第二章、 實驗材料與研究方法
第四節 動物行為實驗：莫氏水迷津實驗 (Morris water maze)
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將其置於 65 ℃水浴中溶解，以 Whatman paper＃1 過濾後即可得到明膠溶 液)，靜置於室溫 30 分鐘，將玻片自明膠溶液中取出置於烘箱中烘乾，保 存於玻片盒中。
二、 免疫組織化學染色
將腦部組織切片於室溫下浸潤於PBS 中 10 分鐘，以 4 ℃酒精/醋酸 (95
%：5 %) 處理 10 分鐘再以 PBS 清洗三次，每次 10 分鐘；接著將組織切
片浸潤於含有 3 %牛血清白蛋白 (bovine serum album, BSA；Calbiochem, San Diego, CA) 以及 0.2 % Triton X-100 之 PBS，於室溫下進行 blocking，
作用 2 小時；將初級抗體 (mouse monoclonal anti-Flag antibody, 1：100；
Sigma, St. Louis, MO) 溶於上述的 blocking 溶液中並加入組織切片內，置
於 4 ℃反應。隔日以 PBS 清洗三次，每次 10 分鐘；將組織切片加入 PBS 稀釋過的次級抗體 (goat anti-mouse FITC-conjugated IgG antibody, 1：
100；Sigma) 於室溫下作用 1 小時，再以 PBS 清洗三次，每次 10 分鐘，
最後以封片膠 (0.22 M DABCO in 90 % glycerol/PBS) 封片，置於螢光顯 微鏡下觀察並照像紀錄。STAT1 siRNA 的 sense 序列於 5’端接上 Cy3 紅色 螢光物質，腦組織進行組織切片並以封片膠封片後，以螢光顯微鏡下觀察 並照相。
第四節 動物行為實驗：莫氏水迷津實驗 (Morris water maze)
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ㄧ、 水迷津實驗器材
水迷津實驗是依照 Richard Morris 於 1984 年所提出的藍本稍作修改，
使用直徑 2 公尺，高 0.6 公尺的圓形塑膠製水池，水池內注入約 20 公分高 的水，水溫維持在 25±1℃，在水池邊緣約 30 公分處置放ㄧ圓形透明的壓 克力平台，其直徑為 8 公分，其高度需低於水面約 2.5 公分。當水池注入 約 20 公分高的水時，將奶粉加入水池中，使水池呈現乳白色不透明樣。四 周牆壁貼上簡單的幾何圖形做為空間學習的參考線索 (spatial cues)。此外 在游泳池的上方架設連接電腦的攝影機，以影像追蹤軟體 (water-maze video tracking record system, HasoTec, Germany) 將游泳池的區域劃分 成四個虛擬象限，並紀錄和分析動物的行為軌跡。
二、 隱藏式平台 (hidden platform) 水迷津學習試驗
隱藏式平台水迷津學習試驗又稱之為莫氏水迷津學習試驗 (Morris water maze learning task)。測試時，將大白鼠面向池壁放入水中，任其在
水池中自由的游泳直到找到平台，大白鼠放入水池後至站立於平台上所花 費的時間稱為逃離時間 (escape latency)，測試者讓大白鼠在 60 秒內自由 地尋找平台，若在時限內仍無法找到平台，則由測試者帶領大白鼠上平台。
不論是大白鼠自行尋找到平台或是由測試者帶領至平台，皆於平台上休息 20 秒，讓其觀察四周的空間學習線索，稱之為ㄧ個學習嘗試 (trial)。此實 驗共進行四天，每天進行三個學習嘗試，分別在早上、中午及下午，每個
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學習嘗試約間隔 3 個小時。在這段期間中大白鼠尋找平台所花費的時間越 短，表示其空間與學習的記憶能力越好。而進行 siRNA 隱藏式水迷津前約 60 小時，需先轉染 siRNA 降低目標蛋白的表現量，siRNA 效果可以維持約 96 小時，但無法持續在整個水迷津試驗，因此在第二天水迷津試驗的第一
個測試之前會再補打一次 siRNA，並讓動物休息一小時之後再進行水迷津 試驗。
三、 探測試驗 (probe trial)
進行完四天的學習嘗試後，進ㄧ步利用探測試驗 (probe trial) 確認大白 鼠對於平台空間位置的記憶能力。此試驗是將水池中的平台取出，牆壁四 周仍留下空間線索，將大白鼠放入水池中游泳60 秒。水池上方的攝影機紀 錄下游泳軌跡，並統計大白鼠第一次穿過平台位置的時間 (initial latency to swim cross the platform location)、穿過平台次數和停留在具有平台象限區 域的時間及游泳速度 (swim speed)。
四、 可見式平台 (visible platform) 水迷津試驗
為了確認所注射的 siRNA 或質體基因不影響個體動物的視覺和運動上
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的功能，我們進行可見式平台水迷津試驗，試驗中水池的設置為：(1) 平台 需露出水面約 2.5 公分；(2) 平台上插入高度約 50 公分高的旗子；(3) 水 池不加入奶粉使其澄清。牆壁四周仍保留幾何圖案的空間線索，同樣連續 進行四天，每天三個學習嘗試，共十二各學習嘗試，並紀錄大白鼠的逃離 時間。
五、 有訓練 (trained) 和無訓練 (non-trained) 的水迷津試驗
實驗將大白鼠分成兩組：一組為有訓練 (trained) 另一組則為無訓練 (non-trained)。有訓練的組別，給予 60 秒的逃離時間讓大白鼠在水池中自 由的探索平台位置，若 60 秒仍無法找到平台則由測試者將大白鼠引領至平 台上。無論是大白鼠自行尋找到平台或是由測試者引領大白鼠至平台上，
皆讓其在平台上休息 20 秒。而另一組的大白鼠則不參與空間學習訓練，讓 其在沒有平台及空間環境線索下自由的游泳，主要是避免運動能力對於水 迷津學習試驗的影響，給予游泳的時間依據空間學習訓練組於當次學習嘗 試中尋找到平台的平均秒數。
第五節 即時定量聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction,