臺 北 市 第 4 2 屆 中 小 學 科 學 展 覽 會
作 品 說 明 書 封 面
科 別：生物科
組 別：高中
作品名稱：挑食的稻子──有機氮源影響其表現
關 鍵 詞：有機氮源、植物表現
編 號：
摘要
許多的研究發現，植物根部有「胺基酸運輸蛋白」，擁有主動運輸「有機」營養的能力。 在短時間之內，關於此一運輸蛋白的研究，如雨後春筍般的出現，但不外乎是關於此蛋白結 構的研究，或是其對應基因的位置，而在胺基酸進入植物體後，對植物體本身的影響的研究， 卻是少之又少。我們在種植水稻時，常會加入無機“氮”肥，增加蛋白質的合成，這些鹽類 在植物體中，是運用麩胺酸、麩醯胺酸的一連串”耗能”的代謝，將氮留在體內。既然植物 擁有主動運輸有機養分的能力，若直接予以麩胺酸此一重要胺基酸，植物會不會長得比較好？ 答案是否！因為當麩胺酸進入水稻體內時，會對蛋白質代謝產生影響，一個環節的脫落，使 的部分胺基酸難以代謝產生，並造成地下部逐漸縮短，而過短的地下部又將會對水稻個體造 成諸多不良的影響。 本實驗利用常見的無機氮肥(NO3- NH4+)和有機氮肥(麩胺酸)配置水耕培養基，分別在溫室 中種植 14 後，觀察並討論其生長情形，並藉由檢測其葉綠素 a 含量及參與轉銨作用的酵素活 性，探討適不適合以麩胺酸取代現在常用的無機氮肥，若當我們只予以麩胺酸為水稻植株的 唯一氮源時，會對其胺基酸或蛋白質的代謝，產生哪些層面的影響。壹 研究動機
在高中生物二年級上學期第二章(植物的營養)的教材中，曾介紹過植物根部的構造，但是 僅闡述如何藉由根部，從環境中獲取「無機」的養分。近年的國外研究發現，植物根部亦有 「胺基酸運輸蛋白」，可主動運輸「有機」營養。而我們在種植水稻時，常會加入“氮”肥， 增加蛋白質的合成，使品質更好，但這肥料不外乎是銨鹽(NH4+)或硝酸鹽類(NO3-)。在植物體 中，是運用麩胺酸、麩醯胺酸的一連串代謝，將氮留在體內。如果我們加入的不是平常的氮 肥，而是麩胺酸(選用此種胺基酸原因如圖(一))，植物會不會長得更好？ ←(圖一)麩胺酸相關代謝 麩胺酸為植物使用氮源一重要胺基酸，可 讓銨基併入此胺基酸，或以此進行胺基酸 的代謝。所以是此次實驗選用的有機氮肥。貳 研究目的
本實驗利用常見無機氮肥(NO3- NH4+)和有機氮肥(麩胺酸)配置水耕培養基，分別在溫室中 種植 14 天後，觀察並討論其生長情形，檢測其葉綠素 a 含量，並將不同的處理的水稻植株分 為地上及地下部，檢測參與轉銨作用的酵素活性。藉由以上的檢測，我們欲探討的問題如下： (一). 適不適合以麩胺酸取代現在常用的無機氮肥？ (二). 若只予以麩胺酸為水稻植株的氮源，會對其胺基酸或蛋白質的代謝，產生何種影響？參 研究設備及器材
一、 儀器 (一.) 分光光度計 (二.) 恆溫水浴場 (三.) 冷凍離心機 (四.) 溫室 (五.) 冰箱(4℃ and -80℃) (六.) 冷凍乾燥機 (七.) 電子秤 (八.) 二、 藥品 (一.) KH2PO4 (二.) KNO3 (三.) 酒精(70%) (四.) NADH (五.) Zn(CH3COO)2 (六.) Sulfanilamide (七.) N-1-naphthylethy (八.) 礦物油 (九.) NaNO2 (一〇.) Methyl viologen (一一.) Na2S2O4 (一二.) 麩胺酸 (一三.) 胱胺酸 (一四.) 丙酮 90% (一五.) Bsa (一六.) 染色試劑 (一七.) KCl (一八.) (NH4)2SO4 (一九.) MnCl2˙4H2O (二〇.) (NH4)6Mo7O24˙4H2O (二一.) H3BO3 (二二.) (ZnSO4)˙7H2O (二三.) (CuSO4)˙5H2O (二四.) FeCl3˙6H2O (二五.) NaH2PO4 (二六.) K2SO4 (二七.) CaCl2 三、 其它 (一.) 液態氮 (二.) 研缽及杵 (三.) 離心管數支 (四.) 水稻(台農 67 號) (五.) 水耕瓶 (六.) 光電管(1 cm 光徑) (七.) 滅菌水 (八.) Whatman #1 濾紙 (九.) 試管數支 ←(圖二)轉銨作用 在植物獲得硝酸鹽類時，必會經由此二種酵 素，將其轉換為銨鹽，最後以銨的方式併入 麩胺酸，而這同時是只添加麩胺酸時，缺少 的一個步驟，所以特別檢驗其酵素的活性。肆 研究過程和方法
一、 研究過程： → ( 圖三 ) 研究 流 程二、 實驗方法 (一.) 培養液 以 1N NaOH 將 pH 值調整至 5) 無機鹽類 化合物 最終濃度 Mn MnCl2˙4H2O 9.48 μm Mo (NH4)6Mo7O24˙4H2O 0.07 μm B H3BO3 18.88 μm Zn (ZnSO4)˙7H2O 0.15 μm Cu (CuSO4)˙5H2O 0.16 μm Fe FeCl3˙6H2O 35.61 μm P NaH2PO4 0.32 mM K K2SO4 0.51 mM Ca CaCl2 1.00 mM Mg MgSO4˙7H2O 1.64 mM (二). 葉綠素 a 含量測定 1. 將葉片 0.2 g 冷凍磨碎放入離心管，並加 5 mL 90﹪丙酮溶液混合。 2. 將離心管置於 4℃及黑暗下靜置 5 分鐘。 3. 將離心管放入離心機以 1000 g 離心 15 分鐘。 4. 離心後之上清液移入乾淨之離心管中。 5. 將步驟 4 萃取液放入 1 cm 光徑之樣品槽中，分別讀取其在波長 750、664、 647 及 630 nm 之吸光值並記錄。 6. 90﹪丙酮溶液其吸光為空白分析值，樣本吸光值須扣除空白分析值。 7. 取另一 0.2 g 重複以上步驟，重複數次，得其平均。 8. 濃度換算 (Ca)(mg/L)= 11.85*(Abs664－Abs750－Abs0) －1.54*(Abs647－Abs750－Abs0) －0.08*(Abs 630－Abs750－Abs0) 9. 用濃度回推其葉綠素 a 的含量。 (三). NO3-呈色劑 1. 配置含 1 g sulfanilamide 與 12 mL 37% HCl 的水溶液 100 mL。 2. 將 0.02 g N-1-naphthylethy 溶於 50 mL 的水中，再加水至 100 mL。 3. 使用時，取待測液 1 mL，在依次加入 1.2.的溶液各 1 mL，在分光光度計下， 取在 540 nm 時的吸光值。 (四). 萃取液與酵素萃取 1. 配置含有 5 mM 胱胺酸且濃度為 10 mM KH2PO4 buffer(pH 7.5)。 2. 取欲測水稻的葉(根)0.5 g，加入液態氮使用冷凍磨碎法，加入 5 mL 的 KH2PO4 及胱胺酸水溶液，倒入乾淨離心管。 3. 放入冷凍離心機，使其恆溫在 4℃、15000 g 底下，離心 20 分鐘。 4. 離心後，其上清液，即為酵素溶液。 (五). 硝酸還原酶
1. 配置 2mL 的混合液，使其含有 105μmol KH2PO4 buffer(pH 7.5)、20μmol
KNO3、0.68μmol NADH 以及 0.2 mL 酵素液。
2. 放入恆溫於 30℃之水浴場，反應 20 分鐘。
3. 加入 0.1 mL 1 M 醋酸鋅溶液以及 1.9 mL 70%酒精溶液，以中止反應。
4. 用步驟(三)之呈色方法，記錄其值。此 4 步驟重複數次，得其平均。
(六). 亞硝酸還原酶
1. 配置 2 mL 的混合液，使其含有 75μmol KH2PO4 buffer(pH 7.5)、1.5μmol
NaNO3、0.6μmol Methyl viologen、7.5μmol Na2S2O4以及 0.2 mL 酵素液。
(Na2S2O4最後加入，並開始計時 20 分鐘) 2. 加入礦物油在混合液之上。(不宜過多，約 2 mm 即可) 3. 20 分鐘時，搖晃試管 2~3 秒，直到藍色消退，反應結束。 4. 取出約 0.1 mL 用水稀釋至 1 mL，用步驟(三)之呈色方法，記錄其值。此 4 步驟重複數次，得其平均。 (七). 蛋白質含量測定 1. 將染色試劑以四倍重的水稀釋，溶解後再以 Whatman#1 過濾。 2. 將 0.1 mL 的待測物與 5 mL 呈色劑混合，在室溫下 5 分鐘。 3. 在分光光度計下，取在 595 nm 時的吸光值，並計算出含量。
伍 研究結果
在(圖四)水稻 14 天培養照片中，無氮處理的植株，地上部對地下部的比值較低，在無機 氮肥的處理中，地下部的生長情形較不會隨著濃度的變化而有明顯的改變，但是在麩胺 酸的處理之中，地下部卻隨著麩胺酸濃度的增加而漸短，且在 10.0 mM 處理的地下部長 度，約為 1.0 mM 或缺氮處理的地下部長度的 1/5。 ↑(圖四) 水稻 14 天培養照片 水稻在不同處理第 14 天時照片，處理方式及濃度如圖所標示。在麩胺酸處理的水稻植株中， 地下部隨著麩胺酸濃度的遞增，而有顯著遞減的現象。(照片中每 36 株/格) 無氮 無氮 無氮 無氮 0.1 0.5 1.0 2.5 5.0 10.0 0.1 0.5 1.0 2.5 5.0 10.0 0.5 1.0 2.5 5.0 10.0 0.5 1.0 2.5 5.0 10.0 mM 麩胺酸 NH4+ (NH4)2SO4 NO3 -(KNO3) KCl mM mM mM在(表二)中葉綠素 a 含量濃度隨硝酸鹽濃度上升而上升，最高約為最低的 5 倍，而銨鹽在 較低濃度即有顯著的影響，而麩胺酸處理的植株偏低。 在硝酸鹽以及銨鹽的處理中，硝酸還原酶活性皆是地上部反應多於地下部如(表三)，而麩 胺酸處理，則是在地下部中有明顯的變化，且約與濃度成正相關。 μg 葉綠素 a/ g 樣本 ↑(表二)葉綠素濃度 a 不同處理 14 天水稻植株，由其在 750、664、647 及 630 nm 之吸光 值，推算其每公克地上部樣本所含多少微克葉綠素 a ↑(表三)硝酸還原酶活性 不同處理 14 天水稻植株，其每 0.2 mL 萃取液中硝酸還源沒，每 小時還原 NO3-之毫莫耳數(由於每一個 NO3-被還原時，即產生一個 NO2-所以檢測其產生量)
而在麩胺酸處理的植株中，其亞硝酸還原酶的反應，在地上部中約如在地下部中的表現， 都無太大的差別如(表四)，硝酸鹽處理的活性，地下部與對照組差距不大，而在銨鹽處理 中，則有地下部高於地上部的情形。 在無機氮肥的處理中，不論是其地上或地下部，都具有較高的蛋白質含量，而在麩胺酸 處理的植株中，地上部處於在有氮肥與無氮肥之間，而在地下部，有先升後降的趨勢。 mg 蛋白質/ g 植株 ↓地上部 ↓地下部 ↑(表五、六) 蛋白質含量測定 蛋白質含量 取培養 14 天之水稻植株地上及地下部酵素萃取液，加入稀釋後之染 色試劑，推得每公克水稻植株樣本，含有多少毫克蛋白質。 ↑(表四) 亞硝酸還原酶活性不同處理 14 天水稻植株，其每 0.2 mL 萃取液中硝酸還源沒， 每時還原 NO2-之毫莫耳數(由於每一個 NO2-被還原時，即產生一個 NH4+所以檢測其產生量)
硝酸還原酶在麩胺酸處理的植株地下部中，有著較高的比例如(表七)，且濃度在 10.0 mM 時的比例，約是其在 0.1 或 0.5 mM 中的 1.5~2 倍，但是在亞硝酸還原酶所占的比例如(表 八)，其值與在硝酸鹽處理的比例大致相同。 ↑(表七) 硝酸還原酶活性/總蛋白質含量 為每毫克蛋白質中，所含此酵素的活性。可表示該酵素在不同處理中，所佔的比例。 ↑(表八) 亞硝酸還原酶活性/總蛋白質含量 為每毫克蛋白質中，所含此酵素的活性。可表示該酵素在不同處理中，所佔的比例。
伍 討論
一、 當水稻在缺乏氮源時，會較著重於地下部的發展，試圖獲得較多的營養，而在水稻 可從環境中獲得充足氮源時，地下部的生長情形變化差異較小，而著重於地上部的發展。 但是在麩胺酸處理的植株中，地下部卻漸縮，以下討論根部過短可能造成的問題： (一). 水稻植株會較容易倒伏，若在一般的農田之中，便會在水田之中壞死 (二). 很容易被連根拔起，較無法抵抗強風和大雨的沖刷 (三). 無法獲得較深層土壤的養分，缺乏生長優勢 二、 葉綠素 a 為植物光合作用重要的色素，實驗中，也常以葉綠素 a 濃度來比較植株光 合作用和生長的情形。在(圖四)中，此二處理植株之地上部一如葉綠素 a 含量的情形如(表 二)，是十分翠綠。缺氮或 KCl(對照)處理的植株，地上部稍黃，葉綠素 a 濃度低亦低。 雖然麩胺酸處理的地上部在(圖四)中看起來表現得一如無機氮肥的植株般良好，但在觀察 其葉綠素 a 含量時，會發現其生長及光合作用，是遠不如施以無機氮肥的水稻。 三、 而在亞硝酸還原酶活性測定中如(表四)，對照組 KCl 處理，地下部值高，所以推測 環境中硝酸的有無對其地下部亞硝酸還原酶的活性影響不大，而在麩胺酸處理的植株 中，其亞硝酸還原酶的反應，如同其在地上部中如硝酸還原酶在地上部中的表現，並無 太大的差別，可是在地下部中，硝酸還原酶卻有漸增的趨勢，而同時在亞硝酸還原酶的 活性中卻無如此的變化，麩胺酸應有能力影響前者而非後者。 四、 硝酸還原酶活性/總蛋白質含量(表七)和亞硝酸還原酶活性/總蛋白質含量(表八)中， 亦支持討論三的想法。此二表表是一酵素在該部分中所佔的比例，在(表七)中，發現硝酸 還原酶在麩胺酸處理的植株地下部中，有著較高的比例，但是在亞硝酸還原酶所占的比 例，其值與在硝酸鹽處理的比例大致相同。在(表八)中，KCl 地下部處理中特別偏高，應 該是因為其蛋白質量(分母)較小所產生的結果。 五、 綜合上述四點的討論，在水稻植株可從環境中獲得麩胺酸時，其地下部中，硝酸被 還得量會隨麩胺酸濃度升高而漸增，推測是麩胺酸進入根部時回饋刺激硝酸還原酶造 成，以期增加體內的銨，並藉此或是與麩醯胺酸相關的反應，刺激體內麩胺酸代謝為其 他胺基酸如(圖五)。但是此時發育中的水稻面臨了三個問題： (一). 由於植株本身是有從環境之中獲得而額外的氮源，所以並未如同正常缺乏氮源 時的情形，減少地上部的生長，重於地下部的發展。 (二). 希望將麩胺酸代謝為其它的胺基酸，所以硝酸還原酶產量被刺激上升。 (三). 環境(培養液)之中並無任何無機氮源，所以麩胺酸並未如預計般的代謝為麩醯胺 酸，更為被代謝為其它胺基酸。胺基酸的量並未大幅度的增加。 並沒有實際胺基酸或蛋白質的增加，卻又同時必須維持地上部生長與硝酸還源酶的 製造，發育中的水稻，不得不停止製造部分根部發育相關的酵素，以維持「收支平衡」， 以至根長在麩胺酸濃度上升時漸縮。①②③為可能在胺基酸 代謝的過程中，扮演著重 要的角色
柒 結論
一、 由討論一，麩胺酸並不適合取代無機氮肥成為水稻最佳的肥料。 二、 當麩胺酸為水稻能從環境獲得的唯一氮源，因為其代謝機制的影響，每吸收一單位 麩胺酸，與吸收一單位無機氮肥，所製造出蛋白質的量，以後者為多。捌 參考資料
一、 Aspects of Nitrogen Metabolism in the Rice Seedling。 From Plant Physiol. 1976 June; 57(6): 923–927.
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=542150
二、 BEEVERS, L. AND R. H. HAGEMAN. 1969. Nitrate reduction in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 20: 495-522.
三、 CRoy, L. I. AND R. H. HAGEMAN. 1970. Relationship of nitrate reductase activity to grain. protein production in wheat. Crop Sci. 10: 280-285.
四、 HAGEMAN, R. H. AND D. FLESHER. 1960. Nitrate reductase activity in corn seedlings as affected by light and nitrate content of nutrient media. Plant Physiol. 35: 700-708.
五、 LOWRY, 0. H.. N. J. ROsEBROUGH. A. L. FARR. AND R. J. RANDALL. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 133: 265-275.
六、 PEREZ, C. M., G. B. CAGAMPANG. B. V. ESMAMA. R. U. MONSERRATE, AND B. 0. JULIANO. 1973. Protein metabolism in leaves and developing grains of rices differing in grain protein content. Plant Physiol. 51: 537-542.
七、 LINCOLN TAIZ‧Plant Physiology。EDUARDO ZEIGER。Ch 12。P259~266。Assimilation of Mineral Nutrients
八、 Amino-acid influx at the soil-root interface of Zea mays L. and its implications in the rhizosphere From Plant and Soil 1994/2/25 p1-12
九、 Amino-acid uptake in Arabidopsis From SLU libraries 2008/8/25 Svennerstam, Henrik (2008) 十、 水中葉綠素 a 檢測方法－丙酮萃取法/分光光度計分析法 http://www.niea.gov.tw/niea/doc/E50702B.doc 十一、 圖片來源：[生化]有關 Nitrite reductase http://tw.knowledge.yahoo.com/question/question?qid=1508032907990 十二、 王月雲 陳是瑩 童武夫。植物生理學實驗增訂本。藝軒圖書出版 p88~95 ↑(圖五) 氮源在植物體內代謝過程
