應用化學位移影像於偵測大鼠神經膠質瘤之代謝物變化

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國立臺灣大學電機資訊學院生醫電子與資訊學研究所碩士論文

Graduate Institute of Biomedical Electronics and Bioinformatics College of Electrical Engineering and Computer Science

National Taiwan University Master Thesis

應用化學位移影像於偵測大鼠神經膠質瘤之代謝物變化 The Utility of Chemical Shift Imaging in the Detection of the

Metabolic Changes in a Rat Glioma Model

邱豐茂 Feng-Mao Chiu

指導教授：陳志宏博士張程博士

Advisors : Jyh-Horng Chen, Ph.D.

Chen Chang, Ph.D.

中華民國 102 年 1 月

January, 2013

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誌謝

完成一本碩士論文仿如行駛一艘船，在未知的航程及終點上，我花兩年半的時間才勉強將這艘船靠岸，掌舵的我很榮幸在這一路上受到很多人的指引及支持，

沒有你們這趟航行是不能完成的。

首先非常感謝我的兩位指導教授，陳志宏教授及張程教授，兩位老師在這兩年半的付出了很多時間栽培我，不論是研究方法或態度的琢磨，或者是磨練人生處事的方法，對於此由衷感謝兩位老師真心的付出。

再來我必須感謝我的阿嬤，今天能夠完成這篇碩士論文，有一半是屬於妳的。

我是真的很幸運能當妳二十多年的孫子，過去常常一回到家就是跟妳分享生活上的大小細瑣雜事，而妳總是用七八十年的經驗智慧來回應我，到現在我都反覆品味著，我相信每個人都有最珍貴的寶藏，對我來說就是這段回憶，再次謝謝妳把我養這麼大到考上台大，接下來的路我會努力自己走給妳看的。

我的家人，非常感謝你們，常常回家我就臭著臉，還要你們忍受我的爛脾氣，

真是委屈你們了。你們是我最強的後盾，每次回家我就一直嚷嚷著實驗失敗做不出來，你們還是對我有信心一直鼓勵我，感謝你們對我一路走來的支持。

洺軒，我的好兄弟，感謝你帶我入門MRI 的操作與實驗以及你一路的扶持，

筠安學長常提供給我許多研究上的寶貴意見，和你討論讓我的思路更清晰，很幸運能跟你一起做研究，建翔學長多謝你一年多的照顧。還有其他實驗室的謝昭賢博士、胤藏學長、億澤學長、孟錡學長、彥良學長、Chester、俊瑋、威而、乃維、

Sherry、小麥、慧芬，兩年半的生活因你們而充滿美好回憶。最後，鈺惠謝謝妳。

未來生活上的挑戰，謹以此誌謝與各位共勉之。

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中文摘要

分子影像在未來個人化醫療扮演診斷的重要角色，而核磁共振中之化學位移影像正提供非侵入式的方法，來獲取代謝物在不同組織上之分佈與含量，在大腦疾病上之應用可提供不同代謝物與疾病之間的訊息，對於發病機制及治療成效評估上是舉足輕重的一項工具。

多形性神經膠母細胞瘤(GlioBlastoma Multiforme，GBM)在腦癌中為侵襲性高以及成長快速之癌細胞，亦是高度惡性的腦癌，並且也是腦瘤中的最大宗。腫瘤治療計畫與療效評估與其癌細胞的生理特性、機制以及狀態有緊密的關係，化學位移影像提供各種代謝物在大腦中的分布，因而此技術可用以觀察組織生理特性與狀態，進一步得到關鍵的訊息。

本論文目的為建立化學位移影像(Chemical Shift Imaging，CSI)之實驗標準化流程，並且將之應用在多形性神經膠母細胞瘤之動物模型。將C6 神經膠質瘤植入大鼠鼠腦紋狀體，利用化學位移影像以及活體磁振頻譜觀察神經膠質瘤與其正常對側組織之代謝物，並且比較其之間生理狀態之差異。從實驗結果可以得知，在C6 神經膠質瘤可以觀察到正常神經元細胞死亡，腫瘤細胞快速生長、代謝活性增加以及腫瘤中心區域缺氧。

總結本實驗所建立起之 CSI 可以將代謝物分佈影像化，從結果可得知化學位移影像具有定量腫瘤組織代謝物組成之潛力，但惟其冗長掃描時間以及其低空間解析度仍有相當大的改進空間，所以未來將針對上述兩者的問題，在脈衝序列以及後處理的方面上改善化學位移影像技術。

關鍵字：分子影像、化學位移影像、多形性神經膠母細胞瘤、代謝物

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ABSTRACT

Molecular imaging shall play an important role in the diagnosis for the personalized medicine in the future. Chemical shift imaging (CSI), one of molecular imaging techniques, provides us an opportunity to non-invasively assess the distribution and concentration of the metabolites of interest in different living tissues. In the case of brain diseases, CSI provides insight into the relationship between disease progress and metabolic changes. Therefore, CSI is an invaluable tool to reveal the mechanisms underlying the brain diseases and helpful in conducting the treatment plan.

Glioblastoma multiforme is an aggressive and fast-growing tumor cell in brain cancers, so it is a highly malignant brain cancer. And it is the major of all brain cancer population. The treatment planning and the therapeutic evaluation have close relationship with the physiological characteristics, mechanism, and state of tumor cell.

CSI provides the distributions of variable metabolites in the brain, and it can be used to observe physiological characteristics and state of the tissue to get key information.

The aim of this thesis is to establish the experimental standard procedure of the CSI.We’ve applied it to the rat model of glioblastoma multiforme. After the implantation of C6 glioma cells into the rat striatum, the metabolic changes and physiological status in the growing tumor and the contralateral normal tissue were observed by CSI. Our results showed neuronal loss in the tumor-implanted striatum with rapid growth and increased metabolic activity in C6 tumor, and hypoxia in the core of tumor.

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Conclusively, our results demonstrate that CSI can be applied to detect the distribution of metabolites.From the results, it shows the potential of the quantification for the composition of tumor tissues. But there are still great room for improvements of the prolonged scan time and the low spatial resolution. For the above two problems, we’ll improve CSI technique on the pulse sequence and post-processing in the future.

Keywords: molecular imaging, chemical shift imaging, glioblastoma multiforme, metabolites

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LIST OF FIGURES

圖 2-1 外加磁場下所產生之能階分裂圖………5

圖 2-2T2 衰減之相位是意圖…..………6

圖 2-3T1 與 T2 訊號曲線………6

圖 2-4 自旋迴音之脈衝序列..………7

圖 2-5 頻率位置對應圖………..………8

圖 2-6 自旋迴音影像之脈衝序..………9

圖 2-7 自旋迴音影像之 K space 填法………..9

圖 2-8 快速聚焦回音取像之脈衝序列圖………10

圖 2-9 正常大鼠自旋迴音影像………10

圖 2-10 CHESS 波序圖與其原理………13

圖 2-11 VAPOR 波序圖………..……….………14

圖 2-12 PRESS 波序圖……..………..…………16

圖 2-13 活體大鼠鼠腦之頻譜.……….………17

圖 2-14Spin-echo CSI 之波序圖……….……….………20

圖 2-15Spin-echo CSI 之 K space 填法………21

圖 2-16 神經膠母細胞瘤之 MRI 影像………22

圖 3-1 假體結構及代謝物樣品分布………..25

圖 3-2 MRS 實驗流程……..………..26

圖 3-3 以立體定位儀注射 C6 癌細胞至大鼠紋狀體..………..………29

圖 4-1 假體代謝物樣品 VOI………..………..35

圖 4-2 假體代謝物樣品 PRESS 結果…..………35

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圖 4-3 代謝物假體結構影像………...………...36

圖 4-4 代謝物 CSI 頻譜結果………..………..36

圖 4-5 代謝物 CSI 影像結果………..………..38

圖 4-6 神經膠質瘤模型鼠腦 PRESS 頻譜結果………...…………39

圖 4-7 正常鼠腦 CSI 頻譜矩陣..……….…………..40

圖 4-8 正常鼠腦 CSI 頻譜結果...………..41

圖 4-9 正常鼠腦 CSI 代謝物影像…..……….………..41

圖 4-10 神經膠質瘤模型鼠腦 PRESS 頻譜結果……..………42

圖 4-11 神經膠質瘤模型鼠腦 CSI 頻譜矩陣..……….43

圖 4-12 神經膠質瘤模型鼠腦 CSI 頻譜結果...……….……….…..43

圖 4-13 神經膠質瘤模型鼠腦 CSI 代謝物影像…..………...44

圖 5-1 勻場不佳之 FID………..……..………..46

圖 5-2 勻場較佳之 FID………..………..………..46

圖 5-3LC Model 之分析介面..………...………..………..51

圖5-4 加入 VAPOR 之 MGE 脈衝序列………..………..56

圖 5-5 MGE 之 K space 填法…….………..………..57

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LIST OF TABLES

表 4-1 假體代謝物樣品 PRESS 結果之訊噪比及水寬..……….………36

表 4-2 假體代謝物樣品 CSI 結果之訊噪比………38

表 4-3 正常大鼠鼠腦 PRESS 頻譜之訊噪比、X/Cr.………...…………40

表 4-4 正常大鼠鼠腦左右紋狀體 CSI 頻譜之訊噪比、X/Cr……….………..41

表 4-5 神經膠質瘤模型鼠腦左右紋狀體 PRESS 頻譜之定量分析………….……..42

表 4-6 神經膠質瘤模型鼠腦左右紋狀體 CSI 頻譜之訊噪比、X/Cr……….……..45

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LIST OF ABBREVIATION

Adenosine DiPhosphate，ADP Adenosine TriPhosphate，ATP Blood Brain Barrier，BBB Chemical Shift Imaging，CSI

CHEmical Shift Selective water suppression，CHESS Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR

Fast Automatic Shimming Tech by MAP，FASTMAP Frequency Encoding，FE

Full Width at Half Maximum，FWHM GlioBlastoma Multiforme，GBM Magnetic Resonance Image， MRI Ｍain magnetic field，B0

Multi gradient echo, MGE

Multi-Voxel Magnetic Resonance Spectroscopy，MV-MRS Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMRS

Outer Volume Suppression，OVS Phase Encoding，PE

PhosphoCholine，PCho PhosphoCreatine，PCr

Point RESolved Spectroscopy，PRESS Positron Emission Tomography，PET

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Radiofrequency pulse，RF pulse，B1

Rapid Acquisition with Refocused Echoes，RARE

Signal to Noise Ratio，SNR

Single-Voxel Magnetic Resonance Spectroscopy，SV-MRS，MRS TetraMethylSilane，TMS

VAriable pulse Power and Optimized Relaxation delays，VAPOR Voxel Of Interest，VOI

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Chapter 1 緒論

現今醫療技術的發展一日千里，在如此進步的技術下，也使醫學走向個人化醫療的方向，個人化醫療需要具有特異性診斷，也就是達到專一性辨別的能力，

分子影像提供針對具有特定性質之分子、代謝物、組織等取像以及定性、定量之能力，因此在個人化醫療扮演了重要的角色。

分子影像所常用的掃瞄機器(Modality)有核磁共振影像(Magnetic Resonance Imaging ， MRI) 、光學影像 (Optic imaging) 、正子斷層造影 (Positron Emission Tomography，PET)等。其中，MRI 是最為安全且空間解析度最好的非侵入式影像技術。

MRI 除了提供高解析度解剖影像，更可以提供具有生理性訊息的影像資訊，

例如擴散權重影像(Diffusion weighted imaging)、化學位移影像(Chemical Shift Imaging，CSI)，其中化學位移影像提供具有空間分佈性的頻譜訊息，可取得不同分佈位置之頻譜，提供代謝物在不同組織位置之訊息。

國內每年有超過將近一千人死於腦癌，其中將近五成死於神經膠母細胞瘤 (Glioblastoma)，而神經膠母細胞瘤又是腦癌中高度惡性的腫瘤[1]，是目前腦癌之中癒後最不樂觀的一種，其復發後的存活率更甚為低，所以治療計劃本身是非常重要的。其治療計畫主要參考腫瘤生長位置、生理特性與狀態以及腫瘤細胞的代謝狀況來制訂。

而現今腫瘤的位置與型態主要以電腦斷層輔以對比劑來確認，但是電腦斷層本身提供的影像是以電子密度為主，對比劑的顯影方式也是透過提高電子密度來產生對比[2]，影像的訊息基本上是沒有包含生理性的訊息存在，組織的特性目前

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還是透過活體組織切片檢查(Biopsy)以侵入式的方法來檢查，但對大腦做活體組織切片檢查是非常高風險的一項手術，開腦本身已有很高的風險，而繞過正常組織及血管獲取腫瘤組織更提高整體的風險，所以實際臨床上在最初的治療計畫是鮮少併入生理與組織特性的訊息。

正子斷層掃描雖提供直接的代謝訊息，但其是以代謝率為主要訊息，此外正子斷層掃描每次掃描皆需要注射對比劑產生訊號，惟其對比劑本身具有高輻射劑量，且掃描時間冗長及低空間解析度[3]，以及對比劑製程繁雜及價錢昂貴。

1.1 研究動機

代謝物在大腦不同神經化學解剖構造的分佈，是診斷諸多大腦疾病的重要訊息，CSI 在此所扮演的角色，就是同時取得大腦不同區域位置各代謝物之化學位移的訊息，藉以推得各代謝物的分布與大小的訊息，接著進一步對代謝物做定性定量之分析。

諸多大腦疾病中，多形性神經膠母細胞瘤(GlioBlastoma Multiforme，GBM)在腦癌中為侵襲性高以及成長快速之癌細胞，也因此是高度惡性的腦癌。GBM 的治療計畫與療效評估與其癌細胞的生理特性、機制以及狀態有緊密的關係。

CSI 以非侵入式的方法提供不同代謝物濃度高低之訊息，此訊息可用以反應組織本身之生理特性與狀態，可以改善依以往臨床上缺乏代謝物組成與分布的關鍵訊息，更可以使早期的治療計畫更為精確及有效，使患者的癒後改善和提高其術後存活率。因此，本研究為建立CSI 方法並用以觀察及比較 GBM 疾病模型在大鼠腦上正常側與腫瘤側生理特性與代謝物分佈之差異。

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1.2 研究目的

本論文之研究目的為建立化學位移影像之實驗標準化流程，藉以建立一個穩定及重複性高的實驗流程與分析方法，並且利用建立起來的化學位移影像技術來觀察及比較GBM 疾病模型所造成的代謝物變化。

首先以假體實驗驗證其磁共振頻譜以其化學位移影像之結果，接著掃描正常活體大鼠確定代謝物之分布，再以C6 神經膠質瘤(C6 glioma)作為實驗之 GBM 疾病模型，將C6 腫瘤細胞注入大鼠腦內之紋狀體(Striatum)，觀察代謝物在大腦正常側與腫瘤側之分佈差異以及偵測腫瘤生理特性與狀態比較正常對側腦區之變化，

包括觀測腫瘤造成正常神經元死亡以及腫瘤核心區域血液供應不足產生無氧代謝物的狀態。

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1.3 論文架構

本論文一共分為五個章節。

第一章為緒論，包含分子影像和腦癌的簡介以及現在臨床的趨勢，然後從中指出CSI 能提供的優勢，以此為研究動機，並且闡明本論文之目的。

第二章為背景與文獻回顧，主要以MRI 的基本原理，並分別介紹磁共振影像、

磁共振頻譜以及化學位移影像之成像原理，接著是人類的神經膠質瘤的簡介，以及其在大鼠上對應的疾病模型介紹。

第三章為方法與材料，首先會介紹使用的MRI 硬體設備，然後是假體實驗之流程、參數與內容，以及C6 神經膠質瘤模型之準備，再來是活體大鼠的實驗之流程、參數與內容，最後是資料分析的方法。

第四章為實驗結果，其中包含假體、正常大鼠及疾病模型之影像及頻譜的結果。

第五章為結果討論與未來展望，討論將針對實驗的硬體效能、掃描參數、假體結果、疾病模型結果、掃描參數之極限做討論，最後對此研究做結論，並以討論之結果探討未來改進方法與發展方向。

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Chapter 2 背景與文獻回顧

2.1 原理

人體組成大約有百分之七十為水，水分子本身帶有兩個質子，而且此質子可在MRI 之儀器產生訊號，因此在臨床上及研究上常以質子為共振核種，在本論文研究實驗中即以質子為核種。當質子進入MRI 中的高磁場環境(1T=10000Gauss，

0.5Gauss 為地球磁場，研究用動物磁共振儀器從 4.7~11T 都有)中，其物理特性如同一根小磁鐵棒，其排列方向會順著外加的高磁場方向，並且每個質子會以特定頻率做旋進(Precession)之動作，也因此又將此質子稱為自旋(Spin)，根據拉莫方程式(Larmor equation)

γ (2.1) 為旋進頻率，為拉莫常數，為外加磁場，旋進頻率與外加磁場成正比關係。

根據Zeeman Effect，在一個外加磁場下，又稱為主磁場(Main magnetic field，B0)，

spin 會產生能階分裂，磁場越高則能階差越大(圖 2-1)，而高低能階兩群組之個數差也會隨之變大，因此在接收激發能量後所能產生的訊號群也因此提高，這也是目前研究用MRI 會傾向用高磁場的規格之原因。

圖 2-1 外加磁場下所產生之能階分裂圖[4]

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MRI 之訊號來源主要由一群 spin 所產生之淨磁向量合(Net magnetization)貢獻，

而我們可以用古典物理的模型來解釋訊號在激發前後的變化。九十度脈衝會將順著主磁場的淨磁向量倒向與主磁場垂直之平面，此時由於Spin-spin relaxation 使得 spin 間的失相(Dephase)，淨磁向量合降低而訊號降低，此訊號降低稱 T2 衰減(T2 decay)。T2 衰減公式為

S t

(2.2)

S為隨t時間而衰減的訊號，為原始訊號大小，訊號衰減為自然對數指數衰減。

圖 2-2 由左至右依序為激發前、九十度脈衝激發後、經一段時間後之失相而隨著時間淨磁向量在與主磁場平行之分量則會隨時間回復原來大小，稱為 T1 回復(T1 recovery)，T1 回復公式為

S t 1

(2.3) S為隨t時間而回復的訊號，為原始訊號大小，訊號回復為自然對數指數衰減。

兩者的時間變化曲線皆為自然對數之衰減與回復曲線(圖 2-3)。

圖 2-3 左為 T1 回復曲線(T1=1000 ms)，右為 T2 衰減曲線(T2=50 ms)

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收取訊號時主要有兩個時間參數，重複時間(Repetition time，TR)、迴音時間 (Echo time，TE)，TR 為發射激發脈衝後與下一次發射脈衝的時間間隔，TE 為發射激發脈衝後與開始收取訊號的時間間隔，激發後所收取之訊號為自由誘發衰減 (Free induction decay，FID)，若有一百八十度脈衝參與其中扮演聚焦之角色，則收取之訊號為回音(Echo)，此方法則為自旋回音(Spin echo)(圖 2-4)。

圖 2-4 自旋回音，紅框為重複時間，藍框為脈衝，紫框中心為迴音時間

2.1.1 磁共振影像

MRI 之成像原理可分為激發(Excitation)、共振(Resonance)、空間編碼(Spatial encoding)、取像(Acquisition)、訊號後處理(Post-processing)五步驟。其中，我們假設MRI 的主磁場之空間分布均勻，射頻脈衝之磁場均勻，梯度磁場具有良好之線性度。

以自旋回音為例激發之目的為將特定頻率之 spin 使其產生共振吸收所激發之能量。根據布拉格方程式(Bloch equation)利用射頻脈衝(Radiofrequency pulse，RF pulse，B1)以 spin 旋進頻率之電磁波激發，使得 spin 可以有效地吸收所激發電磁波之磁場能量，而此一現象稱之為共振(Resonance)，此特性可用以激發特定之截面位置，降低來自其他區域產生訊號干擾。

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實際上作法為外加一個線性的梯度磁場，使空間中磁場產生一個連續線性之磁場分布，此線性分布會使空間中的 spin 具有不同之頻率，故可用特定中心頻率及頻寬之射頻脈衝來激發所感興趣的截面( 圖 2-5) ，而單體素磁振頻譜 (Single-voxel MR spectroscopy，SV-MRS，以下以 MRS 簡稱之) 即利用此方法來激發感興趣之體素(Voxel Of Interest，VOI)。

圖 2-5 頻率位置對應圖，黑色虛線頻寬 400 赫茲，對應厚度為 2 公分

其中激發脈衝包含九十度激發脈衝以及一百八十度聚焦脈衝。在九十度脈衝激發後，spin 之相位會隨時間散開，使磁向量分散而訊號降低，一百八十度脈衝則將散開的相位再次聚焦使訊號回升，此脈衝編排為自旋迴音(Spin echo)。

空間編碼顧名思義是將空間中的訊息分佈編碼，使之在收取訊號後可以分析訊號在空間中的分佈，經由空間編碼所收到的訊號維影像在頻率域(Frequency domain)的訊號，此值域又稱為 K 空間(K space)。空間編碼分為相位編碼(Phase Encoding，PE)與頻率編碼(Frequency Encoding，FE)，兩者原理都是利用外加梯度磁場在一定時間內所累積的相位在K space 中做編碼，差異在於 PE 是在收訊前預先累積相位，FE 則是一邊收取訊號一邊累積相位。兩者在 K space 上主要是影響填寫訊號的位置，所以填K space 的軌跡(Trajectory)可以經由編碼梯度的開啟與關

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閉來設計。FE 由於是同時編碼及收訊，所以為了使訊號中心在 K space 中心，必須先開啟一個聚焦梯度(Refocusing gradient)預先累積相位，使其收訊號時能使相位聚焦在K space 中央，但其效果不同於聚焦脈衝，聚焦脈衝會將所有造成相位累積的效應都聚焦，聚焦梯度只聚焦外加梯度所造成的相位。收取訊號之TE 設定在 spin 相位聚焦之位置，ADC 開啟收訊之時間中心點為 TE(圖 2-6)。實際上空間編碼梯度磁場開啟時會影響訊號填進K space 的位置(圖 2-7)，故空間編碼又可視為填 K 空間軌跡的一種設計，脈衝序列根據不同目的以及填K space 的方法會有不同的設計，進而產生不同的收訊效率與訊號特性。

圖 2-6 自旋迴音影像之脈衝序

圖 2-7 自旋迴音影像之 K space 填法

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實際上自旋回音影像常會使用一連串的一百八十度脈衝來回聚焦訊號(圖 2-8)，提高收訊的效率，此掃描序列又稱快速聚焦回音取像(Rapid Acquisition with

Refocused Echoes，RARE)，其使用的聚焦面衝列的長度為加速的倍數，此加速因子又稱 RARE factor。

圖 2-8 快速聚焦回音取像之脈衝序列圖，RARE factor 為 3

在取像完後，所取得訊號為頻率域，故在後處理需要將此訊號做傅立葉轉換 (Fourier Transform，FT)，將 K space 轉換成空間域之影像，到此，MRI 即可提供簡單的二維影像。

圖 2-9 正常大鼠自旋迴音影像(TR/TE=4000/70ms, NEX=4) 掃描時間公式為

y NEX (2.4)

Nx、Ny、Nz 為在 x、y、z 上之 PE steps，NEX 為激發次數(Number of excitation)。

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2.1.2 磁共振頻譜

傳統核磁共振頻譜(Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMRS)雖提供高頻譜解析度及高訊號之頻譜，但此項檢查為侵入式破壞性檢查，而磁共振頻譜 (Magnetic Resonance Spectroscopy，MRS)提供非侵入式且可定位之能力，雖然頻譜解析度與訊號較 NMRS 低，依然在臨床研究上具重要地位，因為 MRS 提供我們一個非侵入式探取方代謝物組成及含量的方法，得以長期觀測活體代謝物的變化，

藉此評估生理變化、病理進程及治療效果。

化學位移(Chemical shift)是指 spin 受到分子鍵結的電子雲影響，使旋進頻率有所改變。旋進頻率與spin 所感受到的磁場成正比，而分子鍵結的電子雲，會對 spin 所感受到的外加磁場產生改變，進而使旋進頻率改變，而電子雲通常會遮蔽或增加部分外加磁場，此一效應為遮蔽效應(Shielding effect)，由於此頻率偏移來源，

是從 spin 所鍵結分子上的化學結構而影響，故稱為化學位移，而一般分子結構通常是穩定的，故電子雲的遮蔽效應也會固定，所以在不同外加磁場的情況下，各分子之化學位移的相對位置都會一樣。

MRS 從訊號本身是否具有空間解析度上可分為單體素磁共振頻譜及多體素磁共振頻譜(Multi-Voxel MRS，MV-MRS)，其中 MV-MRS 亦即所謂的 CSI。

在進行MRS 實驗前，勻場(Shimming)的工作是必須且重要的，由於代謝物的訊號將近水的一萬分之一倍，所以實驗環境對於訊號的影響會更為明顯且劇烈，

而局部磁場不均勻(Local field inhomogeneity)會使得欲觀察 VOI 內的 spin 感受到不同大小的磁場，進而讓在同一個VOI 內的 spin 各自累積不同的相位而造成 dephase，

使訊號衰減速度比原本的T2 衰減更快，考慮進場不均勻的衰減稱為 T2*衰減(T2*

decay)。為了降低 T2*衰減造成的訊號散失，必須外加一個穩定的磁場，藉以補償

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原本不均勻的磁場，使VOI 內的每一個 spin 都感受到相同的磁場大小。而此勻場效果亦會影響訊號在頻譜上峰形(peak)的半高全寬(Full Width at Half Maximum，

FWHM)，勻場效果越好，peak 的半高全寬就會越窄，T2*衰減速度越慢，半高全寬與T2*的關係式為

FWHM (2.5)

當勻場效果使得磁場均勻度接近理想狀態時，T2*會趨近於 T2，訊號衰減將不受場不均勻影響。

MRS 之取像原理與 MRI 相似，分為準備、激發、收訊、後處理，MRS 有許多脈衝序列，本論文採用單點解析頻譜(Point RESolved Spectroscopy，PRESS)。其中，我們假設MRI 的主磁場之空間分布均勻，射頻脈衝之磁場均勻，梯度磁場具有良好之線性度。

在準備的步驟中包含抑制水訊號以及抑制VOI 以外之訊號，由於 MRS 在活體中主要訊號以欲觀察之代謝物為主，一般大腦代謝物之濃度為 1~20mM，訊號大小與水大約差一萬倍，因此水訊號常造成基線(baseline distortion)扭曲，而激發脈衝波形在實際上輸出是無法達到理想的方波，在空間選擇激發時，頻帶選擇的邊界會發生脈衝滲漏(RF leakage)，使在選擇的空間範圍外也會產生訊號，以一百八十度脈衝作為聚焦時此現象會使角度激發不準，進而聚焦失敗，讓訊號本身夾帶其他複雜的訊息，故在準備步驟中需要將水訊號以及脈衝滲漏產生之訊號抑制。

抑制VOI 以外之訊號則是利用體積外抑制(Outer Volume Suppression，OVS)，抑制水訊號之方法有化學位移選擇性水抑制(CHEmical Shift Selective water suppression，

CHESS) 以及從 CHESS 改進的多變脈衝能量最佳化遲豫延遲(VAriable pulse Power and Optimized Relaxation delays，VAPOR)。

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OVS 是開啟低度磁場激發特定中心頻率及頻寬，亦即激發欲抑制訊號的位置，

接著開啟梯度磁場使其磁向量dephase，進一步使被抑制的地方在激發時無法產生訊號，一般 OVS 會用六個截面去圍立方體形的 VOI，目前的一般常用之 OVS 所需要花費的時間大約為50 ms。

CHESS 是利用水在頻譜上所佔有的中心頻率及頻寬，針對特定頻帶以九十度脈衝激發，接著開啟梯度磁場使其磁向量dephase，使水在被激發時無法產生訊號，

如此一來即可抑制水訊號之產生又可以使其他代謝物仍然能產生訊號，一般 CHESS 為重複上述流程三次來達成有效的抑制水訊號，亦即使用三組脈衝(圖 2-10)，目前常用的 CHESS 之頻寬為 150 Hz，所需時間大約為 35 ms。

圖 2-10 CHESS 波序圖與其原理，a 為 CHESS 波序圖，b.是理想的頻帶選擇，頻寬150Hz，c.由左至右為激發前、脈衝激發後及以梯度磁場使水訊號 dephase

(28)

CHESS 的一般做法為重複三次循環，而每次 CHESS 抑制後的水，由於 T1 回復使得遲豫性（Relaxivity）會改變，進而使訊號抑制不完全，而由於水與代謝物的訊號相差一萬倍，抑制稍有不完全很容易造成殘餘水訊號，使代謝物訊號被水訊號所覆蓋，故VAPOR 將 CHESS 再加入不同能量之脈衝，利用其 T1 回復的特性增加其抑制效率。

在過去發展VAPOR 的文獻中[5]，從圖 2-10 可以看出在不同的脈衝大小下，

最後均達到非常好的水訊號抑制，故CHESS 與 VAPOR 兩者之抑制效率及均勻度以VAPOR 較佳，但是所需之時間(影響到最小 TR 長度)較 CHESS 長兩到三倍以上。

在本實驗中加入一百八十度脈衝，將淨磁向量翻轉到與主磁場之反方向，利用其在T1 recovery 過程中，回復到該方向之向量為零的時間點做激發，而不同於 CHESS，

VAPOR 交叉使用四組九十度脈衝級三組一百八十度脈衝，並且以一百八十度脈衝為最後一組。

圖 2-11 VAPOR 波序圖，利用不同能量大小之脈衝與與遲豫時間延遲，降低水抑制對於激發場不均勻性的敏感度，圖中共使用七組脈衝，每一個脈衝之後均有開

啟梯度磁場以dephase 水訊號[5]

(29)

在VAOPR 的參數中，最後一組一百八十度脈衝距離激發脈衝的延遲時間(time delay)是影響抑制效率的一個關鍵參數，由於 VAPOR 是利用 T1 反轉回復來提升抑制效率，所以最後一個time delay 的設定與預估之欲抑制水訊號的 T1 大小有關，

故此參數在使用VAPOR 前必需校正至最佳化。

目前VAPOR 常用之脈衝頻寬為 150 Hz，所需時間大約為 650 ms，由此可以發現VAPOR 比 CHESS 所需的時間長約 18 倍，更甚耗時，因此在縮短 TR 時會受到其時間所限制，但是實際上代謝物的訊號都很小，會藉由拉長TR 來達到足夠的 T1 回復，在 4.7T 的主磁場下會大約將 TR 拉長至 2500 ms，所以目前常用的水抑制因為TR 的拉長而有足夠的空餘時間，還是會採用 VAPOR 來達到最佳的抑制效果。

PRESS 為針對特定 voxel 之區域激發以收取頻譜的訊號，所以在激發時利用 voxel selection 的方法進行空間選擇，因此不需要額外的空間編碼。PRESS 激發時採用三個連續之脈衝(九十度-一百八十度-一百八十度)，激發的同時會開啟梯度磁場做為截面選擇，利用三個互相垂直之截面(圖 2-11)，只有截面間中央交集的 voxel 最後會被聚焦，其餘沒有被聚焦的區域，會因為開啟梯度磁場的關係而 dephase，

因此而不產生訊號。

(30)

圖 2-12 PRESS 波序圖，利用脈衝與梯度磁場產生之頻率選擇切面，以三個切面共同交集選擇欲觀察之voxel[6]

在收訊過程中，經激發特定voxel 後，會在 spin 聚焦時收取訊號，此時將不會開啟任何梯度磁場，藉以收取化學位移在頻譜的資訊，收取完訊號必須將收取之 FID 作後處理，將 FID 做離散時間傅立葉轉換(Discrete-time Fourier transform)為頻譜，此時的頻譜由於梯度磁場開關不完美所造成的渦電流(Eddy current)，會使訊號累積額外的相位讓頻譜扭曲，故須針對此做相位校正(Phase correction)，此外頻譜亦會受到殘存水訊號的因素，故需要針對此做基線校正(Baseline correction)，將水訊號造成的增益降低。

(31)

在本論文中欲透過頻譜觀察之代謝物包含NAA、Cr、Cho、Lac、Gly(圖 2-13)。

而一般在化學位移的頻譜上，坐標軸會以百萬分之一(ppm)為橫軸，藉以表示化學位移的相對位置。其坐標軸ppm 的計算方法為

δ (2.6) δ是化學位移，ω 是 spin 本身的旋進頻率，是標準化分子四甲基矽烷 (TetraMethylSilane，TMS)的旋進頻率，是主磁場的共振頻率。TMS 是目前 NMR 通用的共振頻率校正標準樣品，其中校正的核種包含、、，而 TMS 在三個核種的頻譜上，均呈現單一的peak，TMS 上的均不會互相干擾，並且可以忽略鍵結上電子雲的遮蔽效應，因此TMS 的化學位移會被當作零點，而純水的化學位移是位於4.7 ppm，本文的代謝物化學位移，均以 TMS 為 0 ppm，並將水設定在4.7 ppm。

圖 2-13 活體大鼠鼠腦之頻譜[5]

(32)

本論文所觀察之五種代謝物分別代表不同的生理意義，NAA 在頻譜上位置為 2.02ppm ，由粒線體 (Mitochondria) 製造並被運輸至神經元之細胞質 (Neuronal cytoplasm) 內，為代表神經元密度(Neuronal density)及神經元存活率(Neuronal viability)；Cr 在 MRS 頻譜 3.05ppm 位置的訊號包含肌酐酸以及磷酸肌酐酸 (PhosphoCreatine，PCr)，PCr 轉換成 Cr 時會將磷酸根提供給雙磷酸腺苷(Adenosine DiPhosphate，ADP)轉換為三磷酸腺苷(Adenosine TriPhosphate，ATP)，故被認為是能量代謝的指標；Cho 在頻譜上位置為 3.22ppm，Cho 的訊號來源主要為 Cho 及磷酸膽鹼(PhosphoCholine，PCho)，亦即細胞膜之前驅物，故為細胞膜之密度與完整度的指標；Lac 在頻譜上位置為 1.33 ppm，當細胞進行無氧呼吸時便會產生 Lac，

因此Lac 被認為是有氧或無氧呼吸的指標，而 Lac 有 J-modulation 影響其訊號，為觀察到Lac 所以在 TE 選擇上會選擇 J-modulation(7 Hz in Lac)產生 echo 之時間點 136 ms；Gly 在頻譜上位置為 3.5ppm，是一種抑制性神經傳導物質(inhibitory neurotransmitter)，在 C6 腫瘤後期會出現，但在腫瘤生長機制所扮演的角色未明。

[5][7][8]

(33)

2.1.3 化學位移影像

在本實驗中之CSI 為三維 CSI(3D CSI)，包含兩個空間維度以及一個頻譜維度，

亦即指激發單一截面，並在兩維空間維度上以相位編碼將空間訊息紀錄，在訊號收取時則如同MRS 不開起梯度磁場，避免空間訊息疊加，以收取頻譜維度之訊號。

勻場在 CSI 所扮演的角色比 MRS 更為重要，影響除了訊號的衰減外，由於 CSI 所取像的範圍比 MRS 大很多倍，也因此在空間解析時，場不均勻所造成梯度磁場非線性會使頻譜的訊息有重疊(Overlap)的問題，重疊問題會使鄰近位置的頻譜互相干擾，使得代謝物訊號在空間上的解析度降低，而非線性問題也會使OVS 的空間定位準確度降低，此外場不均勻亦會使VAPOR 在抑制水時頻帶偏移，使抑制效率降低，故勻場在CSI 的地位更為重要。

CSI 之成像原理可分為準備、激發、共振、空間編碼、取像、訊號後處理六步驟，成像之步驟與MRI 相仿。

在收取頻譜時，CSI 與 MRS 一樣會有水訊號過大造成基線扭曲的問題，故需要在準備步驟以CHESS 或 VAPOR 抑制水訊號，在本 CSI 實驗中會採用 VAPOR 以獲得更均勻及更有效的水抑制，並且合併 OVS 來降低外界所會造的訊號干擾，

所以在準備步驟中如同MRS，需要以 VAPOR 及 OVS 來抑制非必要的訊號干擾。

(34)

將 CSI 與自旋回音影像的脈衝波需圖比較(圖 2-13)，可以發現 CSI 激發與共振之步驟與自旋回音影像原理相同，而為獲得頻譜維度資訊，空間編碼皆採用相位編碼，以避免空間訊息與頻譜的訊息互相疊加，故在訊號收取時則如同MRS 不開起梯度磁場，以收取頻譜維度之訊號，TE 時間點定義在 spin 聚焦的時間點上並同時收取訊號，將收取之 FID 做三維離散時間傅立葉轉換，以得到不同空間分佈位置之頻譜。

圖 2-14Spin-echo CSI 之波序圖

在此亦可發現化學位移影像與自旋回音影像在空間編碼上，化學位移影像以相位編碼取代頻率編碼，所以在填K space 時(圖 2-14)，由於需要多收頻譜維度的資訊，化學位移影像的效率會比自旋回音影像的效率差一個空間維度，這樣會使化學位移影像的掃描時間，比自旋回音影像多花一個維度的時間做相位編碼，使掃描時間劇增。

(35)

圖 2-15Spin-echo CSI 之 K space 填法

CSI 的後處理又較 MRS 更為繁雜，由於大範圍的掃描關係，CSI 中的頻譜最常出現的問題幾乎都集中在邊界、介面以及結構複雜的位置，這些位置場不均勻的程度是更甚嚴重的，故其訊號衰減速度又較組織均勻的地方快很多，此外在頻譜上peak 的半高全寬也會因此變大，使得頻譜解析度降低，代謝物分離也將更困難，所以常會在K space 上使用一個濾波器(Filter)藉以提高訊噪比(Signal to Noise Ratio，SNR)。

傅立葉轉換後的頻譜，經相位校正及基線校正後，針對不同代謝物各自分布的化學位移，在頻譜上做積分，即可得到代謝物影像。

(36)

2.2 疾病模型

現今國內每年有超過將近一千人死於腦癌，其中大約五成死因為神經膠母細胞瘤(Glioblastoma)，而神經膠母細胞瘤是腦癌之中的高度惡性的腫瘤[1]，是目前腦癌之中癒後最不樂觀的一種，其復發後的存活率更甚為低。

圖 2-16 神經膠母細胞瘤之 MRI 影像[9]

多形性神經膠母質瘤(GBM)為一種常見且侵略性高之腦癌，由於其高浸潤性 (Infiltration)，從圖 2-14 的 MRI 影像可以觀察到腫瘤生長在右側大腦，腫瘤周圍訊號較正常組織低，並且邊界不甚明顯。腫瘤組織與正常腦組織之邊界常不易辨識，使得手術摘除不易，更造成腫瘤組織移除不完全以至於高復發率，故其癒後以及存活率常因為腦組織摘除過度或是殘留癌細胞再度復發，因而不盡理想，即使採用積極型治療其平均存活壽命僅十四個月[7]。GBM 會產生之癥狀有癲癇、噁心、嘔吐、頭痛、輕微偏癱及記憶、性格與神經之衰退，其中記憶與性格衰退為顳葉與額葉遭到癌細胞破壞造成，而具體癥狀主要由腫瘤生長之區域決定。

(37)

目前治療神經膠母質瘤的療法，不論是化學治療(Chemotherapy)、放射治療 (Radiotherapy)或是合併上述兩種治療方法，療效均不佳[10]，由於神經膠母質瘤對化學治療及放射治療的抵抗性高，此兩種治療均會傷害正常腦組織，再加上腦組織本身修復能力有限，更因為有血腦障蔽(Blood Brain Barrier，BBB)使得藥物不易輸送至腦內，因此大多的治療方向主要以姑息療法以及減輕病狀為主。

2.2.1 C6 神經膠質瘤動物模型

目前C6 神經膠質瘤是常被用來研究神經膠質瘤之血管新生(angiogenesis)、細胞侵襲機制及設計和評估治療方法。

其在 Spraque-Dawley 大鼠生長型態具有包膜(Encapsulated)，生長模式較類似於腦轉移腫瘤快速且惡性， C6 神經膠質瘤容易向血管豐富的區域生長，這也表示其對於血管之高度親和力[11]。

快速生長、惡性度高以及容易植入使得C6 神經膠質瘤適合用在本論文中的實驗，而此疾病模型亦是接近於常見於人腦的神經膠質瘤，目前一般相信其表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的過度表現，由腫瘤幹細胞所刺激而因起，而此腫瘤幹細胞對一般化學治療及放射治療抗性高，使得神經膠質瘤對傳統的治療反應不佳。

(38)

Chapter 3 方法與材料

3.1 硬體設備

實驗所使用之儀器為Bruker Biospec 47/40 animal MRI 以及 Bruker PharmaScan 70/16 animal MRI (Bruker BioSpin，Ettlingen，Germany)。

47/40 animal MRI 主磁場為 4.7T，共振頻率約為 200MHz，掃描通道管徑為 40 公分，勻場線圈頻道十五組，共包含三組一次項 (X、Y、Z)、五組二次項 (Z²、 X²-Y²、XY、XZ、YZ) 、七組三次項 (Z³、X³、Y³、XZ²、ZXY、YZ²、Z(X²-Y²))。

70/16 animal MRI 主磁場為 7.0T，共振頻率約為 300MHz，掃描通道管徑為 16 公分，勻場線圈頻道八組，共包含三組一次項 (X、Y、Z)、五組二次項 (Z²、X²-Y²、 XY、XZ、YZ)。

兩者所用激發線圈為鳥籠體線圈(Birdcage volume coil)以達到均勻地激發磁場，

而接收線圈皆使用四相位表面線圈(Quadrature surface coil)以提高訊噪比，但使用表面線圈接收訊號，會有訊號隨掃描深度增加而衰減的現象，而表面線圈的半徑為兩公分，鼠腦底部的深度約為一公分，訊號上足並且衰減程度不明顯，因為經校正後的訊號，雜訊會隨深度增加而放大，故此一衰減問題將不作校正。

勻場線圈頻道基本上越多越能夠將磁場補償至理想的均勻場，但是其補償效果由勻場線圈組的半徑、功率輸出及穩定度所決定，4.7T 與 7.0T 的 MRI 勻場線圈組的功率輸出及穩定度皆相近，雖然4.7T 的勻場線圈組半徑約為 7.0T 之 2.5 倍，

但是4.7T 的頻道較 7.0T 多了將近一倍，所以根據水訊號勻場後的半高全寬，在實際的掃描上4.7T 的勻場效果還是優於 7.0T，也因此在 4.7T 上做 CSI 實驗。

(39)

操作軟體ParaVision3.0 及 ParaVision4.0 (Bruker BioSpin，Ettlingen，Germany)，

MRS 實驗在 ParaVision3.0 下操作，CSI 在 ParaVision4.0 下操作。

3.2 假體實驗

假體實驗包含MRS 以及 CSI 兩部分，主要目的為對照兩者之間的結果以驗證一致性，並且觀察樣品代謝物之分離效果與分布是否與實際假體情形相符。

假體製做是先泡製重量濃度百分之五洋菜膠(Agarose)，接著將各裝有 NAA、

Cr、Lac 樣品管埋入洋菜膠中，樣品濃度均為 50mM(圖 3-1)，各標準樣品皆以磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffer saline buffer，PBS buffer)泡製，緩衝液之酸鹼值為 7.2。

圖 3-1 假體結構及代謝物樣品分佈

NAA

50 mM

Cr 50 mM

Lac 50 mM Agarose

5 %

(40)

3.2.1 磁共振頻譜實驗

在磁共振頻譜實驗所採用之脈衝序列為 PRESS，分別對各樣品管內之溶液收取頻譜訊號，接著做一維傅立葉轉換，並取其訊號之強度大小(Magnitude)以去除相位位移，如此將不必做相位校正的步驟，只需經過基線校正，最後針對個別代謝物樣品在頻譜上的訊號做訊噪比分析。

圖 3-2 MRS 實驗流程

實驗流程如(圖 3-2)，將欲掃描之區域移動到 MRI 磁場中心點，調整激發體線圈共振頻率以及阻抗匹配(Tune and match)，進行整體性勻場(Global shimming)並調整各勻場頻道直至 FID 訊號達到最大值，在頻譜上可以觀察到水訊號之半高全寬越來越窄，FID 的衰減速度越來越慢，而勻場的頻道順序為高次項至低次項，每調整完一個高次項，必須重新調整其相關的低次項，因為低次項的勻場頻道會與高

(41)

次項互相感應耦合，而實際調整例如調整完XYZ 頻道必須依次調整 XY、YZ、XZ、

X、Y、Z。接著調整激發脈衝強度以求得最大訊號強度，收取 T2 自旋回音影像作為PRESS 定位用，確認 VOI 位置後再次調整激發脈衝，此時將針對 VOI 區域做激發並且調整激發脈衝強度以求得最大訊號強度，爾後進行局部勻場(Local shimming)，局部勻場將針對 VOI 區域做激發並且調整一次項頻道直至 FID 訊號有最大值，並且使水之半高全寬(Water line width)最窄，亦即提高訊號及頻譜解析度，

勻場後將調整抑制水訊號之脈衝強度以達到抑制最佳化，最後以PRESS 收取頻譜訊號。

而在準備步驟中OVS 會穿插在 VAPOR 之中，但是 OVS 會擺在 VAPOR 的後半部，因為OVS 主要抑制的訊號群以短 T1 訊號為主，故穿插在 VAPOR 後半部減少其T1 回復所造成的訊號恢復。

收取T2 自旋回音影像之脈衝序列為 RARE，參數如下，TR 為 2500 ms，TE 為60 ms，average 為 4，RARE factor 為 8，矩陣大小(Matrix size)設定為 256 × 256，

截面厚度(Slice thickness) 設定為 2 mm，視野(Field Of View，FOV) 大小為 3 × 3 cm²。

PRESS 所使用之參數如下，TR 為 2500 ms，TE 為配合 Lac 的 J coupling 而設定為136 ms，average 為 256，因此時間將達十分鐘左右，VOI 大小 2 × 2 × 2 mm³，頻譜之頻寬(Band width，BW)為 4960.32 Hz，水抑制的方法由於操作版本(PV3.0.1) 支援的限制，故使用CHESS，其頻寬為 150 Hz。

(42)

3.2.2 化學位移影像實驗

在CSI 實驗中使用之脈衝序列為 spin echo-CSI，一次收取整體之頻譜訊號，

將收取後之訊號做三維傅立葉轉換，針對個別樣品代謝物在活體上主要訊號的化學位移範圍做積分以影像表示，並個別分析其訊噪比。

實驗流程與 MRS 相同(圖 3-2)，唯局部勻場時乃針對欲觀察之截面做激發，

其餘流程相同，最後以spin echo-CSI 收取頻譜訊號。

T2 定位影像使用 RARE 收取，參數如下，TR 為 2500 ms，TE 為 60 ms，average 為4，RARE factor 為 8，矩陣大小(Matrix size)設定為 256 × 256，截面厚度(Slice thickness) 設定為 2 mm，視野(Field Of View，FOV) 大小為 3 × 3 cm²。

spin echo-CSI 所使用之參數如下，TR 為 2500 ms，TE 為 136 ms，average 為 8，

matrix size 為 16 × 16，掃描時間長達八十分鐘，截面厚度(Slice thickness)為 2 mm，

FOV 大小為 3.2 × 3.2 cm²，頻譜頻寬(Band width，BW)為 6510.42 Hz，水抑制使用 VAPOR，其頻寬為 150 Hz。其中為針對欲觀察之 VOI，將使用六張抑制截面 (Saturation slice)把 VOI 外之訊號抑制以降低外界訊號干擾，截面與 VOI 間隔為各 VOI 方向尺寸十分之一。

(43)

3.3 C6 神經膠質瘤模型之準備

實驗使用之動物為 Spraque-Dawley 大鼠(SD rat)，性別為雄性，體重範圍為 300~400g。

C6 神經膠質瘤細胞株為生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，ATCC number: CCL-107)所提供，細胞株培養在 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DEME)培養基，使用百分之十胎牛血清(Fetal bovine serum，

FBS，Gibco, NY, USA)以及青黴素-鏈黴素(Penicillin-streptomycin，Gibco, NY, USA)，

實驗中所用到的C6 細胞均培養在單層十公分培養皿上，溫度攝氏三十七度，百分之九十五空氣及百分之五二氧化碳之混和氣，濕度百分之一百。

\ 圖 3-3 以立體定位儀注射 C6 癌細胞至大鼠紋狀體

立體定位注射(圖 3-3)首先使用水化氯醛(Chloral hydrate)腹腔注射麻醉大鼠，

以立體定位儀(Stoelting Co., IL, USA)固定大鼠頭部並沿著腦顱骨(cranial bone)中線切開一公分，注射位置為鼠腦左側紋狀體(Bregma = 0.2 mm, lateral = 3.0 mm, and depth = 5.0 mm)，注射所穿過之頭骨洞經標準鼠腦立體結構圖譜(Paxinos and

(44)

Watson 1998)確認，孔徑為 1mm，注射細胞液之體積為 0.6μL，濃度為 2x10⁶/10μL，

注射時使用針頭三十號針(Hamilton, NV, USA)以及微量注射幫浦(Model 310; KD Scientific, MA, USA)。注射完之後將針頭緩慢抽出，並以牙固粉(Dental cement)將頭骨洞口彌封。

3.4 活體大鼠實驗

實驗過程中，大鼠皆先以百分之五isoflurane 與氧氣混和之氣體麻醉，流量為 1L/min，待大鼠完全麻醉後 isoflurane 濃度則調降為百分之一到二，接著將大鼠固定於客製化大鼠固定架，並將其頭部固定完善以防止震動或移動。

活體大鼠實驗在儀器使用上，MRS 實驗為在 7T animal MRI 上執行，CSI 實驗為在4.7T animal MRI 上執行。

實驗用大鼠一共六隻，一隻為正常大鼠以及五隻在單側注射C6 腫瘤細胞大鼠，

正常大鼠僅提供鼠腦在正常狀況下之代謝物分佈，控制組與C6 神經膠質瘤組比較，

以帶有腫瘤之大鼠同一鼠腦內腫瘤側(左側)與大腦對側(右側)做比較，目的為避免不同大鼠間之先天生理特性差異以及當日實驗條件之些微差異。

大鼠之實驗流程與假體之實驗流程相同，而為求高訊噪比、頻譜解析度以及大鼠鼠腦在磁場中的變化，實驗所用之參數將有所改變。

收取T2 對位影像之脈衝序列為 RARE，參數如下，TR 為 4000 ms，TE 為 70 ms，average 為 4，RARE factor 為 8，矩陣大小(Matrix size)大小為 256 × 256，截面厚度(Slice thickness)為 1 mm，視野(Field Of View，FOV)大小為 3.2 × 3.2 cm²。

PRESS 所使用之參數如下，TR 為 3000 ms，TE 為 136 ms，average 為 256，

VOI 分別有 2 × 2 × 2、4 × 1 × 2 以及 2.5 × 2.5 × 2.5 mm³三種大小，而此三

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種大小之體積皆一致，頻譜之頻寬(Band width，BW)為 4960.32 Hz，水抑制為 CHESS。

spin echo-CSI 所使用之參數如下，TR 為 2500 ms，TE 為 136 ms，average 為 10，matrix size 為 16 × 16，掃描時間長達一百分鐘，截面厚度(Slice thickness)為 2.5 mm，FOV 之大小為 3.2 × 3.2 cm²，激發之VOI 為 16 × 16 × 2.5 mm³，頻譜頻寬(Band width，BW)為 3004.81 Hz，在此頻寬下不會有頻譜反摺(Aliasing)，又能透過降低頻寬來降低雜訊，水抑制使用VAPOR，其頻寬為 150 Hz。其中為針對欲觀察之VOI，將使用八張抑制截面(Saturation slice)把 VOI 外之訊號抑制以降低外界訊號干擾，截面與VOI 間隔為各 VOI 方向尺寸十分之一。

正常大鼠為一隻並進行MRS 以及 CSI，神經膠質瘤模型之大鼠為五隻，在腫瘤注射後三周半至四周間進行MRS 以及 CSI。

(46)

3.5 資料分析方法

PRESS 以及 spin echo-CSI 所收取訊號為 FID，故需經傅立葉轉後才可做進一步校正及處理，PRESS 之 FID 以一維傅立葉轉換之，spin echo-CSI 則以三維傅立葉轉換之。轉換後之頻譜為求移除相位之影響，皆取頻譜之訊號大小，但此一作法會降低頻譜解析度，使訊號之半高全寬提高為原本的√3倍。

3.5.1 後處理流程

PRESS 之原始 FID 將直接由 MatLab R2010a (The MathWorks Inc., Natick/MA, USA)讀取並進行一維傅立葉轉換，由於 PRESS 所收取之訊號不易產生基線扭曲，

故不校正此扭曲以避免訊號在處理過程中下降。

Spin echo-CSI 資料分析一開始會從 MRI 控制電腦取出以收取完之原始 FID，

在 windows 7 下以 3D Interactive Chemical Shift Imaging v1.9.1.0 ， 3DiCSI (Department of Radiology，Columbia University/New York，USA)讀取原始 FID，並以此平台做初步校正，讀取後經三維傅立葉轉換之頻譜需做基線校正，基線校正乃使用3DiCSI 本身所內建之 convolution difference 功能[7]，若脂肪訊號過度汙染頻譜將使用3DiCSI 內建之 lipid separation-signal space projection 功能移除脂肪訊號，

但為保留 Lac 訊號脂肪之移除將不盡完全，處理後之頻譜資料將存為 ASCII 檔案格式以供MatLab 讀取。

而spin echo-CSI 所建立之代謝物影像將由 3DiCSI 處理輸出，代謝物影像所使用之原始頻譜將在K space 之空間維度方向填零(zero filling)以提高空間解析度，矩陣大小將內差為原來之四倍，亦即將16 × 16 的矩陣內插至 64 × 64，影像產生之

(47)

方法為對頻譜上特定代謝物化學位移範圍進行手動圈選，在所有空間位置上的頻譜上對於圈選之化學位移範圍作訊號積分，最後以影像顯示之。

3.5.2 分析方法

PRESS 以及 spin echo-CSI 校正後之頻譜，將在 MatLab 上進行資料分析，包含對於欲觀察之五種代謝物個別量測訊噪比，訊噪比計算之公式為

SNR (3.1) peak height 為代謝物訊號之峰值，為背景標準差；SNR 在取頻譜訊號大小後會使標準差減為二分之一，故將以2 為雜訊以表示真實訊噪比。

而相對定量的方法，乃將五種代謝物針對其化學位移範圍做積分，以Cr 為標準化之對象，計算其餘四種代謝物相對於Cr 之比值(X/Cr)。

(48)

Chapter 4 實驗結果

4.1 結果概述

實驗結果分為假體實驗以及活體大鼠實驗兩部分。

假體實驗預期在MRS 的結果中，觀察到各 VOI 內代謝物樣品相對應之頻譜分佈，在 CSI 結果中預期觀察到各代謝物影像之分佈與假體實際分佈相符，所以在實驗流程上，CSI 之參數設定、流程步驟的順序以及詳細設定從結果看來是正確的，

故假體實驗之各項實驗設定將用至活體大鼠實驗，並做些微修改。

綜觀C6 神經膠質瘤動物模型結果，可以看到 NAA 下降所代表的正常神經元的死亡，Cr 下降所代表的代謝率下降，Cho 上升表示細胞快速的分裂、Lac 上升為無氧呼吸代謝的累績、Gly 上升代表腫瘤的高惡性度。

C6 神經膠質瘤動物模型結果乃與正常側相比較，預期在 MRS 的結果中，在訊噪比觀察到腫瘤側NAA、Cr 下降，Cho、Lac、Gly 上升，在 Cr 比值觀察到 NAA/Cr 下降，Cho/Cr、Lac/Cr、Gly/Cr 上升。

在CSI 結果中預期觀察到 NAA、Cr 代謝物影像腫瘤側比正常側訊號低，Cho、

Lac、Gly 代謝物影像腫瘤側比正常側訊號高，在 Cr 比值觀察到 NAA/Cr 下降，

Cho/Cr、Lac/Cr、Gly/Cr 上升，趨勢亦與 MRS 相同。

(49)

4.1.1 假體實驗結果

圖 4-1 代謝物樣品 VOI。(a)(b)各為 50 及 400 mM 假體結構影像與 VOI 假體實驗之 MRS 結果顯示各代謝物樣品(圖 4-1)之頻譜，與預期代謝物在頻譜上分佈位置相同，NAA-2.02ppm，Cr-3.05ppm，Lac-1.3ppm(圖 4-2)。各頻譜所量測之訊噪比紀錄在表一，背景雜訊範圍為6~8ppm，水寬在各頻譜實驗均為 3Hz。

圖 4-2 (a)(b)Cr 頻譜(3.05ppm)， (c)(d) NAA 頻譜(2.02ppm)，(e)(f) Lac 頻譜 (1.3ppm)。

(50)

從結果上看來樣品濃度確實影響到訊噪比，訊噪比上升的程度與高低濃度的比例相當，但製備400 mM Cr 實有析出現象，故訊噪比上升程度不及 NAA 及 Lac 高，而在NAA 頻譜上亦觀察到其次訊號群、Cr 樣品兩個訊號群，由於樣品濃度較一般活體高五倍，所以可在假體實驗結果中清楚被偵測到，而活體內 NAA 以 2.02ppm 為主要訊號，Cr 以 3.05 為主要訊號，其餘次訊號常因濃度低而較難偵測。

除此，Lac 因 J-modulation 產生峰分裂(Peak splitting)的現象也在頻譜上觀察到。

50 mM 400 mM NAA (2.02ppm) 23.38 248.59 Lac (1.33ppm) 9.33 142.46 Cr (3.05ppm) 17.18 88.00

表4-1 為圖 4-2 中各頻譜代謝物之訊噪比。

(51)

50mM 假體實驗之 CSI 結果顯示各代謝物樣品之頻譜，與預期代謝物在假體上分佈位置相同(圖 4-3)。

圖4-3(a)為假體影像與 CSI 頻譜矩陣相對位置圖

在各代謝物樣品位置之頻譜均與 MRS 結果相近(圖 4-4)，與圖 4-4 相對應頻譜所量測之訊噪比紀錄在表 4-2，背景雜訊範圍為 6~8ppm，該假體局部勻場之水寬為5.84Hz。

圖4-4(a)、(b)、(c)各為圖 4-3 矩陣上代謝物樣品之頻譜，(a) to b，(b) to c，(c) to d

(52)

SNR NAA (2.02ppm) 16.87

Cr (3.05ppm) 14.01 Lac (1.3ppm) 13.62

表4-2 與圖 4-4(b)、(c)、(d)頻譜相對應代謝物之訊噪比。

在CSI 頻譜矩陣重建的代謝物影像(圖 4-5)結果中，可以觀察到各代謝物與 T2 影像的結構非常吻合，並且代謝物影像的分布與樣品配置的位置相同，但是可以發現到代謝物影像在T2 結構影像上的分布，有從中間向外衰減的趨勢，在邊緣處更是明顯，而此現象乃是原始代謝物影像的解析度低，經重建及內插後在邊緣造成模糊(Blurring)的效果。

圖4-5 (a)、(b)、(c)為針對各代謝物在化學位移上訊號分佈之積分影像，依次為NAA、Cr、Lac。

而表4-3 中的各代謝物的訓噪比由小到大為 NAA、Cr、Lac，造成的原因與代謝物內能產生訊號的spin 數目有關，而由有效 spin 由小到大為 Cr、NAA、Lac，

由於Lac 有 J coupling 造成 peak 分裂(Splitting)兩部分，故訓噪比反而最小。

(53)

4.1.2 活體大鼠實驗結果正常活體大鼠

正常活體大鼠實驗之MRS 結果顯示(圖 4-6)，在不同區域腦組織的代謝物含量各有差異，NAA 在大腦皮質具有較高訊號乃由於較高神經元密度，在紋狀體及腦中隔則有許多軸突束(Axon bundle)經過使神經元比例下降故 NAA 訊號稍低；Cr 在各頻譜訊號差異並不大，僅在紋狀體區域訊號較低；Cho 在紋狀體及腦中隔為質呈現較皮質高訊號，是因為該區域經過許多軸突束，其髓鞘聚集許多細胞膜故Cho 訊號高(表 4-3)。圖 4-6 中各頻譜所量測之訊噪比及 X/Cr 紀錄在表 4-3，背景雜訊範圍為6~8ppm，所有頻譜均以 1~5ppm 中最高訊號為標準化對象。

圖4-6(b)為大鼠鼠腦與 PRESS 之 VOI 相對位置圖，(a)、(c)、(d)、(e)、(f)各相對應至(b)之 VOI。

(54)

皮質-左(a) 皮質-右(c) 紋狀體-左(d) 紋狀體-右(f) 腦中隔(e) NAA-SNR 10.27 11.09 10.70 7.62 7.76

Cr-SNR 8.03 8.43 7.76 6.90 8.22

Cho-SNR 3.73 3.90 5.50 5.63 8.21

NAA/Cr 1.26 1.24 1.18 1.03 1.04

Cho/Cr 0.46 0.48 0.82 0.75 0.74

表4-3 與圖 4-6(a)、(c)、(d)、(e)、(f)相對應代謝物之訊噪比及 X/Cr。

正常活體大鼠實驗之CSI 結果與 MRS 結果相近，NAA 代謝物影像上可以觀察到皮質區域訊號高，紋狀體部分訊號低；Cr 代謝物影像分佈較 NAA 為均勻且紋狀體部分訊號較低；Cho 代謝物影像以胼胝體中央及兩側紋狀體訊號高，此三區域皆為軸突束密集區塊，各代謝物影像之分佈與該位置之組織特性相符(圖 4-4)，並且與MRS 結果趨勢相近。

圖4-7(a)、(b)為正常大鼠鼠腦與 CSI 頻譜矩陣相對位置圖

(55)

圖 4-8(a)、(b)各圖 4-7-b 為矩陣上左、右紋狀體內頻譜

圖 4-9(a)、(b)、(c)為針對各代謝物在化學位移上訊號分佈之積分影像，依次為 NAA、

Cr、Cho

紋狀體-左(a) 紋狀體-右(b) NAA-SNR 5.73 8.97

Cr-SNR 4.15 5.76 Cho-SNR 4.21 4.17

NAA/Cr 1.13 1.01 Cho/Cr 0.94 0.83

表4-4 與圖 4-8(a)、(b)頻譜相對應代謝物之訊噪比及 X/Cr。

(56)

C6 神經膠質瘤模型大鼠

C6 神經膠質瘤大鼠實驗之 MRS 結果顯示，腫瘤植入後第二十四天在腫瘤側 NAA/Cr 略為下降，Cho/Cr、Lac/Cr、Gly/Cr 明顯上升與預期結果相符(圖 4-5 (b))，

從定量分析結果(表 4-5)看來種瘤所造成的代謝物變化以 Lac/Cr、Gly/Cr 最大，

Cho/Cr 次之，NAA/Cr 最小，而 Cho/Cr、Lac/Cr、Gly/Cr 三者在腫瘤側數值皆高於正常對側，NAA/Cr 則是在腫瘤側數值略低於正常對側。

(a) (b) (c)

圖4-10(a)為第二十四天腫瘤模型鼠腦與 PRESS 之 VOI 相對位置圖，(b)為鼠腦腫瘤內之頻譜，(c)為鼠腦腫瘤對側之頻譜。

表4-5 圖九腫瘤模型鼠腦在腫瘤側及對側之 NAA/Cr、Cho/Cr、Lac/Cr、Gly/Cr 定量分析。

0.69

1.54

0.86 0.98

0.95 0.84

0.07 0.14

‐0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5

NAA/Cr Cho/Cr Lac/Cr Gly/Cr

Tumor Contralateral

(57)

C6 神經膠質瘤大鼠實驗之 CSI 結果顯示(圖 4-11)，腫瘤植入後第二十七天在 T2 解剖影像上發現腫瘤大小已比對側紋狀體面積大，並且向外壓迫使正常腦組織結構扭曲。

在圖 4-12 的頻譜更可發現，在腫瘤測的頻譜，偵測到 Lac 以及 Gly 的訊號，

在正常對側是沒有偵測到訊號，而NAA 在腫瘤側亦是完全偵測不到訊號，Cho 的訊號在腫瘤側校正常對側高。

圖 4-11 (a)、(b)各為神經膠質瘤模型鼠腦影像與 CSI 頻譜矩陣相對位置圖

圖 4-12 (a)、(b)各圖 4-11-b 為矩陣上左、右紋狀體內頻譜

(58)

在 C6 神經膠質瘤大鼠的代謝物影像中(圖 4-13)，NAA、Cr 影像觀察到腫瘤側訊號較對側為低，分布也較為稀疏，Cho 影像觀察到腫瘤側整體訊號上升以及腫瘤外圍及周圍組織訊號比腫瘤內部更高，Lac、Gly 影像觀察到在腫瘤區域上訊號集中，並且分布以腫瘤區域為主。在正常側與腫瘤側頻譜上觀察到與MRS 相似趨勢，亦即在腫瘤側 NAA 偵測不到訊號、Cr 訊號下降、Cho 訊號上升、出現 Lac 及Gly 訊號(表 4-7)。

圖 4-13 神經膠質瘤模型鼠腦各代謝物在化學位移上訊號分佈之積分影像

(59)

紋狀體-左(a) 紋狀體-右(b) NAA-SNR 8.35 2.08 Cr-SNR 7.43 4.32 Cho-SNR 6.27 7.56 Lac-SNR 2.88 6.47 Gly-SNR 2.38 10.56 NAA/Cr 1.29 0.42 Cho/Cr 0.99 1.87 Lac/Cr 0.41 1.68 GLy/Cr 0.60 2.21

表4-6 與圖 4-12(a)、(b)頻譜相對應代謝物之訊噪比及 X/Cr。

綜觀活體大鼠實驗結果，在正常大鼠鼠腦中，代謝物影像與鼠腦的神經結構分布趨勢相近，並且與該神經結構特性吻合，在神經膠質瘤模型鼠腦中，Cho、Lac、

Gly 與腫瘤的分布成正相關，而 NAA、Cr 在鼠腦的分布上，會因為腫瘤的存在而呈低訊號區，其腫瘤對代謝物影像分布的影像亦符合預期變化。

(60)

Chapter 5 討論與未來展望

5.1 實驗結果討論

5.1.1 勻場對頻譜之影響

勻場不論在MRS 或者 CSI 的實驗中皆扮演舉足輕重的角色，尤其是在 CSI 的實驗中更是明顯，而勻場的好壞會直接影像到 FID(圖 5-1 5-2)，可以看見在勻場不佳的情況底下會造成FID 中頻率成分會有所變化，也會看見在 FID 末端的訊號衰減較為嚴重。

圖 5-1 勻場不佳之 FID[12]

圖 5-2 勻場較佳之 FID[12]

在整體的實驗中，勻場本身並不包含在實際掃描的過程中，而是在收取 CSI 資料前的一個前置作業，所以在每次實驗的最開端是必須將勻場最佳化的，目前常用的最佳化的方法有半手動勻場、快速自動地圖勻場技術(Fast Automatic

(61)

Shimming Tech by MAP，FASTMAP)以及場圖勻場(MapShim)，第一者乃是直接調整各勻場頻道，紀錄每次微調所得到FID 的訊號大小，從中取 FID 最大者為最佳數值，第二者是利用開啟梯度磁場將物體訊號投影至六個軸向上，以此六個投影的訊號形狀大小回推空間中磁場的分布，然後再計算各勻場頻道應輸出之功率大小，再將訊號投影一次估計誤差，以此反覆疊代數次以求得最佳化勻場，第三者是擷取雙回音的梯度回音影像(Dual echo gradient echo)，將兩者之相位影像(Phase image)相減併除以兩個 echo 的時間差來求磁場圖(Field map)，以此計算各勻場頻道應輸出之功率大小。

半手動勻場的勻場效果是最佳的，但是所耗費的時間是最長的，實際上每次頻道調整使磁場改變1Hz 的步階(Step)，就需要耗費近二十分鐘，而 FASTMAP 以及MapShim 目前在機器上皆有自動化的流程，勻場時間皆僅需近五分鐘，相對半手動勻場快速，但惟其勻場效果不及半手動勻場，兩者實際上勻場所得之水訊號半高全寬，在活體大鼠鼠腦的掃描中約為半手動勻場的1.5 倍，半手動勻場之水訊號半高全寬每次活體大鼠鼠腦實驗大約為120 Hz 左右。由於半手動勻場佳且耗費時間尚在接受範圍內，故在本論文中的實驗皆採用半手動勻場。

5.1.2 表現線圈空間分布靈敏度對訊號之影響

使用表面線圈收取訊號可以提高訊造比，因此大部分鼠腦實驗都會使用表面線圈收訊號，但是表面線圈的其中一個特點就是訊號隨掃描深度增加而改變，就是物體距離線圈越遠，訊號就衰減越多，這是由線圈接收靈敏度(Sensitivity)隨空間變化而導致，所以用表面線圈收取的訊號，實際上必需將此作強度校正(Intensity correction)，此校正需要事先獲得線圈在各相對於線圈的空間位置的訊號靈敏度，

(62)

然後再用以校正收取的影像訊號，此校正會放大雜訊，其雜訊放大程度隨深度增加而增加，而 CSI 的頻譜本身的雜訊對於代謝物是相對於水訊號大的，所以在實際校正 CSI 影像時造成鼠腦底部雜訊被放大而受到干擾，而實驗中所用的線圈半徑尚能包含到大鼠下巴，所以訊號衰減的曲線在要觀察的大腦部位的平坦度尚能接受，所以在最後重組的代謝物影像並未校正之。

5.1.3 代謝物影像之結果探討

在假體實驗中，代謝物影像分佈位置確實與相對應樣品空間位置互相吻合，

與MRS 所獲得之頻譜亦互相對應，表示 MRS 及 CSI 是具有良好空間定位能力。

但在結果中發現兩個現象，第一是Cr 影像中發現在 NAA 樣品位置也出現訊號，

與頻譜上化學位移分佈做比較可以發現，我們針對 Cr 做積分的位置(3.05ppm)與 NAA 次訊號群(2.8~3.1ppm)重疊，故在選擇代謝物化學位移範圍時亦須考量其他代謝物使否有相近或相同之範圍；第二是在樣品邊緣上訊號分佈與實際濃度分佈不一致，從影像上會將濃度梯度視為線性下降，但實際上樣品管內的濃度應為均勻分布，此原因應為部份體積效應(Partial volume effect)造成，由於 CSI 解析度低使得單一體素跨越樣品內外幅度變化大，使得此效應在內插後的影像上更為明顯，

然而在鼠腦的結構中，其皮質、灰質及紋狀體等結構變化又比假體的樣品管細微，

部份體積效應將會在鼠腦中更甚影響，而此效應亦會稀釋在單一體素內之代謝物含量，使訊號將低，若是含量低於儀器之靈敏度會直接收不到代謝物訊號，因此解析度將是一個需要改善的課題。

MRS 以及 CSI 在大腦腫瘤上已有不少研究，大部分研究乃探討腫瘤在惡化過程中代謝物的變化以及治療策略對於腫瘤代謝變化之評估，而過去文獻中指出，