染料染 成紅色。因僅革蘭氏陰性菌發生脫色，故於此步驟能吸收複染 劑。革蘭氏陽性菌則保留初染時之紫色。

B.實驗步驟 1.拭淨玻片。

2.以無菌操作，分別將 Escherichia coli 及 Streptococcus thermophilus 及混合 菌株置於抹片上，於空氣中乾燥，熱固定後備用。

3.將塗抹覆蓋結晶紫，並靜置一分鐘。

4.以蒸餾水輕輕的洗。

5.碘液沖掉多餘的水分然後以碘液覆蓋載玻片放置 60 秒。

6.自來水沖洗。

7.酒精進行脫色至脫色液無色。

8.自來水洗掉多餘的酒精。

9.再以番紅複染 45 秒。

10.以吸水紙吸乾，並用油鏡觀察。

C.注意事項

※染色時，脫色步驟可影響抹片之製備成敗與否。切記脫色過度時可使初 染流失，使革蘭氏陽性菌成革蘭氏陰性菌。但脫色不足，則不能完全除 去 CV-I 複合物，結果是革蘭氏陰性菌成革蘭氏陽性菌；

※將玻片以蒸餾水充分輕洗，以除去剩餘之染液；

※宜使用未超過 24 小時之新鮮培養，置備抹片。因菌齡老化，尤以革蘭 氏陽性菌易失去保留初染之能力，而顯示出錯誤的結果。且部份菌體染 呈紫色，部份呈紅色。

【質體 DNA 萃取及洋菜膠體電泳】

質體 DNA 是一種獨立於染色體 DNA 之外的環狀 DNA 小分子，通常 只有數千個鹼基對（kb），它具有自行複製的能力。在生物技術的應用上，

質體 DNA 常被用以選殖特定的 DNA，以及表現特定的蛋白質之用。目前 應用於質體 DNA 的純化或抽取的方法眾多，例如鹼溶裂法（alkaline lysis）、沸騰法（boiling method）、氯化銫（CsCl）純化法，及市售之管 柱層析套組等。最常用的鹼溶裂法效率高、價廉、簡單易學為其優點，對 分子生物初學者而言，此法為必學的基礎技術。其原理乃利用鹼性處理質 體 DNA 及染色體 DNA，使兩者雙股打開呈單股狀態，再加入酸中和，使 單股回復為雙股 DNA，同時在急速中和反應中，染色體 DNA 因分子過於 龐大以致於鹼基匆忙配對，形成一雜亂無序的巨大分子，對水的相對溶解 度低而易被沈澱下來。相反的，質體 DNA 因分子小，兩單股 DNA 恢復原 鹼基配對快而易溶於水中，故只要經過離心，即可將染色體 DNA 與質體 DNA 分離。在實驗步驟中，加入 Solution I 的目的主要是將細菌團塊重新 懸浮於緩衝溶液中，Solution II 含有 SDS 及 NaOH，前者可將細菌溶解，

後者可將 DNA 變性，Solution III 是由醋酸及鉀鹽所形成，前者在於中和 鹼性，後者則與 DNA 形成錯合物而有利於 DNA 的沈澱。待加入 Solution III 後離心，大部分的蛋白質與染色體 DNA 會留在下面的有機層，而上面 的水層所含的質體 DNA 可用酒精沈澱之，（亦有實驗室用酚/氯仿/異戊醇 [PCI]萃取以去除殘留的蛋白質），再以 70％酒精洗滌以去除鹽類。

小量製備 (mini-prep) 是從轉形過的大腸桿菌寄主中分離質體 DNA 之快速方法，比用 CsCl 密度梯度超高速離心的標準大量製備 (large-prep) 簡單多了。小量製備出的 DNA 可應用於分子選殖 (molecular cloning) 實 驗，例如進行限制酶切割及電泳分析等。除了 alkaline 及 boiling methods，

重組 DNA 技術日益進步，新的方法層出不窮，現已有分子生物廠商發展 利用管柱層析法 (column chromatography) 進行小量質體 DNA 的製備，更 較傳統方法省時，但價格較為昂貴。本實驗將利用鹼溶裂法進行質體 DNA 萃取。

A.質體 DNA 萃取試劑藥品(鹼溶裂法)

細胞懸浮溶液 TE buffer：25mM Tris-HCl, 10mM EDTA, pH8.0 細胞分解溶液 Lysis buffer：0.2N NaOH, 1% SDS

中和緩衝溶液 Neutralization buffer： 5M potassium acetate B.鹼溶裂法方法步驟

1.將含有質體 pET30b(+)之菌株勾取置 3mL 的特定培養基(LB+Kan)中，於 37℃、170rpm 震盪培養約 16 小時。

2.高速離心收取細胞(6000rpm ,1min)

3.加入 200　L TE buffer 將細胞完全懸浮。

4.加入 200　L Lysis buffer，然後輕輕翻轉 10 次。

5.加入 250　L Neutralization buffer，然後輕輕翻轉 10 次。

6.高速離心(12000rpm,5~10min)，取上清液於新的微量離心管。

7.加入 500　L 異丙醇 IPA 將質体 DNA 沉澱，高速離(12000rpm,5~10min)，

移除上清液。

8.加入 500　L 70% 酒精輕洗質体 DNA 沉澱，高速離心(12000rpm, 5~10min)，移除上清液。

9.將質體 DNA 靜置烘乾，加入 20　L TE buffer，則可獲得純化後之質体 DNA。

把 agarose 熱溶再冷凝，洋菜膠會以氫鍵形成凝膠。而經限制酶切過的 DNA 片段，在電場影響下會在 agarose gel 中移動，帶負電荷的 DNA 分子會向 正極方向移動。移動速度依分子大小而定，分子愈大移動性愈慢。而凝膠 中 agarose 的濃度決定了空隙的大小，特定大小的 DNA 片段在不同濃度的 膠中移動速率均不同，故每次均需 DNA marker 以資比較。核酸在膠體中 可經 Syber Green 染色，Syber Green 會嵌入核酸鹼基中，以紫外線照射，

則核酸吸收紫外線波長的光線，再經 EtBr 放出可見波長的光線，藉以觀察 核酸的位置。

C.電泳試劑藥品

洋菜膠 (agarose, low EEO) 1×TAE 電泳緩衝液

10× 追蹤染劑：0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 0.1 M EDTA, 50% glycerol。

SYBR green stock solution (100X)

DNA 標準分子量 DNA/HindIII fragments：包含 8 個片段 23.1, 9.4, 6.5, 4.3, 2.3, 2.0, 0.56, 0.125 kb，濃度為 0.5 g/　 　 ，以下簡稱 L λMr。

D.電泳方法步驟

1.製備一片 8-well 1.2% agarose gel：秤取適量 agarose 粉末約 0.3g，加入 1×TAE 25 mL，以微波爐加熱溶解後，注入鑄膠器中。

2.取不同大小之 DNA 分別加入 2　l SYBR Green 及 2　l loading dye，靜置 於暗處約 30 分鐘，在依序注入 well 中進行電泳。

3.以 100V 進行電泳，待追蹤染劑 bromophenol blue 行進至膠體三分之二 處時，關閉電源，取出膠片，以 UV transilluminator box 觀察色帶位置，

並記錄結果。

4.與標準分子量比較，估計各 DNA 片段之分子量。

【蛋白質電泳】

A.原理

電泳的高解析力使其成為生化技術中最有效力的一門分析利器，以下簡略 說明各種電泳的形式及其應用。

1.不連續膠體電泳(disc-PAGE) 是以原態蛋白質進行電泳，一般用作純度檢 定或活性分析，SDS-膠體電泳(SDS-PAGE)則用為次體分子量之測定，

梯度(gradient) 電泳則可輔助原態蛋白質分子量之決定。 結合 SDS 及梯 度兩種特性的 SDS-梯度膠體電泳，其解析力最高。

2.電泳形式早期使用圓柱狀膠體，演變成直立式的平板膠片 (16 × 18 cm)，最後改成迷你電泳膠片 (8 × 10 cm)，電泳時間只約一小時，而其 解析力不變。現在柱狀膠體電泳只用在等電焦集法，以進行二次元電 泳；而大型平板電泳則多用在製備式電泳，一般電泳大多以迷你膠片進 行之。

3.膠體材質的種類很多，但用在蛋白質者則以 聚丙烯醯胺(polyacrylamide) 為主；聚丙烯醯胺電泳是蛋白質應用最廣的電泳分析方式。也有少數使 用洋菜膠體 (agarose gel)，多用在測定 pI 較廣的異構脢酵素群。

4.泳動率：在 pH 8.8 的電泳條件下，大部分 pI 小於 8.8 的分子均能往 正極泳動；蛋白質的泳動率與所帶電荷成正比，而與其分子量成反比；

若分子量一樣，但形狀越不規則，或體積越鬆散者，泳動率越小。

B.儀器用具及藥品 1.迷你電泳槽 2,鑄膠器

3.鑄膠三明治組合：玻璃板 (8x10 cm)、白色氧化鋁板、Spacer 間隔條(0.75 mm) 、Comb 樣本齒模(0.75 mm)

4.供電器 5.塑膠染色盒 6.旋轉搖盪器

7.試劑組：30% acrylanide mix 、1.5M Tris(pH8.0)、10% Ammonium persulfate、10% SDS 及 TEMED

C.方法步驟

1.依表混合下列試劑，製作不同濃度之 SDS-PAGE。

2.將配製好之容易注入至蛋白質製膠槽中，並以 Isopropanol 壓平其線，插 入樣本齒模避免產生氣泡靜置約 20 分鐘。

3.將製膠槽中之 Isopropanol 傾斜倒出，再依序混合表之成分注入製膠槽 中，插入樣本齒模以形成樣品槽。

4.將欲分析之樣品加入 3X loading dye 置於 95℃恆溫器中，加熱 10 分鐘；

蛋白質標準液則只需加熱 5 分鐘。

5.待加熱後之樣品冷卻後，再依序注入 SDS-PAGE 之樣品槽中，並以 110V 進行電泳分析，待藍色染料色帶跑至膠片底部後即可關閉電源。

6.取出膠片組合，使玻璃板向上，先除去兩側間隔條，再以間隔條輕輕撬 起玻璃，膠片則留在白板上。切除焦集膠體，並在分離膠片的右上方截 角做記號 (區別膠片的左右)。

7.將完成之電泳片置於 Staining buffer 中染色約 5 min，染色盤要加密蓋，

置於旋轉平台慢速 50 rpm 搖盪之；要注意膠片是否完全沒入染色液 中，否則會造成染色不均勻。

8.染色後小心把 CBR 染劑倒回原來瓶中，整塊膠片變成藍色，先用自來 水洗掉殘餘的染色液，再倒入約 20 mL Destaining buffer，加密蓋後再放 回旋轉平台搖盪。染色脫色過程請戴手套，否則會在膠片上留下指紋，

而後再以照相系統存取結果即可。

【離子交換層析分離】

A.原理

離子交換層析法 （ion exchange chromatography，簡稱 IEC）是從複雜 的混合物中，分離性質相似大分子的方法之一，依據的原理是物質的酸鹼 性、極性，也就是所帶陰陽離子的不同。電荷不同的物質，對管柱上的離 子交換劑有不同的親和力，改變沖洗液的離子強度和 pH 值，物質就能依 次從層析柱中分離出來。

離子交換層析法大致分為 5 個步驟：

1.離子擴散到樹脂表面。

2.離子通過樹脂擴散到交換位置。

3.在交換位置進行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹脂的 結合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代。

4.被交換的離子擴散到樹脂表面。

5.沖洗液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中。

離子交換樹脂的交換反應是可逆的，遵循化學平衡的規律，定量的混 合物通過管柱時，離子不斷被交換，濃度逐漸降低，幾乎全部都能被吸附 在樹脂上；在沖洗的過程中，由於連續添加新的交換溶液，所以會朝正反 應方向移動，因而可以把樹脂上的離子沖洗下來。

如果被純化的物質是氨基酸類的分子，則分子上的淨電荷取決於氨基 酸的等電點和溶液的 pH 值，所以當溶液的 pH 值較低，氨基酸分子帶正 電荷，它將結合到強酸性的陽離子交換樹脂上；隨著通過的緩衝液 pH 逐 漸增加，氨基酸將逐漸失去正電荷，結合力減弱，最後被洗下來。由於不 同的氨基酸等電點不同，這些氨基酸將依次被洗出，最先被洗出的是酸性 氨基酸，如 apartic acid 和 glutamic acid（在約 pH3~4 時），隨後是中性氨 基酸，如 glycine 和 alanine。鹼性氨基酸如 arginine 和 lysine 在 pH 值很高 的緩衝液中仍帶有正電荷，因此這些在約 pH 值高達 10~11 時才出現。

B.藥品試劑

1. Buffer A ：50 mM Na₂HPO₄, pH 7.0

2. Buffer B ：50 mM Na₂HPO₄, pH 7.0, 0.5 M NaCl 3. DEAE-cellulose

C.方法步驟

1.震盪 DEAE cellulose 膠體使之懸浮，小心倒入管柱中，讓膠體慢慢沈

降，在沈降過程中隨時加入 buffer A，勿使膠體乾掉。

2.待膠體沈降完全後，高度應在 0.5 cm 左右。膠柱以 buffer A 一直流洗，

流速快慢可以不考慮。

3.樣本的添加方法同上述膠體過濾法，當樣本全部沒入膠體後，收集流出 液並以 buffer A 流洗 10 mL 後，去除膠體上方的緩衝液，但勿使膠體 乾掉。

4.然後依序以 bufferB 溶離之，流洗約 1 mL。

5.收集衝提液，以進行 SDS-PAGE 電泳分析。

【金屬層析分離】

A.原理

若表現蛋白質上含有一段六個 His 的片段，而親和吸著劑膠體上接有鎳離 子，此蛋白質會專一性地結合到吸著膠體；洗去雜質後可用 imidazole 溶 離純質蛋白質

B.藥品配製

1.金屬螯合親和層析膠體

2. Buffer A：50 mM Na₂HPO₄, pH 8.0; 0.3 M NaCl; 20 mM imidazole 3. Buffer B：50 mM Na₂HPO₄, pH 8.0; 0.3 M NaCl; 250 mM imidazole C.方法步驟

1.親和層析膠體 0.5 mL 已經裝填在管柱內，成為一淡藍色膠柱。請把管 柱架直在鐵架上，去除下方的填塞物，用 buffer A 流洗 20 mL 後塞住 出口，準備注入樣本。

2.除去膠面上方的緩衝液，並取出樣本慢慢用滴管加到親和膠體上，小心 勿弄亂膠體表面；讓樣本沒入膠體中。

＊收集流出液

3.待樣本全部進入膠體後，關閉出口，再慢慢加入 buffer A，打開出口收 集流出液；buffer A 共流洗 10 mL。

4.接著以 buffer B 流洗 1ml。

5.收集衝提液，以進行 SDS-PAGE 電泳分析。

【酵素活性測定分析】

1.取純化後之酵素及粗菌液至於冰水浴中待用。

2.分別依序加入

Reagent Stock Final Volume

H20 675µL

Potassium phosphate buffer, pH8.0

1M 0.1M 100µL D-alanine 0.3M 0.03M 100µL o-phenylenediamine/o-dianisidine 0.3% 0.03% 100µL

Horseraddish peroxidase 0.25U/　L 5U 20µL Enzyme(DAOase) 5µL 3.將分光光度計開啟，並點選 Time course measurement，在選擇

Measurement 之 parameters 將參數依下列更改 Photometric mode=abs；

Response=quick；wavelength=453nm；End time=120sec；

Data Pitch=0.2sec；Display=auto。

4.利用分光光度計之動力學參數來偵測 OD₄₅₃之隨時間變化。

5.分別分析粗菌液、離子交換純化液及金屬層析純化液之間之活性差異。