轉錄因子STAT1在大鼠空間學習與記憶形成的角色探討 - 政大學術集成

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(1)國立政治大學神經科學研究所碩士論文. 轉錄因子 STAT1 在大鼠空間學習與記憶形成的角色探討治. 立. 政. 大. ‧ 國. 學 ‧. Role of STAT1 in spatial memory formation in rats. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. i Un. v. 研究生：謝定佑撰指導教授：李小媛博士. 中華民國 99 年 7 月 1 日.

(2) 誌謝南風輕輕地吹送，三年的研究所生涯，就這樣劃上了句點。論文得以順利完成，最先要感謝的是指導教授李小媛老師，在學術思想與邏輯上給了我相當大的啟發，讓我學習到做事該有的嚴謹態度，沒有您悉心的指導，就沒有這篇論文的誕生；同時也要感謝口試委員廖瑞銘教授與趙知章教授給予我許多精闢的見解，使論文更趨完善，在此敬申謝意。在這段艱辛又滿足的學術道路上，承蒙許多學長姊的照顧與提攜，最要. 立. 政治大. 感謝教導我兩年實驗的大倫學長，不厭其煩的指導我實驗上的缺失，同時. ‧ 國. 學. 還要感謝瑞徵學長、正雄學長、瀅臻學姊、靜恬學姊、馨瑩學姊在實驗上. ‧. 的協助與鼓勵，也要感謝馬哥在動物實驗上的幫助，另外，還要謝謝文婷、. Nat. io. sit. y. 彥呈、紹宇，讓這段旅程，充滿歡樂與笑聲，沒有實驗室大家的幫助，我. er. 無法如此順利的完成我的碩士論文。此外，也要感謝大智樓神科所所辦的. al. n. iv n C hengchi U 于立恩小姐，幫助我處理許多文書上的問題，我還要感謝我身邊的所有好友，謝謝你們的兩肋插刀，謝謝你們豐富了我的人生。最後感謝總是無怨無悔支持我的爸爸、媽媽，謝謝您們的栽培與養育，同時我也要謝謝ㄧ路陪伴我的 mifi，在這段時間直接承受了我所有情緒，妳辛苦了。最後在此感謝所有幫助我的人、關心我的人，謹以此論文與祝福，獻給你們。. I.

(3) 中文摘要 STAT1 是一個轉錄因子，在細胞生理功能中是非常重要的訊息傳遞者，在免疫系統具有抗病毒的角色，但是目前為止對於STAT1 在中樞神經系統所扮演的角色仍不清楚。爲證實STAT1 的表現與空間記憶的形成有關聯，我們將大白鼠分成兩組，一組為有訓練的組別，另一組則為無訓練的組別分別進行水迷津試驗，試驗完畢後取出大鼠的海馬迴CA1 區域組織進行即時定量聚合酶連鎖反應與西方墨點法分析。結果顯示，經過水迷津訓練的. 立. 政治大. 刺激下，STAT1 mRNA與蛋白質分別減少約 34 %及 40 %，而STAT2 mRNA. ‧ 國. 學. 及蛋白質的表現則不受空間學習的影響。爲了進ㄧ步探討STAT1 在空間學. ‧. 習記憶過程中所扮演的角色，實驗利用STAT1 siRNA轉染至海馬迴CA1 區. Nat. io. sit. y. 域抑制STAT1 的表現，發現降低STAT1 表現會促進大白鼠在水迷津試驗的. er. 學習能力，實驗同時也轉染STAT2 siRNA至CA1 區域，結果顯示STAT2 不. al. n. iv n C hengchi U 參與大白鼠空間記憶的形成。本實驗室先前發現降低laminin. β1 表現量會. 促進大白鼠的空間學習記憶 (unpublished observation, 附錄二)，此外 laminin β1 基因啟動子上具有STAT1 結合序列：interferon-γ activated site (GAS)。因此，實驗利用PC12 細胞進行laminin β1 報導基因分析，結果顯示STAT1 會促進 laminin β1 啟動子的轉錄活性。而爲了進一步探討在 STAT1 影響空間學習與記憶歷程中與laminin β1 的關聯性，實驗利用STAT1 siRNA抑制大白鼠海馬迴CA1 區STAT1 的表現並促進空間學習與記憶的同. II.

(4) 時，發現laminin β1 mRNA及蛋白質表現量都受到STAT siRNA的抑制，而轉染野生型STAT1-Flag質體則會增加laminin β1 mRNA及蛋白質的表現量，顯示STAT1 正向調控laminin β1 的表現。本篇論文提出海馬迴CA1 區域的STAT1 參與動物空間學習與記憶的形成，其中可能與STAT1 正向調控 laminin β1 的表現有關。. 立. 政治大. ‧. ‧ 國. 學. n. er. io. sit. y. Nat. al. Ch. engchi. III. i Un. v.

(5) Abstract STAT1 is a signal transducer and transcription factor in the cell. Several reports have indicated that STAT1 plays a critical role in immune response against virus infection in animals. However, the role of STAT1 in the central nervous system is still unclear. In the present study, we aimed to examine the role of STAT1 involved in spatial memory formation in rat and the possible downstream gene that STAT1 regulates. Rats were randomly divided into the trained group and the non-trained group.. 政治大 behavioral paradigm. Their 立 hippocampus CA1 tissues were dissected out Animals were subjected to water maze learning according to the previous. ‧ 國. 學. for STAT1 mRNA level and protein level determination. Results indicated that spatial training markedly decreased STAT1 mRNA level and protein. ‧. level in the CA1 area, but this change was not found for STAT2 mRNA. sit. y. Nat. and protein expression. To further confirm the role of STAT1 involved in. er. io. spatial learning and memory, animals were transfected with STAT1 siRNA. n. a l showed that STAT1 in the CA1 area. Results i v siRNA transfection n. C. e n gperformance, significantly facilitated water h maze whereas their water chi U. maze performance under STAT2 siRNA transfection was not altered. Previous studies from our laboratory have demonstrated that laminin β1 impairs spatial memory formation in rat (unpublished observation). In addition, promoter analysis indicates that the laminin β1 promoter region contains. two. GAS. elements,. which. is. the. STAT1/STAT1. and. STAT1/STAT3 binding site. Results from luciferase reporter assay revealed that transfection of STAT1 siRNA decreased laminin β1 promoter activity, whereas transfection of STAT1 wild-type plasmid increased laminin β1 promoter activity. To further study the relationship IV.

(6) between STAT1 and laminin β1 in spatial memory formation, we used STAT1 siRNA to knockdown STAT1 expression and these animals were subjected to spatial training. We then determined their laminin β1 expression. Results showed that the laminin β1 mRNA level and protein level were both significantly decreased by STAT1 siRNA transfection. Besides, STAT1 wild-type plasmid transfection increased laminin β1 mRNA level and protein level in the CA1 area associated with spatial memory impairment. These results together suggest that STAT1 negatively regulates spatial memory formation. Further, STAT1 may memory. 立. expression.. ‧. ‧ 國. 學. Nat. y. .. io. sit. spatial. n. al. er. impair. 治政 formation through 大 increased. Ch. engchi. V. i Un. v. laminin. β1.

(7) 目錄誌謝 ...........................................................................................................I 中文摘要 ...................................................................................................II 英文摘要 ................................................................................................. IV 目錄 ........................................................................................................ VI 圖次..........................................................................................................XI 縮寫全名對照表.......................................................................................XII. 立. 政治大. 第一章、緒論····························································································1. ‧ 國. 學. 第一節、學習與記憶 ·············································································1. ‧. ㄧ、學習與記憶的定義 ·····································································1. y. Nat. er. io. sit. 二、學習與記憶的種類 ·····································································1. n. 三、記憶形成之歷程·········································································2 a v 四、. i l C n U hengchi 參與學習與記憶的腦區 ······························································3. 第二節、海馬迴組織與學習記憶 ························································· 4 ㄧ、海馬迴的構造 ············································································4 二、海馬迴的投射路徑 ·····································································5 三、海馬迴與空間學習記憶的關係 ···················································6 四、學習記憶相關的動物行為實驗····················································7 第三節、突觸可塑性 (synaptic plasticity) ·············································8 VI.

(8) 第四節、訊息傳遞與轉錄活化因子 (signal transducer and activator of transcription, STAT)············································································· 11 第五節、 STATs 蛋白在細胞生理功能上所扮演的角色·························14 第六節、 STAT1 與 STAT2 蛋白質的細胞生理功能 ·····························15 ㄧ、. STAT1····················································································15. 二、. STAT2····················································································18. 第七節、層黏蛋白 (Laminin，LN) 家族 ·············································19. 政治大. ㄧ、層黏蛋白的簡介 ·····································································19. 立. ‧ 國. 學. 二、層黏蛋白在神經系統中的表現與功能 ·····································20 三、層黏蛋白 β1 與記憶的關係·····················································22. ‧. 第八節、本論文之研究目的與策略 ·····················································23. sit. y. Nat. n. al. er. io. 第二章、實驗材料與研究方法·································································24. iv. Ch 第一節實驗動物··················································································24 Un engchi. 第二節海馬迴內質體基因轉染 (transfection) 或藥物注射··················24 ㄧ、立體定位手術 (stereotaxic surgery) 與埋管 ···························24 二、質體基因與聚乙烯亞胺 (polyethylenimine, PEI) 混合物的製備 .................................................................................................25 三、 STAT1 siRNA 與 STAT2 siRNA 的配製 ···································26 四、海馬迴 CA1 區域注射 ······························································26 第三節免疫組織化學染色 (immunohistochemistry)····························27 VII.

(9) ㄧ、組織切片的製備·······································································27 二、免疫組織化學染色 ···································································28 第四節動物行為實驗：莫氏水迷津實驗 (Morris water maze) ············29 ㄧ、水迷津實驗器材·······································································29 二、隱藏式平台 (hidden platform) 水迷津學習試驗 ······················29 三、探測試驗 (probe trial) ·····························································30 四、可見式平台 (visible platform) 水迷津試驗 ······························31. 立. 政治大. 五、有訓練 (trained) 和無訓練 (non-trained) 的水迷津試驗 ········31. ‧ 國. 學. 第五節即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time polymerase chain. ‧. reaction, real time-PCR)······································································31 ㄧ、分離海馬迴 (hippocampus) 、紋狀體 (striatum) 及杏仁核. sit. y. Nat. (amygdala) 組織 ··············································································32. er. io. n. a l ·································································32 二、腦組織 RNA 之萃取 iv Ch. n engchi U. 三、反轉錄酵素 (reverse transcriptase) 反應 ·······························33 四、即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time polymerase chain reaction, real time-PCR) ·················································································33 第六節西方墨點法 (western blot) ······················································34 一、萃取腦組織蛋白質 ···································································34 二、蛋白質濃度測定法 ···································································35 三、免疫沉澱反應 (immunoprecipitation, IP)·································35. VIII.

(10) 四、 STAT1 DNA 結合試驗 (STAT1 DNA binding assay)···············36 五、西方墨點法 ··············································································37 第七節層黏蛋白 β1 報告基因表現量分析 (reporter gene analysis) ····39 一、細胞培養皿之塗抹 (coating plate)···········································39 二、活化冷凍細胞 ··········································································39 三、細胞培養··················································································40 四、層黏蛋白 β1 報告基因表現量分析 ···········································41. 立. 政治大. 五、冷凍保存細胞 ··········································································42. ‧ 國. 學. 第八節統計分析··················································································42. ‧. 第三章、結果··························································································44. y. Nat. io. sit. 第一節水迷津試驗降低海馬迴 CA1 區域 STAT1 mRNA 及蛋白質的表現. n. al. er. .................................................................................................44. iv. 第二節海馬迴 CA1 區域內CSTAT1 表現量降低會促進大白鼠空間記憶的 Un h 形成. engchi. .................................................................................................49. 第三節大白鼠 CA1 區域 STAT2 的表現量減少並不影響大白鼠空間記憶的形成 .................................................................................................53 第四節 STAT1 會影響 laminin β1 的啟動子促進 laminin β1 的轉錄活性 .................................................................................................56 第五節海馬迴 CA1 區域轉染 STAT1 siRNA 會抑制 laminin β1 的表現 .................................................................................................59 第六節海馬迴轉染野生型 STAT1 會促進 laminin β1 的表現 ···············62 IX.

(11) 第四章、討論··························································································65 第五章、結論··························································································77 參考資料 ·································································································78 附錄 ········································································································88 附錄一、大白鼠經水迷津試驗會減低海馬迴 CA1 區域的 laminin β1 蛋白質的表現 ······························································································88. 治政附錄二、抑制海馬迴 CA1 區域 laminin β1 大表現會促進空間記憶的形成立 ············································································································89. ‧ 國. 學. 附錄三、大白鼠經水迷津試驗會減低海馬迴 CA1 區域的 STAT3 蛋白質的. ‧. 表現 ·····································································································90. y. Nat. er. io. sit. 附錄四、STATs 蛋白質家族與其細胞生理功能 ····································91 附錄五、層黏蛋白結構圖·····································································92 a. n. iv l C n h e···························································93 附錄六、pRC/CMV 質體結構圖 ngchi U. X.

(12) 圖次圖 1、大白鼠經水迷津試驗會減低海馬迴CA1 區域STAT1 mRNA的表現，並不會影響STAT2 mRNA的表現。.........................................................46 圖 2、大白鼠經水迷津試驗會減低海馬迴CA1 區域的STAT1 蛋白質的表現，並不會影響STAT2 的蛋白質表現。.........................................................47 圖 3、大白鼠在空間學習試驗的環境刺激下不會影響紋狀體及杏仁核內 STAT1 與STAT2 蛋白質的表現量。 ........................................................48. 立. 政治大. 圖 4、大白鼠海馬迴CA1 區域內抑制STAT1 的表現量會促進大白鼠空間學. ‧ 國. 學. 習記憶的能力。 ......................................................................................52. ‧. 圖 5、抑制海馬迴CA1 區域STAT2 的表現並不會影響大白鼠空間學習記憶. io. sit. y. Nat. 的能力。 .................................................................................................55. er. 圖 6、細胞內STAT1 會結合至laminin β1 啟動子序列 (+150~-1300) 增加. al. n. iv n C hengchi U laminin β1 的表現。................................................................................58. 圖 7、海馬迴CA1 區域轉染STAT1 siRNA會降低STAT1 與GAS序列的結合能力及降低laminin β1 的表現。......................................................61 圖 8、海馬迴 CA1 區域轉染 STAT1-Flag 會促進 STAT1 與 GAS 序列的結合能力與 laminin β1 蛋白質的表現。.......................................................64. XI.

(13) 縮寫全名對照表 AMPA：α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate ANOVA：analysis of variance AP2：adipocyte fatty acid binding protein ApoE：apolipoprotein E Arg (R)：arginine Asp (D)：aspartic acid BDNF：brain-derived neurotrophic factor BSA：bovine serum albumin CA1：cornu ammonis 1 CaMKⅡ：Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ CBP：CRBE-binding protein CCL：chemokine ligand. 政治大 C/EBP：CCAAT-enhancer-binding protein CNS：central nerve system 立. n. y. er. io. sit. ‧ 國. ‧. Nat. al. 學. CREB：cAMP response element-binding protein DMEM：Dulbecco’s modified eagle medium DNA：deoxyribonucleic acid ECM：extracellular matrix EDTA：ethylenediaminetetraacetic acid EF1α：elongation factor 1α EPSP：excitatory postsynaptic potential ERK：extracellular signal-regulated kinase FBS：fetal bovine serum FITC：fluorescein isothiocyanate fMRI：functional magnetic resonance imaging GAS：interferon-γ activated site Gly (G)：glycine HAT：histone acetyltransferases HDAC：histone deacetylases HPRT：hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase HRP：horseradish peroxidase HS：horse serum IL：interleukin INF：interferon. Ch. engchi. INFAR：interferon-α/β receptor IP：immunoprecipitation IRF9：interferon regulatory factor 9 XII. i Un. v.

(14) ISRE：interferon stimulated response elememt JAK：janus kinase kDa：kilodalton LB1：laminin β1 LN：laminin Lys：lysine MAPK：mitogen-activated protein kinase MHC：major histocompatibility complex MMP：matrix metalloporoteinase mRNA：messenger ribonucleic acid. 政治大. io. n. y. er. Nat. al. ‧. ‧ 國. 立. 學. PBS：phosphate buffer saline PCR：polymerase chain reaction PEI：polyethylenimine PET：positron emission tomography PIAS：protein inhibitor of activated STAT PKA：protein kinase A PKC：protein kinase C PTPs：protein tyrosine phosphatase PVDF：polyvinylidene fluoride SD：Sprague-Dawley SDS：sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE：SDS polyacrylamide gel electrophoresis Ser (S)：serine SGK：serum and glucocorticoid-inducible kinase SH2：Src homology 2 siRNA：small interfering RNA SOCS：suppressor of cytokine signaling Sp1：specificity protein 1 STAT：signal transducers and activators of transcription SUMO：small ubiguitin-like modifier RT-PCR：reverse transcriptase PCR TyK：tyrosine kinase. sit. NF-κB：nuclear factor κB NGF：nerve growth factor NMDA：N-methyl-D-aspartic acid Nmi-1：N-myc-interacting protein 1. Ch. engchi. Tyr (Y)：tyrosine. XIII. i Un. v.

(15) 第一章、緒論第一節、ㄧ、. 學習與記憶. 學習與記憶的定義. 學習與記憶 (learning and memory) 是神經系統中非常重要的功能之一，可幫助生物體藉由經驗的累積來應付外界環境的改變。學習是由經驗所導致長久的行為改變，是一種持續進行的過程；而記憶則是保留學習的成果，在面對相同經驗下做出相對的反應。生物體接受外在訊息的刺激，. 立. 政治大. 經由細胞內訊息傳遞改變蛋白質活性，同時也影響基因的表現與蛋白質的. ‧ 國. 學. 新生成，促使學習與記憶的形成，但詳細的作用機制目前仍尚未十分明瞭。. ‧. 隨著研究工具的不斷演進及分子生物學的快速發展，神經科學家目前嘗試. Nat. sit er. al. n. 二、. io. 與記憶形成之機轉。. y. 利用分子生物學方法進ㄧ步探討細胞內訊息傳遞與基因表現如何參與學習. Ch. engchi. i Un. v. 學習與記憶的種類. 1924 年心理學家 William McDougall 將記憶分為內隱的記憶 (implicit) 和外顯的記憶 (explicit)。近年來 Larry R. Squire 和 Eric R. Kandel 則將記憶分為陳述性記憶 (declarative memory) 和非陳述性記憶 (non-declarative memory)。陳述性記憶是有意識的去回憶過去的事，屬於事實、念頭、事件的記憶，非陳述性記憶則是潛意識的以行為改變來表達，屬於非意識性的記憶；而非陳述性記憶包含了 (1) 程序性記憶 (procedural 1.

(16) memory)：在初始時是依照程序學習而得，一旦熟練之後，記憶的提取能夠自動出現，不須刻意按照程序，程序性記憶一旦建立後則不易忘記，如：學會游泳、彈鋼琴的記憶；(2) 促發 (priming)：藉由提示其中一個片段來引起記憶的活化，如：給予文字的字首後便能拼出完整文字 (Warrington and Weiskrantz, 1968)；(3) 古典制約 (classical conditioning)：指動物學習當環境有某種刺激發生時，接著將會發生某特定事件，因而有所反應。(4) 習慣化 (habituation)：不會造成傷害的刺激不斷出現，導致反應的程度逐. 立. 政治大. 漸減弱。(5) 敏感化 (sensitization)：傷害性刺激的不斷出現，而使生物體. ‧ 國. 學. 對原有刺激反應持續的增強。. ‧. 記憶形成之歷程. sit. y. Nat. 三、. n. al. er. io. 記憶形成的過程依序可被區分為四個階段，分別是編譯 (encoding)、. iv. 鞏固 (consolidation)、儲存 C (storage) 及提取 (retrieval)，而記憶形成的任 n. hengchi U. 一環節中出現問題，都會造成遺忘 (amnesia)。當外界文字、聲音或景象訊息藉由感覺器官傳至大腦，海馬迴將這些訊息編譯成可儲存的形式，儲存於記憶系統中並維持訊息，以便於下次的重新提取，其中記憶的提取主要是以回憶 (recall) 或再確認 (recognition) 的方式為主，回憶為從記憶中產生事實、單字或其他項目，而再確認則是從記憶中確認正確的事實。而記憶儲存在大腦的形式可依時間長短區分為感覺記憶 (sensory memory) 、短期記憶 (short-term memory) 和長期記憶 (long-term 2.

(17) memory)。感覺記憶為感覺器官接受外來刺激時大腦所得的暫存印象，當引起感覺的刺激物不再繼續呈現時，其作用只維持一個極短的時間。短期記憶為時間較長的有意識記憶，可以維持幾分鐘至幾個小時。長期記憶則會持續幾個小時、幾天、甚至終其一生，從短期記憶到長期記憶需經記憶穩固 (memory consolidation) 的歷程，這是指記憶會由短暫、容易干擾的形式，轉換成為ㄧ種較持久而穩固的形式，其中記憶穩固的過程牽涉到神經元突觸的重組 (remodeling)、基因的表現及蛋白質的新生成 (Goelet et al., 1986)。. 立. ‧ 國. 學. 參與學習與記憶的腦區. ‧. 四、. 政治大. sit. y. Nat. 文獻中記錄了一位H.M. (Henry Gustav Molaison) 的病人，H.M.於九. n. al. er. io. 歲時遇上一次意外後身體產生癲癇 (epilepsy) 症狀，隨著年紀漸長而日趨. iv. 嚴重，經常出現暫時失去意識的現象。神經外科醫生Scoville診斷發現H.M. n C. hengchi U. 的癲癇主要的發生位置在大腦顳葉內側 (medial temporal lobe)，為了去除 H.M.的癲癇病灶，Scoville 對H.M.進行了大腦兩側顳葉內部的切除手術，其包括海馬迴 (hippocampus)、海馬旁迴 (parahippocompal gyrus) 及杏仁核 (amygdala)。手術之後發現病患產生嚴重的失憶症 (amnesia)，特別是對手術後的人、事、物無法產生長期記憶，首次證實海馬迴參與記憶穩固的過程 (Scoville and Milner, 1957)。然而患者手術前的記憶依然存在， Milner等學者也發現病人並非喪失所有的記憶能力，如讓病患透過鏡像描繪 3.

(18) 星形的圖案，隨著練習次數的增加，描繪圖形的能力變的越來越好，代表患者的非陳述性記憶仍然正常 (MacKay et al., 1998)。由此案例發現不同形式的記憶可能由不同的腦區負責，以上的研究可得知海馬迴負責陳述性記憶與空間記憶的形成。從功能性核磁共振 (functional magnetic resonance imaging, fMRI) 分析發現，技能性之學習與記憶需要紋狀體 (striatum) 的參與 (Lacourse et al., 2005) ，這也解釋巴金森氏症 (Parkinson’s disease) 病患因為紋狀體萎縮，導致其技能性的學習能力較. 立. 政治大. 差 (Sarazin et al., 2002)。1989 年Packard以燈光為線索的八臂迷宮習慣. ‧ 國. 學. 性學習試驗 (radial-arm maze)，發現動物因為紋狀體中的尾狀核 (caudate. ‧. nucleus) 遭到破壞，失去習慣性學習的能力 (Packard et al., 1989)；利用. io. sit. y. Nat. 正子斷層造影 (positron emission tomography, PET) 觀察接受恐懼制約. er. 學習 (fear conditioning) 的受試者腦部，發現腦中杏仁核的細胞活性有明. al. n. iv n C 顯的反應，證實杏仁核參與h內隱氏情性記憶 i U en g c h緒. (implicit emotional. memory)，此外McGaugh發現杏仁核也參與陳述性記憶的形成 (McGaugh et al., 1996)。. 第二節、ㄧ、. 海馬迴組織與學習記憶. 海馬迴的構造. 海馬迴的發育是經由顳葉內側 (medial temporal lobe) 區域向頂葉 (parietal lobe) 擴展而成，位於腦室後側的大腦顳葉區域，是左右半腦對稱 4.

(19) 的構造，屬於邊緣系統的一部分。海馬迴於冠狀切片下呈現C字型，由於海馬迴的輪廓與牡羊角有幾分相似，故又稱做 Ammon 氏角 (Ammon’s horn) 。哺乳動物邊緣系統中的海馬迴複合體結構由海馬迴 (hippocampus)、齒狀迴 (dentate gyrus) 及海馬旁迴 (parahippocampal gyrus) 所組成。海馬迴皮質組織具有三層結構，包括：分子層 (molecular layer) 、錐狀神經細胞層 (pyramidal layer) 及多形層 (polymorphic layer)，其中最主要細胞型態為錐狀細胞。齒狀迴的皮質組織與海馬迴的結. 立. 政治大. 構層類似，但與海馬迴不同的是其神經細胞層是由顆粒細胞 (granule cell). ‧ 國. 學. 所組成。海馬迴的主體依細胞的型態及投射路徑的不同又可分為cornu. Nat. y. 海馬迴的投射路徑. io. sit. 二、. ‧. ammonis 1 (CA1)、CA2 及CA3 三個區域。. er. 海馬迴構造接受輸入的神經來源有： (1) 從大腦皮層 (cortex) 投射出. n. al. 的神經先輸入至內鼻皮層. iv n C h e n gcortex)，再由內鼻皮層傳入海馬迴， (entorhinal chi U. 內鼻皮層所發出的訊息藉由穿透神經纖維 (perforant pathway) 投射至齒狀迴的顆粒細胞，由齒狀迴的顆粒細胞苔蘚狀神經纖維 (mossy fiber) 投射至 CA3 區域的錐狀細胞，再由 CA3 區域的錐狀細胞衍生出的 Schaffer 氏側支投射至 CA1 區域，形成所謂的三突觸神經路徑 (tri-synaptic circuit)。 (2) 從下皮層區 (subcortical region) 來的大腦訊息則透過海馬繖 (fimbria) 與穹窿 (fornix) 進入海馬迴 (Amaral and Witter, 1989)。而海馬迴的輸出. 5.

(20) 神經路徑也分為兩種： (1) 由下腳 (subiculum) 至內鼻皮層再傳送至大腦皮質層區；(2) 直接或間接的輸出到下皮質層腦區 (Amaral and Witter, 1989)。三、. 海馬迴與空間學習記憶的關係. 在臨床案例中，H.M 病人接受顳葉的切除手術結果造成了嚴重的失憶症狀，首次發現海馬迴結構與學習記憶的關係，而在不同的實驗動物如大白鼠、猴子等研究上也發現類似的實驗結果 (Squire, 1992; Jarrard, 1993)。. 立. 政治大. 1971 年 O’Keefe 與 Dosrovsky 將紀錄電極插入大白鼠的海馬迴區域，發現. ‧ 國. 學. 這群神經細胞只對特定的空間區域產生動作電位，推測海馬迴內存在對空. ‧. 間位置有偏好的細胞，這類的細胞稱之為位置細胞 (place cell) (O'Keefe. io. sit. y. Nat. and Dostrovsky, 1971)。位置細胞對於空間位置的辨認需要依賴外在的視. er. 覺線索 (visual cue)，於黑暗環境下，這些位置細胞並不會有任何反應，一. al. n. iv n C hengchi U 旦開燈後大白鼠海馬迴接受到視覺線索的刺激，位置細胞的空間位置偏好性會立刻顯現，顯示海馬迴對於空間的記憶方式，是依據外在空間的線索來建構 (Foster et al., 1989; McNaughton et al., 1989)。目前為止已經有許多的研究發現海馬迴關聯到空間記憶的形成，如破壞海馬迴結構會導致大白鼠在莫氏水迷津試驗 (Morris water maze) 出現學習障礙 (Morris et al., 1982)，而在 1990 年 Eichenbaum 等人破壞大白鼠的穹窿結構，將大白鼠放入水池中的固定位置進行水迷津試驗，發現大白鼠能以固定的方式找尋. 6.

(21) 到平台位置；但當大白鼠是以非固定位置的方式放入水池中或改變牆面上的空間線索，發現大白鼠無法運用外在的空間線索找尋到平台的位置 (Eichenbaum et al., 1990)，由此可知動物去除海馬迴結構便無法將外界的視覺線索和空間位置進行連結，證明了海馬迴系統是動物處理空間記憶形成的主要結構。四、學習記憶相關的動物行為實驗為了探討學習記憶形成之機轉，學者利用動物行為實驗觀察動物的學習. 立. 政治大. 能力，其中迷津 (maze) 試驗主要觀察動物在空間記憶的學習能力，而莫. ‧ 國. 學. 氏水迷津試驗為常用的迷津試驗，其實驗方法為：將老鼠放入不透明的圓. ‧. 形水池中，在水池中有個低於水面的平台，老鼠可以藉由牆面上的空間線. Nat. io. sit. y. 索來找尋平台的位置，當其游至平台上即可獲得休息，藉由老鼠找尋平台. er. 的時間判斷空間記憶學習的能力 (Morris, 1984)；此外，常用的行為模式還. n. al. 包括 (1) 情境氏制約學習. iv n C h e n g cfear-conditioning (contextual hi U. learning) ：當動. 物接受厭惡性刺激因子 (aversive stimulus, 例如：電擊刺激) 前會先給予一個中性刺激因子 (neutral stimulus, 例如：聲音)，使得動物在中性刺激因子呈現時，可立即預知電擊的來臨。而當中性制約因子再度出現時，若動物記得先前的厭惡性經驗，則會有恐懼的行為反應，如：大鼠會表現靜止不動甚至顫抖，藉由動物恐懼時間的長短判斷老鼠記憶的程度 (Atkins et al., 1998)。(2) 單項抑制性躲避學習試驗 (one-way inhibitory avoidance. 7.

(22) learning task)：將老鼠置於具有明亮區與黑暗區的行為箱中，老鼠天性喜好於黑暗處，當其進入黑暗區時給予電擊，下回老鼠再度被放入行為箱時，若是老鼠記得被電擊的記憶，則會延長停留在明亮區的時間 (Kesner and Hardy, 1983)。. 第三節、. 突觸可塑性 (synaptic plasticity). 1894年西班牙神經解剖學家Cajal提出新的記憶形成不需透過新的神經. 政治大細胞生成，而是藉由增加神經細胞之間的接觸進而促進訊息的傳導效率立. ‧ 國. 學. (Jones, 1994)。1973年Bliss和Lomo等學者發現利用簡短且高頻率的電刺. ‧. 激海馬迴神經細胞突觸，能持續引起突觸後神經細胞 (postsynaptic neuron). sit. y. Nat. 的去極化反應 (depolarization) ，此特殊現象稱之為長期增益效應. n. al. er. io. (long-term potentiation, LTP)。從研究得知，當神經細胞受到短暫且高頻率. iv. 的電刺激時會釋放麩胺酸 (glutamate) 至突觸間隙 n (synaptic cleft)，活化 C. hengchi U. 突觸後神經細胞上的麩胺酸接受體 (glutamate receptor)，引發突觸後神經細胞的興奮性膜電位 (excitatory postsynaptic potential, EPSP) 持續增加 (Bliss and Gardner-Medwin, 1973)。長期增益效應作用可以持續好幾個小時甚至數週之久，學者研究發現長期增益效應作用會改變細胞內的結構蛋白、細胞膜上接受體數目、影響蛋白質激酶活性，這些細胞生理活性的改變可能會影響到神經細胞間的交互作用、突觸數目與結構以及神經傳導物質的釋放最後改變神經訊息傳遞的效率 (Teyler and DiScenna, 1987; 8.

(23) Davies and Collingridge, 1989)。現今，神經訊息傳遞效率的改變稱之為突觸可塑性 (synaptic plasticity)，而記憶的形成與神經可塑性有密不可分的關係。在神經可塑性的早期需要藉由蛋白質上的轉錄後修飾 (例如：蛋白質的磷酸化) 改變下游的訊息傳遞；而在神經可塑性的晚期則需要蛋白質的新生成來改變突觸的結構，進而增加神經的傳導效率 (McGaugh, 2000; Kandel, 2001)。在蛋白質新生成的過程中，需要基因的轉錄與轉譯，文獻中指出，老鼠在學習前注射訊息核醣核酸 (messenger RNA) 抑制劑：放. 立. 政治大. 線菌素D (actinomycin D)，會破壞老鼠的長期記憶 (Davis et al., 1976;. ‧ 國. 學. Davis et al., 1984)，顯示記憶的形成過程需要特定基因的轉錄過程。基因. ‧. 的轉錄則需要轉錄因子的參與，許多的文獻指出，轉錄因子cAMP response. io. sit. y. Nat. element-binding protein (CREB) 在神經可塑性中扮演著非常重要的角色. er. (Alberini, 2009)，前人文獻指出，海蝸牛 (Aplysia Californica) 在電流的刺. al. n. iv n C hengchi U 激下，可藉由活化CREB啟動下游蛋白質CCAAT-enhancer-binding protein (C/EBP) 與elongation factor 1α (EF1α) 的表現，促進突觸的形成 (Kandel, 2001)。另有文獻指出，海馬迴組織切片在高頻率或低頻率電流的刺激下，會促進轉錄因子 nuclear factor-κB (NF-κB) 的表現 (Meberg et al., 1996)。此外，小鼠缺乏NF-κB次單元p65則會降低其空間記憶上的學習能力 (Meffert and Baltimore, 2005)。而轉錄因子zif 268與維持神經可塑性有關聯，在zif 268突變的小鼠中，長期增益效應消退的速度明顯快於正常小. 9.

(24) 鼠 (Jones et al., 2001; Bozon et al., 2002)。上述的研究結果顯示轉錄因子在記憶形成的重要性，並藉由調控下游基因的表現，維持並參與神經可塑性的形成。神經傳導效率的改變需要神經可塑性相關的蛋白質產生，其中包括細胞骨架分子、細胞黏著分子與細胞外基質，有文獻指出神經細胞藉由調控細胞骨架分子、細胞黏著分子與細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 的新生成來重組突觸數目和接觸面積，改變神經可塑性 (Lauri et al., 1999;. 立. 政治大. Wright et al., 2002)。另有研究指出肌動蛋白絲 (actin filament) 在海馬迴. ‧ 國. 學. CA1區域維持長期增益現象 (Krucker et al., 2000)，Fukazawa等人同時發. ‧. 現在大白鼠海馬迴區域利用細胞骨架抑制劑latrunculin A會抑制晚期長期. io. sit. y. Nat. 增益現象的形成 (Fukazawa et al., 2003)，代表長期增益現象的持續需要. er. 神經細胞骨架的重組。此外Arg(R)-Gly(G)-Asp(D) 氨基酸 (RGD tripeptide). al. n. iv n C h e 與細胞外基質的結合序列，抑制整合蛋 (integrin) ngchi U. 可專一性辨認整合蛋白. 白與胞外基質的結合，若加入RGD tripeptide至海馬迴組織切片並以簡短及高頻率電刺激情況下進行觀察，發現長期增益現象會受到RGD tripeptide的抑制，顯示整合蛋白與細胞外基質的結合牽涉到長期增益效應的產生 (Staubli et al., 1998)。而基質金屬蛋白酶 (matrix metalloporoteinase, MMP) 為分解胞外基質的蛋白酵素，Meighan等人發現MMP-3與MMP-9參與大白鼠空間記憶的形成 (Meighan et al., 2006)，顯示細胞外基質與神經. 10.

(25) 細胞之間的交互作用會影響到記憶的形成。. 第四節、. 訊息傳遞與轉錄活化因子 (signal transducer and activator. of transcription, STAT) STATs 蛋白質最早被發現只是做為訊息傳遞中的效應子 (effectors)，當細胞受到干擾素 (interferon) 的刺激時，STATs 蛋白質可傳遞細胞表面之活化訊息至細胞核內。剛開始認為 STATs 蛋白質只參與細胞素調控之免疫. 政治大. 細胞的分化與功能 (Darnell et al., 1994)，在後來的研究發現，STATs 蛋白. 立. ‧ 國. 學. 質除了能將訊息由細胞表面傳遞至細胞核內之外，也會參與基因表現的調控 (Darnell, 1997)。目前已知 STATs 的家族成員共有七種，分別是 STAT1、. ‧. STAT2、STAT3、STAT4、STAT5α、STAT5β 和 STAT6，約由 750 到 900. sit. y. Nat. 個胺基酸組成。目前已知哺乳動物上的 STATs 基因分佈在三條不同染色體. er. io. n. a l基因位於第二號染色體上上，人類 STAT1 和 STAT4 i v (小鼠則位於第一號染 Ch. n engchi U. 色體)，STAT3、STAT5α 和 STAT5β 基因位於第十二號染色體 (小鼠則位於第十一號染色體)，而 STAT2 和 STAT6 基因位於第十七號染色體 (小鼠位於第十號染色體)，在不同物種間 STATs 的表現量與調控也有所不同 (Copeland et al., 1995)。 STATs 家族成員的蛋白質結構具有高度的相似性，並擁有類似的功能區域，包括 N 端區域 (N-terminal)、螺旋捲曲區域 (coiled-coil domain)、DNA 結合區域 (DNA-binding domain) 、連接區域 (linker domain) 、 Src 11.

(26) homology 2 (SH2)、酪胺酸活化區域 (tyrosine activation) 與轉錄活化區域 (transcription activation domian) (Schindler et al., 2007)。N 端區域主要調控 STATs 蛋白在細胞核內外的輸出與輸入 (Strehlow and Schindler, 1998; McBride and Reich, 2003)；螺旋捲曲區域是由四個 α 螺旋蛋白形成的親水性結構，可作為調控子 (regulator) 蛋白的結合區域；DNA 結合區域具有筒狀蛋白的疊合，促使 STATs 蛋白直接與目標基因上的特定序列進行交互作用 (Schindler et al., 2007)；SH2 區域位於第 570 胺基酸到第 700 胺基. 立. 政治大. 酸之間具有可辨識已磷酸化的胺基酸序列，藉由此特性 STATs 蛋白質可互. ‧ 國. 學. 相作用形成雙聚體 (dimer)；在 STATs 蛋白質靠近第 700 個胺基酸的位置，. ‧. 有一個高度保留性的酪胺酸 (tyrosine)，此位置的磷酸化會促使與另一個相. io. sit. y. Nat. 同或不同的 STATs 蛋白質在 SH2 區域形成同雙聚體 (homodimer) 或異雙. er. 聚體 (heterodimer)，例如：STAT1-STAT1 和 STAT3-STAT3 的同雙聚體，. al. n. iv n C STAT1-STAT2、STAT1-STAT3h或eSTAT5α-STAT5β n g c h i U 的異雙聚體等；轉錄活. 化區域則位於 STATs 蛋白質的 C 端，此區域具有高度保留的絲胺酸 (serine)，此絲胺酸附近之胺基酸序列為 Leu-Pro-Met-Ser-Pro，會受到細胞內蛋白質激酶 (例如：mitogen-activated protein kinase, MAPK) 辨認，促使絲胺酸磷酸化，絲胺酸位置的磷酸化會大幅增加 STATs 蛋白質對下游基因的表現 (Wen et al., 1995)。 STATs 蛋白質通常以不活化的形式存在於細胞質中，當細胞受到細胞激. 12.

(27) 素、干擾素 (interferon, INF)、紅血球生成素 (erythropoietin)、血小板生成素 (thrombopoietin) 或是其他多胜肽類 (polypeptide) 蛋白質結合至其受體上時，會導致受體形成雙聚體。在此結構的改變下，促使和受體結合的 Janus kinase (JAK) 自體磷酸化 (autophosphorylation) 而活化，活化後的 JAK 會磷酸化接受體尾端位於細胞質內的酪胺酸，此位置被磷酸化後可做為 STATs 蛋白質的結合處 (docking site)，吸引尚未活化的 STATs 蛋白質前來結合，進而磷酸化 STATs 蛋白質轉錄活化區域上的酪胺酸，STATs 蛋. 立. 政治大. 白質因此活化，活化後的 STATs 蛋白透過互補的 SH2-phosphotyrosine 進. ‧ 國. 學. 行交互作用，形成同雙聚體或異雙聚體。形成雙聚體的 STATs 蛋白會進入. ‧. 細胞核內並結合於目標基因中啟動子的特定序列上，進而調控此基因的表. io. sit. y. Nat. 現 (Williams, 1999)。另一種活化方式則不需 JAK 的參與，而是透過接受. er. 體本身酪胺酸激酶的特性，活化 STATs 蛋白質，例如：表皮生長因子接受. al. n. iv n C h e n g c可直接磷酸化 (epidermal growth factor receptor) STATs 蛋白質上的酪 hi U. 體. 胺酸來調控下游基因的表現 (Hynes and Lane, 2005)。STATs 蛋白質在形成同雙聚體或異聚體後，可以直接與特定的 DNA 序列結合；但有些特定的上游刺激下，需要其他的轉錄因子共同作用，才能調節下游的基因的表現，例如：干擾素所活化的 STAT1-STAT2 異雙聚體，需要跟干擾素調節因子 9 (interferon regulatory factor 9, IRF9) 共同作用形成複合體，才能與 DNA 結合調控目標基因的表現。STAT1-STAT2-IRF9 複合蛋白所辨認的 DNA 序. 13.

(28) 列為 AGTTTNNNTTTCC，此序列稱之為 interferon-stimulated response elememt (ISRE) motif (Levy et al., 1988) ，另外 STAT1-STAT1 與 STAT3-STAT3 同雙聚體則會與 DNA 的 TTCNNNGAA 或 TTCNNNNGAA 結合，這些序列稱之為 interferon-γ activated site (GAS) motif (Horvath et al., 1995)。STATs 蛋白質的活化是短暫而迅速的過程，活化的 STATs 蛋白質會立即被許多的負向調控因子影響其活性，包括： protein tyrosine phosphatase (PTPs)、suppressor of cytokine signaling (SOCS)、ubiquitin. 立. 政治大. proteasome system 與 PIAS 蛋白質 (protein inhibitor of activated STAT)，. ‧ 國. 學. 這些負向調控因子會藉由去除酪胺酸的磷酸化、抑制酪胺酸激酶的活性或. ‧. 是水解蛋白質等來調控 JAK-STAT 的訊息傳遞，使其不過度活化或去活化. Nat. n. al. 第五節、. Ch. engchi. er. io. 或癌症的發生 (Levy and Darnell, 2002)。. sit. y. 而達到平衡狀態，如果過度活化或抑制其訊息傳導將導致許多免疫性疾病. i Un. v. STATs 蛋白在細胞生理功能上所扮演的角色. 從基因剔除鼠的研究中發現，不同的 STATs 蛋白質在細胞生理功能上所扮演的角色也有所不同。STAT1 和 STAT2 的基因剔除小鼠在干擾素 α/β 的訊息傳遞上出現缺陷，使個體對於病毒及微生物的感染缺乏初級免疫反應 (Durbin et al., 1996; Meraz et al., 1996)，顯示 STAT1 與 STAT2 在抗外來病原的免疫反應中扮演非常重要的角色。STAT3 基因的剔除導致小鼠在胚胎發育第 7.5 天即死亡，表示 STAT3 蛋白質對於個體的發育無法被其他 14.

(29) STATs 蛋白質所取代 (Akira, 1999) ； STAT4 和 STAT6 分別傳遞 interleukin-12 (IL-12)、interleukin-13 (IL-13) 引起的訊息，同時也影響第一型和第二型協助者 T 細胞 (helper T cell) 的分化 (Kaplan et al., 1996; Takeda et al., 1996)。STAT5α 負責傳遞泌乳激素 (prolactin) 結合上細胞外蛋白的接受器因而起始訊號傳遞，並與哺乳動物乳腺組織發育及分泌乳汁功能有關 (Liu et al., 1997)。STAT5β 基因缺失的小鼠，因生長賀爾蒙的訊息傳遞路徑無法正常的傳遞，導致小鼠的生長緩慢，同時也影響自然殺. 立. 政治大. 手細胞 (natural killer cell) 的增生 (Udy et al., 1997)；而 STAT5α 與. ‧ 國. 學. STAT5β 的雙重剔除鼠則無法產生自然殺手細胞 (Igaz et al., 2001)。. y. sit. n. al. er. io. ㄧ、 STAT1. ‧. STAT1 與 STAT2 蛋白質的細胞生理功能. Nat. 第六節、. iv. STAT1 具有兩種結構異構物，分別是STAT1α與STAT1β，STAT1α蛋白 n C. hengchi U. 質由 750 胺基酸組成，其分子量為 91 kDa。STAT1β是STAT1 mRNA經過選擇性剪切 (alternative splicing) 後的產物，分子量為 84 kDa，其仍保有 Tyr 701 的位置，但缺少了C端轉錄活化區之 38 個胺基酸，因此缺乏Ser 727 的位置。STAT1β扮演抑制STAT1α的角色，會減弱並抑制STAT1α調控下游基因的能力 (O'Shea et al., 2002)。STAT1 蛋白質的N端區域包含STAT1 蛋白質第 1-135 胺基酸，主要是與其他蛋白質交互作用的位置；而胺基酸 136-317 的區域由 4 個螺旋捲曲結構 (helical coiled-coil) 所組成，此區域 15.

(30) 主要與一些重要的調控蛋白結合，例如：N-myc interacting protrein-1 (Nim-1) 會結合到STAT1 蛋白質的此區域，進而吸引CREB-binding protein (CBP) 與STAT1-Nim-1 形成複合體，增加STAT1 蛋白質調控下游基因的活性 (Zhu et al., 1999)；DNA結合區域包含胺基酸 318-488 的位置；胺基酸 577-683 為SH2 區域，此區域會與另一個磷酸化的STATs蛋白質形成雙聚體；C端轉錄活化區域位於胺基酸 684-750 之位置，會接受其他轉錄因子或共同活化因子 (co-activator) 的調控，加強STAT1 蛋白質的轉錄活性，此. 立. 政治大. 區域包含Tyr 701 的胺基酸，此胺基酸之磷酸化會促進STAT1 形成雙聚體，. ‧ 國. 學. 另外C端轉錄活化區域也包含Ser 727 的位置，此胺基酸的磷酸化則會增加. ‧. STAT1 蛋白質的轉錄活性 (Shuai et al., 1993)。STAT1 蛋白質在細胞內的. io. sit. y. Nat. 活性受到許多轉錄後修飾的調控，其中包括：磷酸化 (phosphorylation)、. er. 乙醯化 (acetylation)、泛素化(sumoylation)、甲基化 (methylation) 與硫胱. al. n. iv n C hengchi U 調控的轉錄後修飾等。當細胞受到細胞素的刺激. 氨酸蛋白酶 (caspase). 下，會促進JAK的活化並磷酸化STAT1 蛋白質 701 的位置，進而活化STAT1 蛋白質；而當細胞受到環境的壓力刺激下，會促使STAT1 蛋白質serine 727 的磷酸化，增加其轉錄的活性 (Kovarik et al., 1999)，而最近的研究指出 INF-α 會透過 Ca2+/calmodulin-dependent kinaseⅡ (CaMKⅡ) 磷酸化 STAT1 蛋白質serine 727 之位置 (Nair et al., 2002)，此外INF-α/β及INF-γ 也藉由protein kinase C-δ (PKC-δ) 來誘發STAT1 蛋白質serine 727 位置之. 16.

(31) 磷酸化 (Nguyen et al., 2001)。STAT1 蛋白質也受到組織蛋白去乙醯基酶 (histone deacetylase) 及組織蛋白乙醯轉移酶 (histone acetyltransferase) 的調控，造成lysine 410 及lysine 413 位置的乙醯化，促使STAT1 蛋白質與其他蛋白結合，例如：黑色素瘤細胞 (melanoma cell) 內乙醯化STAT1 蛋白質會與NF-κB p65 結合，並降低NF-κB蛋白質對抗細胞凋亡的能力 (Kramer et al., 2006)；此外研究指出PIAS1 蛋白質會對STAT1 蛋白質lysine 703 的位置進行類泛素化，Ungureanu等人發現，當PIAS1 對STAT1 進行. 立. 政治大. 類泛素化時，會減低STAT1 蛋白質調控下游基因的能力 (Ungureanu et al.,. ‧ 國. 學. 2003)；STAT1 蛋白的甲基化現象則發生在胺基酸arginine 31 的位置，甲. ‧. 基化會增加STAT1 與DNA結合的能力，並擴大STAT1 調控下游基因的活性. io. sit. y. Nat. (Mowen et al., 2001)；當細胞有雙股RNA (double strand RNA) 出現時，. er. 會活化硫胱氨酸蛋白酶並對STAT1 蛋白質胺基酸aspartic acid 694 的位置. al. n. iv n C hengchi U 進行剪切，去除大部分的C端轉錄活化區域，導致STAT1. 蛋白質失去轉錄. 活性，調控細胞凋亡反應 (King and Goodbourn, 1998)。STAT1 會受到許多的轉錄後修飾影響其活性，而活化的STAT1 藉由與DNA特定序列結合來調控下游基因的表現。然而在不同的上游刺激會影響STAT1 蛋白質結合到不同的DNA序列，當細胞受到INF-γ的刺激時，會促進STAT1 形成STAT1 同雙聚體或與STAT3 形成異雙聚體，並進入到細胞核內與DNA上的GAS序列結合；而INF-α或INF-β結合到細胞表面的接受體時，則會刺激STAT1 與. 17.