第三章、 結果
第五節 海馬迴 CA1 區域轉染 STAT1 siRNA 會抑制 laminin β1 的表現
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第五節 海馬迴
CA1 區域轉染 STAT1 siRNA 會抑制 laminin β1 的表現
在先前laminin β1 報導基因的結果顯示，STAT1 促進laminin β1 啟動子 的轉錄活性，顯示STAT1 調控laminin β1 的表現。而爲了確認在大白鼠的 海馬迴CA1 區域中，STAT1 是否調控laminin β1 的表現，實驗將埋管完的 動物分為兩組，(1) 控制組：大白鼠轉染negative siRNA (n=7)；(2) 實驗 組：大白鼠轉染STAT1 siRNA (n=7) 均以微量注射幫浦轉染至海馬迴CA1區域，經過60 小時後進行水迷津試驗，試驗完成後進行斷頭犧牲並取出一 邊的海馬迴CA1 區域組織，以即時定量聚合酶連鎖反應進行分析。結果顯 示，STAT1 siRNA顯著減少laminin β1 mRNA的表現 (t1,12= 3.50, p＜
0.01；圖 7A)。此外，實驗將另一邊的海馬迴CA1 組織進行STAT1 DNA 結 合試驗 (STAT1 DNA binding assay, 2 GAS DNA探針) 與西方墨點法分 析。結果顯示，動物轉染STAT1 siRNA顯著降低STAT1 表現量 (t1,12= 11.18, p＜0.01；圖 7C) 與STAT1 對於GAS探針的結合能力 (t1,12= 4.17, p＜
0.01；圖 7D)，同時轉染STAT1 siRNA會顯著的降低laminin β1 蛋白質的表 現量 (t1,12= 8.40, p＜0.01；圖 7E)。經由上述的實驗證實，海馬迴CA1 區 域內的laminin β1 的表現量受控於STAT1 表現量的改變。
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圖 7、海馬迴 CA1 區域轉染 STAT1 siRNA 會降低 STAT1 與 GAS 序列的 結合能力及降低 laminin β1 的表現。大白鼠海馬迴 CA1 區域分別轉染 STAT1 siRNA 與 negative siRNA，經 60 小時轉染後進行水迷津試驗，試 驗完成後將海馬迴CA1 組織進行進行即時定量聚合酶連鎖反應與西方墨點 法分析。(A) 即時定量聚合酶連鎖反應顯示，STAT1 siRNA 顯著降低 laminin β1 mRNA 的表現量 (p＜0.01, Student’s t-test)。(B) 西方墨點法結果顯示
當 (C) STAT1 表現量受到動物轉染 STAT1 siRNA 的抑制，(D) 同時會減低 STAT1 與 GAS 探針的結合能力 (p＜0.01, Student’s t-test)，並由量化結果 得知 (E) laminin β1 蛋白質的表現受到 STAT1 siRNA 的抑制 (p＜0.01, Student’s t-test)。實驗結果 (A) (C) (D) (E) 分別來自 7 隻轉染 negative siRNA 與 7 隻轉染 STAT1 siRNA 的大白鼠，實驗數值以 mean±SEM 表示；
**, p＜0.01 (Student’s t-test)。LB1：laminin β1, GAS：interferon-γ activated site。
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第六節 海馬迴轉染野生型 STAT1 會促進 laminin β1 的表現
實驗結果得知海馬迴CA1 區域內STAT1 表現量減少會降低STAT1 與 GAS序列的結合能力及laminin β1 蛋白質的表現 (圖 7)。反之，增加海馬 迴CA1 區域內STAT1 表現是否會增加laminin β1 mRNA與蛋白質的表現？
實驗將動物分為兩組，(1) 控制組：大白鼠轉染Flag vector (n=7)；(2) 實 驗組：大白鼠轉染STAT1-Flag (n=7)，實驗以微量注射幫浦將質體轉染至海 馬迴CA1 區域，經 60 小時轉染後進行水迷津試驗，試驗完成後取出一邊海 馬迴CA1 組織進行即時定量聚合酶連鎖反應，另一邊的組織則進行西方墨 點法分析。結果顯示，STAT1-Flag顯著增加laminin β1 mRNA的表現於即 時定量聚合酶連鎖反應 (t1,12= 3.44, p＜0.01；圖 8A)。在西方墨點法的結 果顯示，動物轉染STAT1-Flag會顯著增加STAT1 與GAS序列結合的能力 (t1,12= 4.34, p＜0.01；圖 8C) 與laminin β1 蛋白質的表現 (t1,12= 7.00, p＜
0.01；圖 8D)。經由圖 8 與上述的結果顯示，STAT1 調控laminin β1 蛋白 質的表現。
爲確認 STAT1-Flag 質體基因是否確實轉染至海馬迴 CA1 區域，實驗 利用免疫組織化學染色法，偵測帶有標誌蛋白 Flag 的 STAT1 蛋白質，如 圖 8E 所示，轉染 STAT1-Flag 質體基因的大白鼠，其海馬迴 CA1 區域有 專一性的綠色螢光標示，顯示 STAT1-Flag 質體基因成功轉染至海馬迴 CA1 區域。
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圖 8、海馬迴 CA1 區域轉染 STAT1-Flag 會促進 STAT1 與 GAS 序列的結 合能力與laminin β1 蛋白質的表現。海馬迴 CA1 區域分別轉染 STAT1-Flag 與 Flag vector 並於 60 小時後進行水迷津試驗，試驗完成後將海馬迴 CA1 組織進行即時定量聚合酶連鎖反應與西方墨點法分析，(A) 即時定量聚合酶 連鎖反應顯示，動物轉染STAT1-Flag 會顯著增加 laminin β1 mRNA 表現 (p
＜0.01, Student’s t-test)。而在 (B) 西方墨點法結果顯示，當 STAT1 表現 量增加時，(C) 會顯著的促進 STAT1 與 GAS 探針的結合能力 (p＜0.01, Student’s t-test)。(D) 動物轉染 STAT1-Flag 會顯著的增加 laminin β1 蛋白 質的表現 (p＜0.01, Student’s t-test)。此外，(E) 利用免疫組織化學染色法 偵測 STAT1-Flag 質體轉染現象，上述箭頭所指處為海馬迴 CA1 區域，綠 色螢光代表STAT1-Flag 質體確實轉染至海馬迴 CA1 區域。實驗結果 (A) (C) (D) 分別來自 7 隻轉染 Flag vector 與 7 隻轉染 STAT1-Flag 的大白鼠，實 驗數值以 mean±SEM 表示；**, p＜0.01 (Student’s t-test)。LB1：laminin β1。