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第四章、討論
長久以來，科學家對於 STATs 蛋白在中樞神經可塑性與學習記憶上所 扮演的角色並不清楚。STATs 蛋白為訊息傳遞轉錄因子，過去文獻發現有 7 種不同的 STATs 蛋白，不同的 STATs 蛋白具有不同的細胞生理功能，受到 細胞訊息的調控也不盡相同。STAT1 是第一個被發現的 STATs 蛋白，在免 疫系統扮演著抗病原的角色，當生物體受到外來病原入侵時，免疫相關細 胞會分泌細胞素，進而促使 STAT1 蛋白磷酸化並進入細胞核內，促進抗病 毒相關的基因表現 (Horvath and Darnell, 1996)。而在中樞神經系統 (central nervous system, CNS) 中，STAT1 會促進下游免疫相關基因的表 現，如主要組織相容性複合物 (major histocompatibility complex, MHC) 基 因群，進而調控大腦內的免疫反應 (Gobin et al., 2001)。然而 STAT1 是否
參與大腦在學習與記憶的訊息傳遞，目前為止並沒有任何的相關文獻，很 值得我們進ㄧ步探討。
本論文證實經水迷津試驗訓練的大白鼠，其海馬迴內STAT1 表現量會
顯著的低於沒有訓練的組別，但在杏仁核與紋狀體的表現量則無差異。然 而經水迷津訓練後，STAT2 mRNA與蛋白質的表現量並無變化，證實大白 鼠在水迷津訓練下，只會影響海馬迴CA1 區域內STAT1 表現，且具有組織 專一性。海馬迴CA1 區域是參與空間記憶重要的腦區 (Moser et al., 1995)，前人研究指出，外界環境的刺激會促進細胞型態的改變、突觸的可
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塑性與學習記憶的形成 (Kim and Yoon, 1998; de Kloet et al., 1999)，而在
本論文中，水迷津訓練促使海馬迴接受空間線索與探索平台位置的刺激，
進而減少STAT1 mRNA與蛋白質的表現量，或許藉由其表現量的減少改變
神經細胞的可塑性，影響大白鼠空間記憶的形成。然而爲何大白鼠在水迷 津訓練的刺激下，會降低STAT1 mRNA與蛋白質的表現量？過去文獻指 出，大腦受到外界空間視覺線索的刺激，會促使海馬迴區域的位置細胞 (place cell) 產生動作電位 (O'Keefe and Dostrovsky, 1971)，而神經細胞
動 作 電 位 的 產 生 會 活 化 突 觸 上 的 接 受 體 ， 如N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) 接受體與α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) 接受體，導致細胞外Ca2+的流入，同時訊息傳導物質會因而活化，
如adenylyl cyclase受到Ca2+濃度的上升而活化進而促使cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 的產生 (Roth and Sweatt, 2008)；此外，有文獻 指出大白鼠經過抑制性躲避學習 (inhibitory avoidance learning task) 的訓 練，其海馬迴區域內cAMP濃度顯著的上升 (Bernabeu et al., 1997)，顯示 動物受到學習刺激可能會促使海馬迴區域cAMP濃度的改變。然而海馬迴 CA1 區域內cAMP濃度的改變是否會影響到STAT1 的表現？過去文獻指出
在單核細胞 (mononuclear cell)中，植物血凝素 (phytohaemagglutinin, PHA) 會促進STAT1 mRNA與蛋白質的表現，但加入cAMP則會抑制這個現 象 (Ivashkiv et al., 1996)，顯示cAMP可能扮演著阻礙STAT1 表現的角色。
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而在本論文的水迷津訓練中，大白鼠歷經四天的空間學習訓練，是否會活 化NMDA接受體或AMPA接受體，促使細胞外Ca2+的流入進而促進海馬迴 CA1 區域內cAMP濃度的上升，因而負向調控STAT1 mRNA與蛋白質的表 現，仍需更進一步的實驗證實。
爲了進ㄧ步確認STAT1與STAT2在空間學習所扮演的角色，水迷津實驗 利用STAT1 siRNA與STAT2 siRNA抑制大白鼠海馬迴CA1區域STAT1及 STAT2蛋白質的表現，結果顯示減少STAT1的表現會促進大白鼠的空間學 習與記憶，然而減少STAT2的表現並不影響空間記憶的形成。STAT2已知 與中樞神經系統的免疫反應有關，文獻指出，動物海馬迴區域受傷時，星 狀神經膠細胞會活化 NF-κB 增加 STAT2 與趨化因子-2 (chemokine ligand 2, CCL-2) 的表現，促使白血球移往受傷的區域，引發免疫相關的反
應 (Khorooshi et al., 2008) ； 此 外 ， 中 樞 神 經 系 統 受 到 lymphocytic choriomeningitis virus 入侵時，神經膠細胞分泌的干擾素-α (INF-α) 會活 化STAT2而增加干擾素調控因子 (interferon regulatory factor) 的表現，進 而抵抗外來的病原 (Ousman et al., 2005)。很顯然地，在大腦及海馬迴的 STAT2表現主要與腦部傷害和外來病源引起的免疫反應相關，與本論文証 實STAT2不參與大白鼠海馬迴CA1區域空間記憶的形成相符合。目前為止 並不完全瞭解形成記憶的過程中需要那些蛋白質的參與，但從水迷津試驗 的結果顯示，轉染STAT1 siRNA於海馬迴CA1區域會使STAT1蛋白質表現
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量的減低，進而顯著的促進大白鼠在水迷津試驗尋找到平台的能力，代表 STAT1在海馬迴CA1區域中扮演著抑制記憶形成的角色。由於STAT1是轉錄
因子，可能藉由影響訊息傳導路徑或調控某些基因的表現而阻礙下游負責 記憶穩固的訊息傳遞路徑。
然而STAT1抑制大白鼠在空間記憶的學習能力是否與其調控下游基因 表現有關？過去文獻指出，神經細胞受到創傷時，會促使微神經膠細胞 (microglia) 分泌細胞素至神經細胞，星狀神經膠細胞接受細胞素的刺激會 促進細胞外基質 (extracellular matrix) 的表現並分泌至細胞外，這些細胞 外基質包括: N-cadherin、laminin等 (Liesi et al., 1984; Neugebauer et al., 1988)，細胞外基質的表現有助於受傷神經細胞軸突的生長 (Wujek et al., 1990)。前人研究指出，在初級星狀神經膠細胞中加入介白素-6 (interlukin-6, IL-6) 會增加laminin的表現 (Gris et al., 2007)，而介白素-6會透過活化 STAT1、STAT3等蛋白質影響下游基因的表現 (Heinrich et al., 1998)，顯 示STAT1與STAT3可能參與調控laminin的訊息傳遞。laminin為α、β、γ鏈 所組成的三聚體結構，目前發現具有15種以上的laminin，而不同的α、β、
γ鏈表現的時間、組織位置都不盡相同，其中laminin β1為laminin β家族的 其中ㄧ員，之前文獻發現laminin β1主要表現在海馬迴及紋狀體中 (Sharif et al., 2004)。而本實驗室於最近發現在大白鼠海馬迴CA1區域，laminin β1 會減低ERK1/2的活性進而抑制SGK Ser422的磷酸化，阻礙大白鼠空間記
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憶的形成，證實laminin β1在海馬迴CA1區域中扮演著抑制記憶形成的角色 (unpublished observation)。此外，在基因序列分析中發現，laminin β1啟
動 子 具 有specificity protein 1 (SP1) 、 adipocyte fatty binding protein (AP2)、interferon-gamma activated site (GAS) 及糖皮質素(Glucocorticoid) 等轉錄因子的結合位置 (binding site)。目前已知STAT1會結合到GAS序列 促進下游基因的表現，而在圖6的laminin β1報導基因實驗中證實，STAT1 會促進laminin β1 1.3 kb長度啟動子的轉錄活性，但STAT1促進轉錄的效果 並不太明顯，可能原因是 (1) PC12細胞的轉染效率較低的緣故，導致減弱 STAT1 siRNA與STAT1-Flag所引起STAT1表現量的改變，降低STAT1調控 laminin β1啟動子轉錄活性的能力。(2) STAT1也可能促進其他蛋白質的表 現，而這些蛋白質可能間接抑制laminin β1 1.3 kb啟動子的轉錄活性。但是
否 有 上 述 的 現 象 發 生 ， 仍 待 更 進 一 步 的 實 驗 探 討 。(3) STAT1可能以 STAT1/STAT3異聚體的形式調控laminin β1啟動子的轉錄活性，因此可能需 要同時增加STAT1與STAT3的表現量，才能有效的促進laminin β1啟動子的 轉錄活性，但是否有上述的現象發生，仍有待實驗證實。
本論文於圖7、8的動物實驗證實，在大白鼠的海馬迴CA1區域中STAT1 正向調控laminin β1 mRNA與蛋白質的表現，顯示laminin β1關聯到STAT1 抑制空間學習記憶的形成，然而於圖8中，STAT1-Flag促進laminin β1 mRNA表現的能力卻不如蛋白質明顯，原因可能是laminin β1 mRNA一旦表
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現後可能立即被送至內質網，轉譯成laminin β1蛋白質，導致STAT1-Flag 促進mRNA的表現能力不如蛋白質明顯，但是否有上述現象的發生，仍需
進一步的實驗探討。然而STAT1是藉由形成STAT1同雙聚體或STAT1、
STAT3異雙聚體的形式調控laminin β1基因？目前已知除了STAT1/STAT1 聚體，STAT1/STAT3聚體與STAT3/STAT3聚體也會結合到GAS序列調控下
由 基 因 的 表 現 ， 但 本 論 文 實 驗 中 並 未 排 除STAT3會與STAT1共同調控 laminin β1的表現。此外，本實驗室初步研究結果發現，大白鼠經水迷津試
驗 會 減 低 海 馬 迴 CA1 區 域 的 STAT3 蛋 白 質 的 表 現 (unpublished observation, 附 錄 一 ) ， 而 空 間 學 習 訓 練 會 降 低 laminin β1 的 表 現 量 (unpublished observation, 附錄二)，其可能原因除了STAT1表現量的降 低，STAT3表現量的減少也可能是導致laminin β1表現量降低的原因之ㄧ，
顯示STAT1/STAT3異雙聚體調控laminin β1表現的可能性，但是否上述的現 象發生，仍需更進一步的實驗探討。
本篇論文發現，在海馬迴CA1 區域STAT1 調控laminin β1 的表現，可 能關聯到STAT1 抑制空間學習記憶的形成。在中樞神經系統中，STAT1 蛋 白質調節下游基因的表現受到許多細胞素的調控，包括INF-γ、INF-α與 INF-β等，其中INF-γ會透過INF-γ接受體磷酸化STAT1 蛋白質tyrosine 701 位置，促使STAT1 形成雙聚體調節下游基因表現，INF-γ對於中樞神經的退 化性疾病扮演著重要的角色，其會引起髓鞘的萎縮，而導致多發性硬化症
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(Multiple Sclerosis) 的產生 (Sanders and De Keyser, 2007)。文獻指出，
INF-γ接受體在中樞神經系統中會與AMPA接受體形成複合體，一旦神經細 胞受到INF-γ的刺激時，會藉由JAK1、JAK2-STAT1 訊息傳遞路徑活化蛋白 質激酶A (protein kinase A, PKA)，進而磷酸化AMPA接受體上serine 845 的位置，活化的AMPA接受體並促進細胞外鈣離子的流入，引起神經細胞的
過度興奮性毒性 (excitotoxicity) 導致神經細胞的死亡 (Mizuno et al., 2008)。Cho等學者發現在星狀神經膠細胞中，干擾素-γ會活化STAT1 蛋白 質促進BACE1 基因的表現，加速貝它類澱粉蛋白 (β-amyloid, Aβ) 的產生 (Cho et al., 2007)。此外，文獻指出與晚發型阿滋海默氏症相關的蛋白質 apolipoproteinE (ApoE)，其起動子上亦具有STAT1 蛋白質的結合序列 (Lahiri, 2004)，顯示ApoE基因可能受到STAT1 的調控而影響記憶的形成。
綜合上述的研究，在中樞神經系統中STAT1 可藉由調節細胞內的訊息傳遞
及調控下游基因的表現抑制學習與記憶的產生。另一方面，有研究發現 STAT1 具有抵抗腦部病變的能力。腦部在INF-α異常時會促使 STAT1 與 STAT2 形成異雙具體並結合到ISRE，調控下游基因的表現，減緩因為INF-α 過多所引發的腦部病變 (Wang et al., 2002)。
除了細胞外訊息會調控STAT1的轉錄能力，細胞內許多轉譯後修飾 (post-translational modification) 蛋白亦會調控STAT1的活性，例如: PIAS1 (protein inhibitor of activated STAT1) 會與STAT1結合進而降低STAT1與
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DNA結合的能力 (Rogers et al., 2003)。在本實驗室先前的研究中發現，在 水迷津訓練過程中，會增加PIAS1的表現量，並證實PIAS1藉由抑制STAT1 Y701的磷酸化促進大白鼠空間記憶的形成，顯示STAT1的活化會降低大白
鼠長期記憶的形成 (unpublished observation)。本篇論文的結果更證實 STAT1在大白鼠海馬迴CA1區域中扮演著抑制記憶形成的角色。除了磷酸
鼠長期記憶的形成 (unpublished observation)。本篇論文的結果更證實 STAT1在大白鼠海馬迴CA1區域中扮演著抑制記憶形成的角色。除了磷酸