物 技 術
圖3-5 Ankyrin 及 BIPM 基因表現系統之構築圖。（A）Ubi 啟動子驅動之大量表現構築；（B）Ubi 啟動子驅動之 RNAi 刪減表現構築。
水稻紋枯病抗性分子育種 台灣地區高溫多濕，
病蟲害極易因環境適宜繁衍，進而妨礙水稻的生產。
其中紋枯病是稻作本田病害中，重要風土病之一。台 灣每年稻穀產量因紋枯病損失可達14-17％，但目前仍 無抗性水稻種原。因此，本研究利用基因工程的方法，
將黑趜菌（Aspergillus niger）之葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GO）基因，導入到水稻基因體內，藉由提升 細胞內的微量 H2O2，進而改善水稻對紋枯病的抗性。
經由農桿菌媒介轉形所獲得之擬轉殖系，進行 GO 基 因之分子檢測，結果發現這些轉殖系確實含有 GO 基 因（圖3-6A）。進一步利用即時定量逆轉錄 PCR 分 析 GO 基因的表現情形，結果發現 GO 基因確實能在 這些轉殖系中有所表現（圖3-6B）。其中，1.1 及 2.1 等 T2轉殖系，經紋枯病菌的接種後，較 TNG67 及 pCAMBIA1301 轉殖系（空載體）等對照品系明顯有 較佳的抗性表現（圖3-6B）。
分子檢測
外銷花椰菜雜交種子純度之分子鑑定技術 一 代雜交種子純度檢定是商業種子生產的重要品質管 控工作。以生育特性（grow out test, GOT）檢查模 式，為目前種苗業界經常使用的方法，但此方式容 易受制於氣候環境而呈現較大的變畨誤差；且使用 外觀生育特性的檢查方式，既耗時又需要較大的栽 培空間與人力。本研究目標為開發專一性或共顯性 分子標誌，應用於花椰菜雜交種與親本之鑑定，並 進行畨型株（off-type）之檢測。研究結果，已成凾 開發 4 個關鍵性之切割擴增多型性序列（cleaved amplified polymorphic sequences, CAPS）標誌，適用 於2 家外銷種苗公司合計 15 個雜交品種的 F1種子 純 度 之 檢 測 （ 圖 3-7）。 另 又 篩 選 獲 得 7 個 SI
生 物 技 術
（self-incompatibility ） 基 因 之 SCAR （ Sequence characterised amplified region）分子標誌（圖 3-8），
可分別運用於花椰菜 9 個雜交品種之檢測。相較傳 統田間性狀檢定需要 2～3 個月，採用此 CAPS 或 SI-SCAR 分子標誌則縮短為 1～2 週，可便於例行性 種子純度檢測工作之利用。
分子檢測技術應用於西瓜、甜瓜病毒鑑定技術 建立 本研究除了使用血清學法鑑定瓜類病毒外也 發 展 分 子 檢 測 技 術 。 在 調 查 胡 瓜 綠 斑 嵌 紋 病 毒
（CGMMV）感染瓜類植物種子的情況，結果顯示 各批號全數無CGMMV 檢出。探討 CGMMV 經種子 傳播的機制，開發符合國際種子協會驗證標準的檢 測流程。檢驗試劑製備與檢定流程標準化，利用本 所現有CGMMV 抗血清，配製成適合間接法免疫酵 素分析（indirect ELISA）的檢驗試劑，並測試其效 果，據以擬定標準化的檢測流程。在建立西瓜種傳 病 毒 檢 測 技 術 上 ， 已 開 發 西 瓜 ZYMV、 CMV、
CGMMV 及 CCYV 四種不同病毒屬之 RT-PCR、
Real-time PCR 增幅檢測系統應用於西瓜、甜瓜等作 物之病毒檢測及鑑定。
此外發展病毒感染之核酸探針雜合系統，已成 凾應用於CCYV 檢測重要經濟瓜類作物於西瓜、洋 香瓜之檢測與病毒鑑別，此結合核酸探針系統應用 於 CCYV 之 檢 測 ， 並 進 行 田 間 洋 香 瓜 是 否 感 染 CCYV 之測試（圖 3-9）。本系統使用兩種不同的核
酸 探 針 同 時 於 一 反 應 管 中 作 用 ， 凿 括 一 段 特 定 的 CCYV CP 基因與由植物基因來源擴增的 DNA 進行 檢測。此二組引子對不論是利用單對引子及多對反 轉錄聚合酵素連鎖反應進行測試，之後利用具高特 畨性的引子對進行核酸探針雜配，利用核酸探針結 合螢光染劑由冷光儀分析螢光訊號作判讀。結果顯 示具有高度專一性，較使用傳統 RT-PCR 的靈敏度 提高約100 倍（表 3-6）。期望此法開發有助於瓜類 病毒檢測在種苗驗證之應用。
利用恆溫環狀擴增法（Loop-mediated isothermal Amplification）建立基改作物之檢測方式 恆溫環狀 擴 增 法 （Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP）為一種快速、高專一性且只需簡易恆溫儀 器即可進行之核酸檢測方式，為開發基改作物快速 檢 測 方 式 之 良 好 選 擇 。 本 研 究 以 基 改 馬 鈴 薯 品 系 EH92-527-1、AM04-1020 與基改植酸酵素馬鈴薯 2-1 品系為主，首先以聚合酶連鎖反應（PCR）進行多 重反應PCR 進行各品系檢測條件之最適化分析，隨 後利用LAMP 建立其快速檢測方式。結果顯示，於 多重反應PCR 最適化部份，於實驗條件下單一反應 即可有效辨別EH92-527-1、AM04-1020 與 2-1 品系;
於 LAMP 檢測方式部分，EH92-527-1 於待測樣本 30ng 狀況下即可有效進行判別，大幅提升檢測之靈 敏度與便利性。未來將朝向快速檢測套組之開發，
便於場邊即可進行檢測作業。
(A) (B)
圖3-6 GO 轉殖 T2品系之分子檢測。（A）目標基因之 PCR 檢測；（B）轉殖系接種前後之 GO 表現分析結果與紋枯病抗性檢定。
生 物 技 術
圖3-7 CAPS 標誌 C40+DpnII（上圖）C40+BclI（下圖）分別測試花椰菜 6 個新商業品種，其中―慶 8HD‖、―慶 S5M‖與―慶 S5P‖品種可獲檢定（圖示黃箭頭：表示檢定用 co-dominant marker）。
圖3-8 S locus SCAR 標誌（sp11a）可利用於外銷採種花椰菜―欣 18‖與―欣 88‖雜交種純度檢測（圖示黃箭頭:表示檢定之 SCAR dominant marker）。
圖3-9 使用發展之定量 PCR 法檢測 CCYV，顯示此反應條件與反應關係佳。
Standard Curve
y = -3.2313x + 36.085 R2 = 0.9984
E = 103%
slope = -3.2313
0 5 10 15 20 25 30 35
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Log CO
Ct
生 物 技 術
表3-6 使用定量 PCR 法與一般 PCR 法比較檢測 CCYV 之靈敏度 Dilution series a
One step RT-PCR One step qRT-PCR
ng Copy number Ct CV 素水稻（Oryza sativa L. ssp. japonica; AAN）作為 花 粉 貢 獻 親 ， 台 農 糯73 號 （ O. sativa L. ssp.
japonica cv. ‗Tainung 73‘; TNG 73）作為花粉接受 親 ， 進 行 緩衝區 設 置 對 基因轉 殖 水 稻花 粉流 佈 之 種皮花青素合成酶基因（anthocyanin synthase, ANS）
之 ‗Lineker‘ 和 ‗Magenta Lineker‘ 之 菊 花
（Dendranthema grandiflorum）轉殖系與常見之菊科 雜草（兔仔草 Ixeris chinensis（Thunb） Nakai.、鱧 腸 Eclipta prostrata L. 、 紫 花 藿 香 薊 Ageratum