行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告
雙性聚乙二醇接枝高分子之合成與鑑定以及其在藥物控制 釋放載體之應用(3/3)
研究成果報告(完整版)
計 畫 類 別 ： 個別型
計 畫 編 號 ： NSC 95-2221-E-011-064-
執 行 期 間 ： 95 年 08 月 01 日至 96 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立臺灣科技大學化學工程系
計 畫 主 持 人 ： 陳崇賢 共 同 主 持 人 ： 邱信程
計畫參與人員： 碩士班研究生-兼任助理：林均達、黃啟華、邱俊瑋、陳怡雯
處 理 方 式 ： 本計畫可公開查詢
中 華 民 國 96 年 10 月 04 日
中文摘要
本研究以酯交換反應來合成含有PEG 與二硬脂酸甘油(或正十八醇)之雙性高分子，並 由1H-NMR、GPC 計算接枝效率與相對平均分子量。此雙性高分子能在不同 pH 水溶液中 形成微胞，由螢光光譜與動態光散射光譜儀(DLS)分析高分子微胞之特性。在 pH 4.0 緩衝 溶液中，微胞有較低的CAC (1.87~24.4 mg/l)、較高的分配係數 (9588~8272)，以及較大的 粒徑(100~150 nm)。在微脂粒的改質實驗上，以 DLS 觀察在 30 天內之粒徑，經改質的微 脂粒呈現較佳的膠體穩定性，且嵌入Distearin 側鏈的微脂粒具有較高的嵌入效率、較高的 相轉移溫度(Tc)以及較低的螢光滲透率。又以 DLS 測量微胞之粒徑，發現含 Distearin 側鏈 的高分子較容易形成緻密且體積小之微胞。由以上結果得知，此類型高分子能有效的改善 微脂粒之膠體穩定性，且具有pH 敏感性。在不同 pH 水溶液中，微胞可以改變親疏水性 與結構形態，能有效的控制藥物的傳遞與釋放，以達到作為良好的藥物載體之目標。
英文摘要
In this study, amphiphilic polymers comprising both PEG and distearin (or stearyl alcohol) side chains were synthesized and characterized. Grafting efficiency and relatively average molecular weight were determined by 1H-NMR and GPC, respectively. Amphiphilic graft copolymer is capable of forming micelles in the aqueous solutions with different pH values. Characteristic properties of polymeric micelles were analyzed by fluorescence spectroscopy and dynamic light scattering (DLS). The colloidal system has lower CAC values (1.87~24.4 mg/l) and higher partitioning coefficients (9588~8272) and larger particle sizes (100~150 nm) in pH 4.0 buffer.
For the copolymer-modified liposomes, the liposome complex shows good colloidal stability, as shown by the DLS data. Liposomes encapsulated by distearin side chains have higher
encapsulation efficiency, higher phase transition temperature (Tc) and lower fluorescence
permeability. The copolymer with distearin side chains forms more compact and smaller micelles compared to the stearyl alcohol counterpart. These results indicate that the graft copolymers can effectively improve the colloidal stability of liposomes and are pH sensitive. These graft
copolymers find potential application as the pH-sensitive drug delivery carrier.
前言
高分子微胞應用於藥物控制釋放的初步概念源於 1984 年 Ringsodorf 等人之研究工作
[1-2]，在動物體實驗中也發現高分子微胞藥物明顯減少了腫瘤組織體積，這在癌症治療上
是一個重要的突破。大部份藥物都具有疏水性質，因此可利用高分子微胞將藥物包覆於疏 水的微胞核心內，與血液循環系統隔離，避免和非作用部位接觸以減少藥物之毒性。
為提升高分子藥物載體在血液中之生理相容性，除了控制其分子量與微胞粒徑外，
若在載體表面接上聚乙二醇(poly(ethylene glycol), PEG)，因為 PEG 的拒斥效應能減少粒子 與蛋白質之間的交互作用[3]，亦能達到延長載體在血液中之循環時間，並增加其在血液中 之穩定度。PEG 除了在分子量小於 400 時會呈現些微毒性之外[4]，基本上呈現非毒性、非 免疫性(nonimmunogenicity)[5]以及非抗原性(nonantigenicity)，它亦能降低蛋白質的吸附能 力(拒斥效應)[6]，即使和細胞膜作用也不會傷害細胞，因此被廣泛的應用在醫藥及生化領 域上。PEG 的用途多用在化學改質(modification)及加附於其他分子或表面上[4]。在 PEG 與 reticuloendothelial system(RES)關係的研究方面，Alberto 等人[7]將 Doxorubicin 包埋在含有 PEG 的磷脂粒中，研究 Doxorubicin 在血液中濃度對時間之關係，發現其內包藏的 Doxorubicin 在血液中的半生期比包埋在不含 PEG 的磷脂粒中的半生期增加了一倍，此結 果表示 PEG 幫助磷脂粒降低被 RES 攝取之機率。因為 PEG 之特性以及在藥物控制釋放上 之諸多優點，使其可作為高分子微胞中的親水性組成部分。
雙性高分子的合成方法主要有兩類。第一類為牽涉巨單體(macromonomer)的自由基加 成聚合反應，Wesslen 等人[8]將改質的 PEG 巨單體與甲基丙烯酸系列的單體溶在甲苯中，
以 AIBN 為起始劑製備梳狀高分子；第二類則為接枝反應，例如 Twaik 等人[9-11]利用 poly(ethylene glycol) monomethyl ether(mPEG)上的羥基與具有酯基的骨幹高分子，進行強 鹼催化之酯交換反應(alkali-catalyzed transesterification)，把 mPEG 接枝至骨幹高分子上。
在我們之前的研究工作係以自由基加成聚合法合成含 PEG 與膽固醇側鏈的雙性高分
子[12-13]。在本研究中，我們選用酯交換法合成含有 PEG 之雙性高分子，由於雙性高分子
的主鏈分子量高，可提供較多的反應官能基團給予含有親疏水基分子進行接枝反應，因此 能有較高的接枝效率。分別選用二硬脂酸甘油(Distearin)與正十八醇(SA)作為疏水鏈段，
兩者雖碳鏈長度相近，前者有兩條脂肪鏈並以甘油為主體相似於磷脂質結構，而後者則只 有單一條脂肪鏈。藉由疏水基的種類以及接枝比例的不同，來探討所形成高分子微胞性質 的差異性，由不同的疏水鏈段所形成的微胞核心，不論在疏水物質(藥物)的包覆量以及微 胞結構組成的變化等，皆會有不同的影響。又以磷脂質所形成的微脂粒(Liposome)，當雙
性高分子的疏水基側鏈嵌入其雙脂層中，親水的 PEG 鏈段伸展到水相中，經由探討微脂 粒的安定性以及物理性質所產生之變化，可進一步探討含不同疏水基側鏈在水相中排列形 成微胞時之差異性，以作為包覆與傳遞疏水性藥物之高分子載體評估用。
實驗部份 1. 藥品
本實驗以N-羧基丁二醯亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS, Aldrich)與丙烯醯氯(acryloyl chloride, Fluka)以氯仿(chloroform, Mallinckrodt)為溶劑，以三乙胺(triethylamine, TEA, Acros)作為催化劑反應，形成 N-acryloxysuccinimide(NAS)，經由起始劑偶氮二異丁 (2,2- Azobisisobutyronitrile, AIBN, Showa)引發反應形成雙性高分子之主鏈 poly N-
acryloxysuccinimide(PNAS)，再分別以二硬脂酸甘油(1,2-distearoyl-rac-glycerol, Distearin, BACHEM)、正十八醇(stearyl alcohol, SA, Aldrich)為疏水鏈段，以聚乙二醇胺基甲基醚 (poly(ethylene glycol) amine methyl ether, mPEG-NH2)為親水鏈段，以三乙胺、DMAP (4- Dimethyl-aminopyridine, Aldrich)為催化劑，二甲基甲醯胺(N,N-Dimethyl Formamide, DMF, J.T.Backer)為溶劑下反應形成雙性高分子。在螢光實驗上，以焦油腦(pyrene, Aldrich 試藥級)、5(6)-CF(5(6)-Carboxyfluorescein, Acros)作為高分子微胞與微脂粒的物理化學性質 分析用。至於在微脂粒的製備上，則使用磷脂醯膽鹼 (L-α-phosphatidylcholine, Egg PC, Sigma)、膽固醇(cholesterol, Sigma)作為主要的雙脂層結構。
2. 雙性高分子製備
2.1. 將 NHS 置入反應瓶中，加入氯仿、三乙胺充分攪拌溶解，逐滴加入丙烯醯 氯，於 0℃冰浴下反應 1 小時。以飽和食鹽水進行萃取，萃取液以硫酸鎂除水攪拌 兩個小時後，以抽氣過濾收集液體。將溶液減壓濃縮去除部分氯仿，加入乙酸乙酯 與 正 己 烷 稀 釋 攪 拌 ， 靜 置 後 加 熱 至 沸 騰(69~70℃) ，並迅速抽氣過濾、沉澱在冰正 己烷中，過濾沉澱物、乾燥後得產物 NAS。
2.2. 將 NAS、AIBN、DMF 置入反應瓶中，均勻地攪拌後，通入氮氣以去除氧 氣，於 55 ℃油浴下反應 20 小時。將溶液減壓濃縮，沉澱在冰丙酮中，過濾沉澱 物、乾燥後得產物 PNAS。
2.3. 將 PNAS 與 Distearin 或 SA 置入反應瓶中，加入 DMF 攪拌溶解後，加入 DMAP 在 60℃油浴下開始反應 120 小時。
2.4. 將 PNAS-Distearin 或 PNAS-SA 與分子量 2000g/mol 的 mPEG-NH2置入反 應瓶中，加入 DMF 溶解後，加入三乙胺於 60℃的油浴下反應 120 小時。
2.5. 取少量 pH = 8 的 Tris 緩衝溶液，加入 2.4. 的反應瓶中進行水解反應，在 50 ℃ 的 油 浴 下 反 應 96 小 時 。 將 已 水 解 好 的 高 分 子 溶 液 置 入 透 析 袋 中 (MWCO=12000~14000)，在超純水中進行透析 96 小時。將透析好的溶液，置入超 過 濾 裝 置 中 ， 利 用 過 濾 膜(MWCO=10000) 將 未 反 應 的 單 體 移 除 。 將 過 濾 後 的 溶 液 進行冷凍乾燥，收集乾燥固體即為產物。雙性高分子之反應式如 Scheme 1 所示。
3. 雙性高分子性質分析 3.1. 1H-NMR 光譜分析
取約 10 mg 高分子樣品置於 NMR 試管中，加入 0.8 ml 含 0.05 % v/v TMS 之 CDCl3溶 劑，樣品經攪拌溶解後，即可進行測量。
3.2. 高分子微胞製備
將高分子依所設計之濃度配製溶解在 DMF 中，待完全溶解後，將溶液置入透析袋中 (MWCO=12000~14000)，依所需 pH 值(4、5、6、7)配製不同緩衝溶液，在緩衝 溶液中透析 3 天，結束後利用 0.22 µm 的過濾器過濾高分子溶液，以去除其他雜質 並進行接下來的高分子微胞性質分析。
3.3. 臨界聚集濃度之測量
將焦油腦加入丙酮溶液中，配製 2.47×10-5 M 的焦油腦溶液，以磁石攪拌至完全 溶解，儲存於冰箱中，取 50 μl 焦油腦溶液置入空樣品瓶中，加熱讓丙酮揮發，並 加入 2 ml 高分子溶液(pH = 4、5、6、7)，使焦油腦達飽和濃度 6.17×10-7 M，放置 在黑暗中一晚使其達平衡狀態。設定螢光光譜最大激發波長於 336 nm，螢光波長 範圍在 350～450 nm，取波長為 385 及 373 nm 之螢光強度分別定為 I3及 I1，以 I3/I1 值對不同高分子濃度 (取對數) 作圖，並以圖形的轉折處定為其臨界聚集濃度 (critical aggregate concentration, CAC)。
3.4. 焦油腦消光實驗
配製 1×10- 4、2×10- 4、5×10- 4 M 之硫酸銅溶液，取微量置入樣品瓶中，作為 消光劑使用。將含未飽和焦油腦的高分子溶液(0.1 g/l, pH = 4、5、6、7)加入樣品 瓶 中 ， 放 置 在 黑 暗 中 一 晚 使 其 達平 衡 狀 態 ， 其 焦 油 腦 濃 度 為 1.0×10- 7 M。觀察未 加入與加入硫酸銅螢光波長 385 nm 之原始螢光強度 I3 , 0與 I3值，並計算溶液中高
分子對焦油腦之重量平均分配係數(weight-averaged partition coefficient, Kw)。
3.5. 高分子微胞粒徑之測量
將高分子微胞溶液以 0.22 µm 的過濾器過濾後，注入玻璃槽中調整動態光散射分析 儀之 CPS (number of photons counted per second)在 8000~12000 之間，測量高分子在不同 pH 值下的水動力直徑。
4. 雙性高分子－微脂粒複合物之製備與其性質分析
4.1. 將高分子溶解在共溶劑(氯仿:甲醇 = 2:1, v/v)中，濃度為 2 mg/ml，取 40 mg EggPC 及 16 mg 膽固醇溶解於 4 ml 共溶劑中後，再加入 5 ml 之高分子溶液。加入玻璃珠 於室溫下震盪 10 分鐘攪拌均勻，利用真空旋轉濃縮機將有機溶劑抽乾，待絕大部份溶劑 消失後，再持續抽2 小時，並以真空烘箱乾燥 2 小時以完全移除有機溶劑。加入 10 ml pH
= 7.4 的 Tris 緩衝溶液，於室溫下攪拌 10 分鐘，用 200 mesh 的濾網將玻璃珠移除，以超音 波震盪器將微脂粒溶液在 30 分鐘內震盪 10 次，利用 Gel Filtration Chromatography(GFC) 來分離未嵌入微脂粒之高分子。
4.2. 雙性高分子嵌入效率
將經由 GFC 分離純化過後的雙性高分子－微脂粒複合物水溶液，進行冷凍乾燥程序 可得到複合物，利用 1H-NMR 光譜分析特定化學位移信號之積分面積後，計算高分子的 嵌入效率。
4.3. 微脂粒粒徑對時間之變化
將 微 脂 粒 溶 液 注 入 四 面 刨 光 之 比 色 槽 中 ， 調 整 動 態 光 散 射 分 析 儀 之 CPS 在 8000~12000 之間，測量其水動力直徑與時間的關係。
4.4. 滲透實驗
將實驗4.1. 的 Tris 緩衝溶液改為 60 μΜ 的 5(6)-CF 溶液，其餘步驟皆相同，製備成包 覆 5(6)-CF 的微脂粒溶液，再以 Tris 緩衝溶液稀釋成 20 μΜ CF 溶液，並用鋁箔紙將容器 包住，設定螢光光譜激發波長為 470 nm，螢光波長範圍在 475～650 nm，取其波長約在 516 nm 處之螢光強度。起始螢光強度為 Fmin，接著測量 24 h、48 h、120 h 之強度為 F(24 h)、F(48 h)、F(120 h)，取 10% (v/v) Triton X-100 來破壞微脂粒結構之強度為 Fmax。微脂 粒初期滲透率之計算如下 :
( ) min
(%) 100%
max min
F t F Permeability
F F
= − ×
−
4.5. 微脂粒相轉移溫度之測量
將各種雙性高分子－微脂粒複合物水溶液，利用冷凍乾燥機乾燥所產生之固體粉末置 於DSC 的樣品盤中。用冰水降溫至 5 ℃後，升溫速率為 5 /min℃ 至60 ℃。依 DSC 的曲 線變化(焓值變化)判斷微脂粒中磷脂質的相轉移溫度(Tc)，並觀察雙性高分子的嵌入對於 磷脂質的相轉移溫度之影響。
4.6. 電子順磁共振實驗
將 16-doxyl-steric acid (16-DSA)加入氯仿溶液中，配製成 5×10-4 M 的溶液，以磁石攪 拌至完全溶解，儲存於冰箱中。取 100μl 的 16-DSA(為本實驗選用之自旋標記分子)溶液置 入空樣品瓶中，使溶劑揮發後，加入不同 pH 值的高分子微胞溶液，或雙性高分子－微脂 粒複合物水溶液，搖晃均勻後即可進行 EPR 實驗，探測樣品溶液在其微環境之黏度、極 性與親疏水性變化。16-DSA 在 EPR 的磁場中旋轉時，會在低、中、高磁場產生三個明顯 的訊號峰，以此訊號峰可計算 16-DSA 在微胞溶液中的 rotational correlation time (τ)以及 hyperfine coupling constant (aN)兩個參數。τ 及 aN的計算如下式，其中 A = 6.6×10-10，
H
△ (+1)為低磁場訊號的峰與峰之間的距離、I(+1)為低磁場訊號的峰與峰之間的高度、I(-1)為 高磁場訊號的峰與峰之間的高度、 2A∏與2A⊥如右圖
16-DSA 之 EPR 光圖譜所示。
1/ 2 ( 1) [( ( 1) / ( 1)) 1]
A H I I
τ = Δ + + − −
( 2
N 3
) A A
a + ⊥
=
結果與討論 1. 雙性高分子組成分析
經由酯交換反應所合成的雙性高分子，其1H-NMR 光譜如 Figure 1、Figure 2 所示，
並利用其計算PEG 與 Distearin (或 SA)的接枝效率與組成，以 TMS 為內標準品並將其積 分面積定為1，以 PEG 為外標準品在 3.65 ppm (-CH2CH2O-)的積分面積與濃度作檢量線，
可計算出樣品中PEG 的莫爾數。將 Distearin (或 SA)在 0.89 ppm (脂肪鏈末端的-CH3)的積 分面積除以PEG 在 3.38 ppm (末端甲基醚-O-CH3)的積分面積，即為疏水基對親水基的莫 爾數比，再乘上PEG 的莫爾數後，可得 Distearin (或 SA)的莫爾數。由測試樣品重量扣除 PEG 與 Distearin (或 SA)重量剩下的為主鏈之重量，可計算各組成的相對莫爾百分比，其 結果列於Table 1.。
在高分子分子量的測量上，將高分子主鏈PNAS 水解成聚丙烯酸(PAAc)，以 SEC 測 量聚丙烯酸之相對平均分子量為Mw = 50000 g/mol、Mn = 48000 g/mol、PDI = 1.04，由
1H-NMR 所計算的接枝比例，可得知雙性高分子的分子量大小、親疏水基的數目、溶解度 參數[14]以及HLB 值[15]，其結果列於Table 2。溶解度參數的計算式為 ( i)1/ 2
i
Ecoh δ = ∑ Vm
∑ ，
HLB 的計算式為 HLB = 7 + Σ(親水基數目) － Σ(疏水基數目)，將計算的基準設定在主鏈未 解離的情形，則AAc 單元結構以~COOH 來作各參數值之計算。
.2. 臨界聚集濃度分析
1E-8 1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0.01 0.1 1 10 0.65
0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
CAC = 0.00558 g / l I 3 / I 1
Concentration (g / l)
以焦油腦之螢光強度(I3/I1)對高分子濃 度(取對數)作圖，得到一轉折點(如右圖所 示)，這是因為增加高分子濃度時，高分子 主鏈上的 Distearin 或 SA 會因疏水作用力 的增強，而漸漸地聚集在一起形成微胞，這 會使疏水的焦油腦進入微胞核中，讓I3 的強度 會漸漸比I1 來得大，此轉折點之高分子濃度即 為CAC，各個 CAC 值如 Figure 3 所示。在相 同 pH 下，高分子微胞之 CAC 會隨著
Distearin 或 SA 數目的增加而減小，SA5 的 CAC 約為 SA10 的十倍，這是由於疏 水作用力的增加，疏水基彼此間較易聚集在一起，使得高分子在低濃度下容易形成 微胞。當 pH 改變時，CAC 會隨著 pH 的增加而稍微增加，由於高分子主鏈為 pH 敏感之聚丙烯酸(pKa 約在 4.25)[ 1 6 , 1 7 ]，其結構對於 pKa 之關係為 :
~ pKa ~
COOH >pKa COO−
⎯⎯⎯< →
←⎯⎯⎯
而高分子主鏈上的羧基其未解離時較解離時要來得疏水，推測在低 pH 下誘導主鏈 與 Distearin 或 SA 聚集在一起，增加了彼此間的交互作用，而改變了微胞的結 構，隨著 pH 的增加，主鏈則解離成較親水的狀態，疏水作用力則會開始下降，較
不易形成微胞。因此由 CAC 的結果可得知，高分子微胞的形成會與疏水基多寡以 及水溶液 pH 質高低有關。
3. 焦油腦消光實驗分析
銅離子(Cu2+)具有將焦油腦螢光強度消光之特性，而銅離子無法進入微胞粒子的疏水 核心內，所以無法將微胞核心中的焦油腦螢光強度減弱，故利用此特性可以估算焦油腦在 微胞與水相中之含量。若未加入銅離子前之焦油腦螢光強度為 I3,0，加入銅離子後之焦油 腦螢光強度為 I3，則 I3,0 /I3比值便是被銅離子消光之焦油腦比例， I3 /I3,0即為焦油腦包覆 量之百分比(loading capacity)，Kw 的定義為 Kw＝Cm/Cs(Cm:微胞內焦油腦之莫爾數/
微胞克數、Cs:焦油腦在溶液中之莫爾數/溶劑克數)[ 1 8 ]，其結果如 Figure 4 所示。在 實驗中的焦油腦濃度(1.0×10- 7 M)設定在低於飽和濃度(6.17×10- 7 M)，主要是要讓焦油 腦能夠分配在水相與微胞間達平衡，而這一系列的高分子 Kw 的範圍由 9588~6827，另外
在文獻[18-19]中的高分子微胞，其 Kw 為 2.2×105~1.7×104，這顯示了以芳香族分子形成之疏
水核心與焦油腦有較佳的相容性，因此Kw 較本研究之微胞來得高。
在相同 pH 時，疏水基數目與 Kw 成正比，這顯示了越疏水的微胞核心越能夠包覆 大量的焦油腦，使它不被銅離子所消光。但是在低 pH 的 D2 與 D5 卻是不同的，推測 是由於疏水基數目相近，在主鏈的聚集下造成兩者的 CAC 與微胞的結構相近，因 此產生了這樣的差異。而在改變 pH 時，Kw 會隨著 pH 的增加而變小，推測其結果 與主鏈之 pH 敏感性有關。在低 pH 的環境下，由主鏈與 Distearin 或 SA 所聚集形 成之微胞，其結構較緻密且堅固，因此能夠包覆較多的焦油腦。反之，在高 pH 的 環境下，則沒有主鏈的疏水效應協同下，使得微胞結構較為鬆散，因此只能包覆少 量的焦油腦。
4. 高分子微胞粒徑分析
為了瞭解疏水基側鏈 Distearin、SA 所形成的高分子微胞，其結構與型態之差異性，
利用動態光散射光譜儀(DLS)觀察微胞粒徑在不同 pH 水溶液之變化，其結果如 Figure 5 所示。微胞粒徑的分佈指數(U/G2)在 2×10-1~4×10-1之間，屬於寬分布的情形，在測量過程 中並未發現有沈澱產生，這顯示以 PEG 所產生的立體障礙排斥性，可有效的增加微胞的 穩定性。由 Figure 5 結果得知 D5 在不同 pH 的粒徑皆比 SA10 來的小，而兩者的親疏 水基數目相近，推測由於 Distearin 的雙脂肪鏈所排列聚集的微胞，其核心的緻密 度較 SA 的單脂肪鏈來的高，以至於形成密度高、粒徑小的微胞。粒徑與 pH 的關 係上，在 pH = 4 時兩者的粒徑都偏高，並隨著 pH 的增加而減小，當 pH = 7 粒徑
又開始增大。推測這是由於在 pH = 4 主鏈上之羧基並未完全解離，因而與疏水基 或其它主鏈聚集形成大粒徑的微胞，這與文獻中聚天門冬胺酸(PASP)在低 pH 下凝 聚現象相同[ 2 0 ]。隨著 pH 的增加主鏈上之羧基開始解離，慢慢被拉出水相，使微胞 的粒徑與聚集數目減少；當 pH = 7 主鏈上的羧基已完全解離成 COO－，與水中的 鈉離子結合，造成微胞核心的結構較不緻密而有些許的空洞，則水分子開使進入核 心裡，造成微胞有膨潤的現象(Swelling)而使粒徑增大。此結果也與 CAC、消光實 驗分析的親疏水性結果相呼應，因此在 pH = 4 才有較低的 CAC 與較高的 Kw，而 在pH = 7 則相反。以上所推測的微胞結構型態之變化見 Figure 7，其中(a)為 pH = 4 的微胞結構，(b)為 pH = 7 的微胞結構。
5. 雙性高分子－微脂粒複合物性質分析
將雙性高分子嵌入微脂粒中以探討 Distearin、SA 對於脂雙層產生的影響(如相容性或 破壞性的程度等)，以進一步瞭解兩者在自組排列 (self-assembling)時的差異性。在微脂粒 穩定度的觀察上(Figure 6)，可發現有嵌入高分子的微脂粒，在三十天內的粒徑並沒有明顯 的變動，反之，純微脂粒的粒徑隨時間則有明顯的增加，這顯示高分子上的 PEG 側鏈產 生了立體障礙排斥作用力，使微脂粒彼此間不易聚集而達到穩定的效果。
在計算雙性高分子在微脂粒表面上之嵌入效率方面，可利用1H-NMR 光譜依照不同官 能基所出現化學位移的差異性而得到。由於已知所添加高分子與磷脂質的重量，可計算 PEG 對磷脂質莫耳比之理論值。化學位移在 3.646 ppm (-CH2CH2O-)為 PEG 的積分面積，
而在 3.343 ppm (-N-(CH3)3)為磷脂質加上 (-O-CH3) PEG 的積分面積，設 x 為 PEG 在樣品 中的含量、y 為磷脂質在樣品中的含量，以這兩處的關係式(1) (2)解聯立方程式 :
3.646 ppm 的積分面積 = 172 x ----(1) ; 3.343 ppm 的積分面積 = 3 x + 9 y ----(2) 實驗值則為 x / y，最後以實驗值除以理論值即可得雙性高分子之嵌入效率。由 Table 3 中 得知，Distearin 系列的嵌入效率隨疏水基數目增加而上升，推測是由於 Distearin 的雙脂肪 鏈長度、結構與磷脂質相近，脂肪鏈向內排列的吸引力大於 PEG 向外拉伸的排斥力，而 能造成有效的嵌入。而 SA 的嵌入效率較低，我们推測是 SA 在嵌入時，由於單脂肪鏈與 雙脂層的排列相容性較差，而間接破壞了磷脂質的排列，接著受到 PEG 影響而被拉向水 相形成微胞，致使SA 的嵌入效率減少。
由 CF 滲透與 Tc 測量(Table 3)的實驗結果顯示，Distearin 系列比起 SA 系列有較低的 CF 滲透率與較高的 Tc 點，這是由於 Distearin 的雙脂肪鏈嵌入雙脂層中時，有較佳的排列 相容性，使雙脂層表面受到嵌入而產生的孔隙會比 SA 系列要來得小，使 CF 較無法大量
的滲透至水相之緣故，亦即 SA 較 Distearin 容易破壞掉微脂粒之表面完整性。而由 Tc 的 觀點來看，由於磷脂質的雙脂肪鏈溫度在 Tc 點的前後，會有不同的排列情況(<Tc:凝膠 態、>Tc:液晶態)，因此有較低的 Tc 點可以表示，疏水基的嵌入破壞了雙脂肪鏈原本的排 列，使它能夠以更低的能量轉為液晶態。隨著 Distearin 與 SA 數目的增加， Tc 點則會產 生下降的趨勢，且SA 系列下降的幅度較大，這與 CF 滲透實驗的結果相呼應。
6. 高分子微胞 EPR 實驗分析
當 16-DSA 在高分子微胞溶液中受到疏水作用力之影響，會使其末端疏水的長碳鏈進 入微胞核心中與高分子疏水側鏈聚集在一起，而親水的氮氧自由基則會留在水相或微胞殼 層上。τ 的大小是取決於 16-DSA 在磁場下完全旋轉的時間，當 τ 值越大時，表示 16-DSA 的長碳鏈處在一較疏水的微胞核心中，亦或核心裡的局部黏度較高，使其需要較長的時間 在磁場中進行旋轉。aN則是代表 16-DSA 的氮氧自由基所處環境之極性大小，aN值越高表 示處在一較親水的微胞殼層中。
本實驗中，選用雙性高分子 D5 與 SA10 為實驗對象，並觀察 Distearin 與 SA 側鏈 所形成的微胞，其結構與親疏水性之差異性。由Figure 8 中，發現 16-DSA 在 pH = 7 的 水溶液時，其 τ 值為最低(0.91~0.93 × 10-10 s)，隨著 pH 值的減少 τ 值則會上升。由螢 光、消光與 DLS 的實驗結果分析，得知高分子微胞的親疏水性受到 PAAc 解離度之不 同，而會呈現出不同的親疏水性，故在此推測高分子微胞與 16-DSA 間作用力的變化情 形。在高 pH 值時，微胞核心內的疏水作用力受到 PAAc 膨潤的影響，變得較弱且黏度 較低，而 16-DSA 的長碳鏈進入核心內與 Distearin 或 SA 側鏈聚集在一起時，僅需要較 短的時間進行旋轉，因此 τ 值較低。當 pH 值逐漸減小時，PAAc 未解離的部份會開始 產生氫鍵，增加核心內疏水側鏈的疏水作用力，16-DSA 受到核心內較強的作用力影 響，而需要較長的時間進行旋轉，這表示pH 值的減少會使微胞的疏水性增加。
由 Figure 9 中，可以發現 16-DSA 的 aN會隨著 pH 值的增加而增加，呈現一正比的關 係。這表示在高 pH 值下，氮氧基團是處於極性較高的微環境裡，亦或是較為親水性的微 胞殼層上，因此 aN值約在 15.57~15.61。而在低 pH 值下，氮氧基團則是處於極性較低、
疏水性稍高的微環境裡(微胞殼層)，使 aN值下降至 15.42~15.48。觀察實驗的結果後，發 現pH 與 aN間的關係是由PAAc 與 PEG 形成的 complexes 結構所造成。
結論
由 PNAS 進行酯交換反應，接枝 PEG 親水側鏈與 Distearin 或 SA 疏水側鏈之雙性高 分子，其接枝效率約為 60~90%，分子量為 15.6~18.9×104 g/mol。將雙性高分子嵌入微脂 粒中，能夠有效增加膠體系統的穩定性，在長時間下也不易產生沉澱。在 Distearin 與 SA 的差異性上，Distearin 較 SA 側鏈能與磷脂質排列形成結構完整性高且緻密度較高的微脂 粒薄膜，對於微脂粒的雙脂層有較高的嵌入效率、較高的相轉移溫度以及較低的螢光滲透 率，因此有良好的排列相容性與低破壞性。除此之外，此雙性高分子還具有 pH 敏感之特 性，在低 pH 時，微胞顯現較疏水的性質，具有較低的 CAC、較高的 Kw 以及較大的粒 徑；而在高 pH 則呈現相反的性質。因此利用這樣的特性，當高分子微胞處於不同 pH 的 環境下，可以有效的改變微胞的結構與其親疏水性，並控制包覆的藥物進行傳遞與釋放，
來達到作為多功能性藥物載體之目標。
參考文獻
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Scheme 1. 雙性高分子反應機構
PNAS
HO
Distearin
O CH2CH3 16 O
CH2 CH3
O 16
O
N O
O O
CH2 CH C O
n
NH2 O
H3C
mPEG-NH2
n
NH2 O
H3C
mPEG-NH2
n H3C CH2 OH
17
Stearyl alcohol
Tris buffer pH 8 Tris buffer pH 8
O CH2 CH
C O x
CH2 CH C O y O
O CH2CH3
16
O
CH2CH3
O 16
O
HN CH2 CH
C O z
O CH3
n
O CH2 CH
C O x
CH2 CH C O y O
CH2
HN CH2 CH
C O z
O CH3
n
CH3
17
PAAc-Distearin-PEG
PAAc-SA-PEG
Table 1. 高分子產物之組成
Grafting efficiency Run No. Feed (%)
(mol%) Composition
(mol%) Distearin
(or SA) PEG D10 PNAS /Disterin/PEG
100/10/10 AAc/Disterin/PEG
87.95/5.95/6.10 59.5 61.0 D5 PNAS /Disterin/PEG
100/5/10 AAc/Disterin/PEG
88.13/4.65/7.22 92.9 72.2 D2 PNAS /Disterin/PEG
100/2/10
AAc/Disterin/PEG
90.86 / 2.11 / 7.03 100 70.3 SA10 PNAS/SA/PEG
100/10/10
AAc/SA/PEG
81.48/9.64/8.88 96.4 88.8 SA5 PNAS /SA/PEG
100/5/10
AAc/SA/PEG
86.97/4.33/8.70 86.6 87.0
Table 2. 高分子產物之性質 Run No.
Mw
×10-4 (g/mol)
NAAC ND
(or NSA) NPEG HLB δ
(cal/cm3)1/2 D10 15.9 610.7 41.3 42.4 8.21 13.48
D5 16.9 612.0 32.3 50.1 8.54 13.49 D2 15.6 630.9 14.7 48.8 8.86 13.62 SA10 18.9 565.8 66.9 61.7 8.57 13.16 SA5 17.7 603.9 30.1 60.4 9.00 13.43
Table 3. 各高分子-微脂粒複合物之嵌入效率、相轉移溫度與螢光滲透率 CF permeability(%) Run No. Encapsulation
efficiency(%) Tc( )℃
24h 48h 120h D10 78.22 39.63 21.67 26.53 30.14
D5 69.70 40.39 20.94 25.22 27.97 D2 58.33 42.04 20.96 25.33 28.79 SA10 60.44 35.70 24.31 30.66 34.84 SA5 61.14 39.62 23.71 27.86 29.85
L － － 19.97 24.94 26.9
D10 : Distearin 10mol%, D5 : Distearin 5mol%, D2 : Distearin 2mol%, SA10 : SA 10mol%, SA5 : SA 5mol%, L : Liposome
O CH2 CH
C O
x
CH2 CH
C O
y O
O CH2CH3 16 O
CH2CH3
O 16
O
HN CH2 CH
C O
z
O CH3 n
a
b c
e d
f a b
c d c d
Figure 1. 含 Distearin 雙性高分子1H-NMR 圖譜
Figure 2. 含 SA 雙性高分子1H-NMR
O CH2 CH
C O x
CH2 CH C O
y O
CH2
HN CH2 CH
C O z
O CH3 n CH3
17
a b
c c c
e d
4 5 6 7 10-3
10-2 10-1
Distearin 10 mol%
Distearin 5 mol%
Distearin 2 mol%
SA 10 mol%
SA 5 mol%
CAC (g / l)
pH
Figure 3. pH 值對各高分子微胞 CAC 之影響
4 5 6 7
7000 8000 9000 10000
Distearin 10 mol%
Distearin 5 mol%
Distearin 2 mol%
SA 10 mol%
SA 5 mol%
Kw
pH
Figure 4. pH 值對各高分子微胞 Kw 之影響
4 5 6 7 50
75 100 125 150
Hydrodynamic diameter (nm)
pH
SA 10 mol%
Distearin 5 mol%
Figure 5. pH 值對各高分子微胞粒徑之影響
0 5 10 15 20 25 30
100 200 300 400
Hydrodynamic diameter (nm)
Time (days)
Distearin 10 mol % Distearin 5 mol % Distearin 2 mol % SA 10 mol % SA 5 mol % Native liposome
Figure 6. 各高分子-微脂粒複合物之平均粒徑隨時間之變化情形
Figure 7.pH 值對高分子微胞結構型態影響之示意圖
4 5 6 7 1
2 3
Rotational correlation time x 1010 (s)
pH
SA 10 mol%
Distearin 5 mol%
Figure 8. pH 值對雙性高分子 D5 與 SA10 τ 值之關係圖
4 5 6 7
15.42 15.48 15.54 15.60
Hyperfine coupling constant (Gauss)
pH
SA 10 mol%
Distearin 5 mol%
Figure 9. pH 值對雙性高分子 D5 與 SA10 aN值之關係圖
