第二章、 實驗材料與研究方法
第七節 層黏蛋白 β1 報告基因表現量分析 (reporter gene analysis)
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acid (pH 7.4), 0.9 % NaCl, and 0.05 % Tween 20) 清洗兩次，每次 15 分
鐘。再將PVDF 膜置於含 2 % BSA 的 TBST 溶液中，室溫下搖晃 1 小時，
即可重新進行西方墨點法結合初級抗體及二級抗體。
第七節 層黏蛋白 β1 報告基因表現量分析
一、
細胞培養皿之塗抹 (coating plate)
將 poly-L-lysine (Sigma) 以 0.1 mg/ml 溶解於二次水，以 0.2 μm 過濾 器 (filter) 過濾，保存於 4 ℃。於無菌操作台 (laminar flow) 中，取適量的 poly-L-lysine 加入細胞培養皿中，均勻搖晃使其底部潤濕，靜置於無菌操作 台 30 分鐘後，將溶液從培養皿中移除，加入無菌二次水沖洗培養皿三次，
最後吸乾剩餘的溶液置於無菌操作台中，風乾培養皿，即可用於培養 PC12 細胞。
二、 活化冷凍細胞
將細胞培養液 (Hyclone, Logan, UT) 內含 5 % 胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS；Hyclone) 及 10 % 馬血清 (horse serum, HS；Invitrogen, Carlsbad, CA)，置於 37 ℃水浴槽中預熱。將冷凍管由液態氮桶中取出，
立即放入 37 ℃水浴槽中，輕搖冷凍管使其中的細胞懸浮液快速解凍，完全 融化後，吸取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入含有細胞培養液的離心管中
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(稀釋比例為 1：10~1：15)，混合均勻後以 1000 rpm 離心 3 分鐘，移除上 清液並加入細胞培養液，將細胞團塊充分打散，移至經 poly-L-lysine 處理 的培養皿中，置於 37 ℃，5 %二氧化碳之濕式培養箱中培養，隔日更換細 胞培養液。細胞活化後需數日的培養，使其細胞生長恢復正常即可進行實 驗。
三、 細胞培養
PC12 細胞以細胞培養液培養於 10 cm培養皿內，置於 37 ℃，5 %二氧 化碳之濕式培養箱中培養，細胞未達八分滿程度時，只需更換新鮮的細胞 培養液即可。培養皿中細胞超過八分滿時，或是要將其移植到 12 孔盤進行 實驗，則需進行繼代培養。實驗前先回溫細胞培養液、PBS及 0.25 % trypsin-EDTA (Invitrogen)，移除細胞培養皿中的舊培養液，加入PBS清洗 細胞培養皿，將其移除後加入 5 ml的 0.25 % trypsin-EDTA置於 37 ℃、5 % 二氧化碳之濕式培養箱中反應 7 分鐘，反應完後加入 5 ml細胞培養液至培 養皿，利用沖洗的方式將細胞團塊均勻打散並移入 15 ml離心管內，在反覆 沖洗打散細胞，以 1000 rpm離心 3 分鐘，移除上清液，加入 10 ml細胞培 養液，打散細胞團塊後，吸取 5 ml含有細胞的培養液至新的培養皿，接著 再加入細胞培養液，混合均勻後，放入 37 ℃、5 %二氧化碳之濕式培養箱 中持續培養。若要進行分殖 12 孔盤實驗，先吸取 20 μl的含有細胞之細胞 培養液，加入 20 μl的 0.4 % trypan blue (Invitrogen) 混合後，以血球計數
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盤 (hemocytometer) 計數細胞，再以 5.4 × 105 cell/ml個細胞分至每個孔 盤內。
四、 層黏蛋白 β1 報告基因表現量分析 (reporter gene analysis)
PC12 細胞培養在 12 孔盤 16~24 小時後，即可以 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 進行轉染。首先吸取 4 μl 的 Lipofectamine 2000 reagent 加至 100 μl DMEM 中，置於室溫下反應 5 分鐘；此時取 1.6 μg 質體 (1 μg flag-vector 或 STAT1-Flag vector、0.55 μg LB1 1.3kb-Luc 及 0.05 μg phRL-TK) 或 50 pmol STAT1 siRNA 與 0.6 μg 質體 (0.55 μg LB1 1.3kb-Luc 及 0.05 μg phRL-TK) 加至 100 μl DMEM 中，靜置 5 分鐘後，
與含有 Lipofectamine 2000 reagent 之 DMEM 混合均勻後，置於室溫下反 應 20 分鐘。此時將 12 孔盤內的細胞培養液移除，加入 800 μl DMEM，再 將已反應 20 分鐘的混合液加至 12 孔盤中，置於 37 ℃、5 %二氧化碳之濕 氏培養箱中作用5 小時後，移除轉染溶液加入 1 ml 細胞培養液培養 48 小 時。移除細胞培養液，以PBS 清洗兩次，加入 250 μl passive lysis buffer (Promega) 於室溫下置於平面震盪器 120 rpm 作用 10 分鐘，將細胞移到 微量離心管內，於 4 ℃、15000 rpm 進行高速離心 15 分鐘，吸取上清液至 新的微量離心管內，取出 10 μl 加入含有 50 μl LARⅡ (luciferase assay reagent Ⅱ；Promega) 的偵測管中，利用 Luminescence counter (Turner Designs Hydrocarbon Instruments, CA) 測定各個樣品中 firefly luciferase
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的螢光強度。接著加入 50 μl Stop＆Glo reagent (Promega)，偵測 phRG-TK 質體產生 renilla luciferase 的螢光強度。LB1 1.3kb-Luc 質體帶有 luciferase 基因，當轉錄因子結合到 LB1 啟動子區域會增加啟動子的活性，製造出 luciferase 蛋白質，因此藉由偵測報告基因的 luciferase 的強度來顯示 LB1 啟動子活化的程度。一般做為報告基因的 luciferase 是來自螢火蟲的基因，
這 種 生 物 性 冷 光 具 有 高 敏 感 度 、 穩 定 性 及 低 背 景 的 優 點 ， 除 了 測 量 luciferase 基因的表現外，同時利用 renilla luciferase (phRL-TK) 做為對照 組內標準 (internal control)，以增加測量的精準度。
五、
冷凍保存細胞
將胎牛血清置於 37 ℃水浴槽預熱，同時將 PC12 細胞由培養皿中移至離心 管，離心後去除上清液，以胎牛血清將細胞打散，再加入 10% DMSO (Sigma) 混合均勻，並以 1 ml 每管分裝至冷凍保存管，立即放置在-20 ℃冷凍庫中，
等待 1~2 小時後再移至-80 ℃冷凍庫中保存 16~18 小時，最後移置液態氮 桶內，永久保存。