第二章、 實驗材料與研究方法
第五節 即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time polymerase chain
四、 即時定量聚合酶連鎖反應 (real-time polymerase chain reaction,
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置於65 ℃下反應 10 分鐘後，置於冰上 2 分鐘，再加入由 4 μl 5X transcriptor reaction buffer、0.5 ul protector RNase inhibitor (Roche, Germany)、2 μl dNTP-Mix 及 0.5 μl transcriptor reverse transcriptase (Roche) 配製成的反
轉錄酵素反應溶液混合均勻後，置於 55 ℃反應 30 分鐘，85 ℃反應 5 分鐘 即完成反轉錄酵素反應。即可保存於-20 ℃冰箱或進行即時定量聚合酶連鎖 反應實驗。
四、 即時定量聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction,
real time-PCR)
實驗使用SYBR Green螢光染劑方法，當PCR的產物越多時此螢光物質 嵌入DNA的含量會越多，可藉由儀器偵測螢光的強度而回推計算出預偵測
基因的表現量。反應為加入 10 μl 2X Power SYBR Green master mix (Fermentas, Burlington, Canada)、0.4 μl 10 uM forward和reverse引子 (本
實驗所使用的引子如下：STAT1-F：5’- AGA GCA TGA AAT CAA GAC CCT A -3’, STAT1-R：5’- TCT GAG TGA GCT CGA TGG A -3’, STAT2-F：5’- CCA CTC CGC TTC CTC TAT CC -3’, STAT2-R：5’- CAG CTC GTC CAC CTG TCT GT -3’, laminin β1-F：5’- CCG GGC TCA AGA TAC GTT GT -3’, laminin β1-R: 5’- AAC CGC ACG GTG TAG TTC ATC -3’, HPRT-F：5’- GCC GAC CGG TTC TGT CAT -3’, HPRT-R：5’- TCA TAA CCT GGT TCA TCA TCA CTA ATC -3’) 並加二次水至 11.8 μl，充分混合均勻並利用離心機
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離心後，加入 96 孔盤內，再加入 8.2 μl濃度 0.1 μg/μl之cDNA模板，並利 用震盪器混合均勻；以 7500 Real-time PCR system (Applied Biosystem, USA) 進行分析；實驗反應條件如下：50 ℃2分鐘，95 ℃ 15分鐘，95 ℃ 15 秒與 60 ℃1分鐘 (共 40 cycles)，最後置於 4 ℃。當螢光強度達到一定 值時，機器會記錄下此時的cycle數值，即為Ct值。Ct值的高低呈現基因表
現 量 的 多 寡 ， 並 以 HPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) 做為內標準對照 (internal control)，以增加測
量 的 精 準 度 。 基 因 表 現 量 以△△Ct進 行 計 算 (Livak and Schmittgen, 2001)，將待測基因的Ct值減HPRT的Ct值，即為△Ct；再以△Ct減去控制
組的△Ct即得到△△Ct，將△△Ct帶入 2-△△Ct公式後所得數值高低即代表 基因表現量的多寡，並以Sigma STAT 2.03 進行統計分析。
第六節 西方墨點法 (western blot) 一、 萃取腦組織蛋白質
製備含有蛋白質抑制劑 (protease inhibitor；Roche, Germany) 及磷酸
酶 抑 制 劑 (phosphatase inhibitor ； Roche, Germany) 的 RIPA (radio-immunoprotein assay) lysis buffer，其組成成份包含 50 mM Tris-HCl (PH8.0)、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1 % NP-40。將配置好的緩衝溶液 混合均勻後，加入待磨碎的樣本組織，於低溫環境下利用超音波震盪器 (sonifier/cell disruptor, Branson Sonic Power, USA) 將組織打碎均質化。
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其條件如下 : 使用震盪器的小型探針 (micro probe)，輸出強度 (output control) 第三級，效能 (duty cycle) 為 30 %，震盪 4 次，每次 5 秒，間隔 休息 10 秒。將震碎的均質溶液以 4 ℃ 14000 rpm高速離心10 分鐘，去除 細胞殘骸，吸取上清液至新的 1.5 ml離心管，並取出少量的組織均質液來 測定蛋白質濃度。
二、 蛋白質濃度測定法
測定蛋白質濃度採用 Bradford 的方式 (Bradford, 1976)，利用酸性染劑 (Coomassie Brilliant Blue G-250 ； Bio-Rad Protein Assay ； Bio-Rad, Hercules, CA) 與蛋白質結合時吸光值會從 465 nm 轉移到 595 nm 的特 性，進而測定蛋白質濃度。首先將酸性染劑經 5 倍稀釋，取 2 μl 樣本均質 液加入 998 μl 的酸性染劑稀釋液，以分光光度計 595 nm 波長測定吸光值。
利用濃度 2、4、6、8、10 μg/μl 之胎牛血清白蛋白作出標準濃度曲線，以 測定樣本中蛋白質的濃度。
三、 免疫沉澱反應 (immunoprecipitation, IP)
大白鼠海馬迴 CA1 區域經蛋白質萃取後，取 400 μg 蛋白質加入 PBS 配製成400 μg/μl，爲了避免非專一性的結合，實驗先加入 30 μl 50 % protein A agarose (Millipore, Billerica, MA) 去除非專一性結合，於 4 ℃以旋轉器旋 轉 3 小時，再以高速離心 14000 rpm 離心 1 分鐘，將上清液移至新的離心
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管即可進行免疫沉澱反應。接著加入各種所要進行免疫沉澱的抗體，包括 anti-STAT1 (5 μg；Upstate, Billerica, MA) 或 anti-Flag (5 μg；Sigma)，
於 4 ℃下以旋轉器旋轉 16 小時，再加入 30 μl 50 % protein A agarose 於 4
℃下旋轉 3 小時，以形成免疫複合體。接著進行高速離心 14000 rpm 離心 1 分鐘，將免疫複合體離心下來，以 PBS 清洗三次，最後加入等體積之兩 倍 loading dye，置於 95 ℃加熱板加熱 5 分鐘，最後進行西方墨點法。
四、
STAT1 DNA 結合試驗 (STAT1 DNA binding assay)
在進行DNA結合試驗前，需先製備 2X GAS (interferon-γ activation site, 序列：TTCN2-4GAA) 探針，置備的過程如下：首先將sense引子：5’- GAG ACT CAG TTT CCC GTA AAT CGT CCA GTT TCC CGT AAA GAC TAT GC -3’、antisense引子：5’- GCA TAG TCT TTA CGG GAA ACT GGA CGA TTT ACG GGA AAC TGA GTC TC -3’以二次水配製成 100 μM，各取 10 μl
並加入 80 μl annealing buffer (10 mM Tris；PH 7.5、50 mM NaCl、1 mM EDTA) 均勻混合，置於在已預熱至 95 ℃的加熱板上，在自然情況下讓其
自動降至室溫，約需 3 小時，即可進行STAT1 DNA結合試驗，若不立刻進 行反應亦可存放於 -20 ℃冰箱。
取 400 μg 腦組織蛋白質樣本，加入 6 μl 2 GAS 探針、4 μl poly dI-dC (poly deoxyinosinic- deoxycytidylic acid sodiu salt, 0.5 μM；Sigma) 及 40 μl 50 % glycerol，最後以 PBS 加至 400 μl 並將其混合均勻後，置於 4 ℃
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下以旋轉器旋轉 16 小時，之後再加入 10 μl avidin agarose (Sigma) 至混 合液中，置於 4 ℃下以旋轉器旋轉 3 小時，接著利用離心機 1000 g 離心 2 分鐘，去除上清液，加入 600 μl PBS 反覆搖晃清洗兩次，阻斷非特異性的 結合，加入等體積的兩倍 loading dye 於 95 ℃的加熱版加熱 5 分鐘，即可 進行西方墨點法。在細胞生理環境中，STAT1 活化後形成的雙聚體會與 GAS 探針結合，為了純化結合至 GAS 序列的 STAT1，我們將 GAS 探針的 sense 5’端接上 biotin 的化學修飾，藉由 avidin 與 biotin-GAS 之間的高度親和力，
利用離心純化出與 GAS 序列結合的 STAT1。
五、 西方墨點法
蛋白質樣本經定量後，加入五倍量的 loading dye (Tris-HCL 0.25 M (PH 6.8), 0.5 M DTT, SDS 10 %, 0.5 % bromophenol blue, 50 % glycerol) 並 以二次水將濃度配成 2 μg/μl 的蛋白質溶液，置於 95 ℃加熱板加熱 10 分 鐘。將配好的蛋白質溶液以等體積加入 8 %的 SDS-PAGE 膠片孔中，加入 電緩衝溶液 (running buffer)，其成份為 25 mM Tris (PH 8.3)、192 mM glycine、0.1 % SDS，每一片膠以固定電流 30 mA 分離不同分子量的蛋白 質。進行完電泳後，在使用濕氏轉漬槽 (Bio-Rad) 將膠上蛋白質轉漬於 PVDF (Poly-vinylidene difluoride membrane；Millipore) 膜上，加入轉漬 緩衝溶液 (transfer buffer)，其成份含 25 mM Tris、192 mM glycine、15 % methanol，以固定電壓 100 V 反應 70 分鐘。在進行轉漬前須將 PVDF 浸
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泡在甲醇 (methanol) 中 15 秒，並以去離子水清洗 1 分鐘後，最後浸泡於 轉漬緩衝溶液中數分鐘方可進行轉漬。
轉漬完成後，將 PVDF 膜置於含 2 % BSA 的 TBST (25 mM Tris (PH 8.0), 150 mM NaCl, 0.05 % Tween-20) 溶液中，室溫下搖晃 1 小時，阻斷 非特性的結合。接著加入初級抗體於 4 ℃冷房中反應 16 小時或室溫下 1 小 時。初級抗體包含 rabbit anti-STAT1 antibody (1：2000, Upstate)、rabbit anti-STAT2 antibody (1：2000, Santa Cruz Biotechnology, USA)、mouse anti-laminin β1 antibody (1：500, Santa Cruz Biotechnology)、mouse anti-β actin (1：400000, Chemicon, USA)。初級抗體作用完後以 0.1 % TBST 清洗三次，每次 10 分鐘，加入接有 HRP 之二級抗體 (anti-rabbit or anti-mouse IgG conjugated to horseradish peroxidase；Chemicon, USA)
室溫反應 1 小時，再以 0.1 % TBST 清洗三次，每次 10 分鐘，即可加入化 學冷光試劑 (Chemiluminescence HRP substrate；Milipore) 進行反應，
並使用富士冷光影像分析系統LAS-3000 (Fujifilm, Japan) 進行 PVDF 上的 影像呈色與擷取。存取之影像以 NIH Image J 軟體進行量化分析，再以 Sigma STAT 2.03 進行統計分析。
同一張 PVDF 膜需要重複使用不同的抗體進行反應時，以 stripping buffer (0.2 M glycine (pH 2.5), 150 mM NaCl, 0.05 % Tween-20)，於 80 ℃ 下作用 20 分鐘，去除原先結合之抗體，並使用 rinse buffer (0.09 M boric
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acid (pH 7.4), 0.9 % NaCl, and 0.05 % Tween 20) 清洗兩次，每次 15 分
鐘。再將PVDF 膜置於含 2 % BSA 的 TBST 溶液中，室溫下搖晃 1 小時，
即可重新進行西方墨點法結合初級抗體及二級抗體。
第七節 層黏蛋白 β1 報告基因表現量分析
一、
細胞培養皿之塗抹 (coating plate)
將 poly-L-lysine (Sigma) 以 0.1 mg/ml 溶解於二次水，以 0.2 μm 過濾 器 (filter) 過濾，保存於 4 ℃。於無菌操作台 (laminar flow) 中，取適量的 poly-L-lysine 加入細胞培養皿中，均勻搖晃使其底部潤濕，靜置於無菌操作 台 30 分鐘後，將溶液從培養皿中移除，加入無菌二次水沖洗培養皿三次，
最後吸乾剩餘的溶液置於無菌操作台中，風乾培養皿，即可用於培養 PC12 細胞。
二、 活化冷凍細胞
將細胞培養液 (Hyclone, Logan, UT) 內含 5 % 胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS；Hyclone) 及 10 % 馬血清 (horse serum, HS；Invitrogen, Carlsbad, CA)，置於 37 ℃水浴槽中預熱。將冷凍管由液態氮桶中取出，
立即放入 37 ℃水浴槽中，輕搖冷凍管使其中的細胞懸浮液快速解凍，完全 融化後，吸取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入含有細胞培養液的離心管中
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(稀釋比例為 1：10~1：15)，混合均勻後以 1000 rpm 離心 3 分鐘，移除上 清液並加入細胞培養液，將細胞團塊充分打散，移至經 poly-L-lysine 處理 的培養皿中，置於 37 ℃，5 %二氧化碳之濕式培養箱中培養，隔日更換細 胞培養液。細胞活化後需數日的培養，使其細胞生長恢復正常即可進行實 驗。
三、 細胞培養
PC12 細胞以細胞培養液培養於 10 cm培養皿內，置於 37 ℃，5 %二氧 化碳之濕式培養箱中培養，細胞未達八分滿程度時，只需更換新鮮的細胞 培養液即可。培養皿中細胞超過八分滿時，或是要將其移植到 12 孔盤進行 實驗，則需進行繼代培養。實驗前先回溫細胞培養液、PBS及 0.25 % trypsin-EDTA (Invitrogen)，移除細胞培養皿中的舊培養液，加入PBS清洗 細胞培養皿，將其移除後加入 5 ml的 0.25 % trypsin-EDTA置於 37 ℃、5 % 二氧化碳之濕式培養箱中反應 7 分鐘，反應完後加入 5 ml細胞培養液至培 養皿，利用沖洗的方式將細胞團塊均勻打散並移入 15 ml離心管內，在反覆 沖洗打散細胞，以 1000 rpm離心 3 分鐘，移除上清液，加入 10 ml細胞培 養液，打散細胞團塊後，吸取 5 ml含有細胞的培養液至新的培養皿，接著 再加入細胞培養液，混合均勻後，放入 37 ℃、5 %二氧化碳之濕式培養箱 中持續培養。若要進行分殖 12 孔盤實驗，先吸取 20 μl的含有細胞之細胞 培養液，加入 20 μl的 0.4 % trypan blue (Invitrogen) 混合後，以血球計數
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盤 (hemocytometer) 計數細胞，再以 5.4 × 105 cell/ml個細胞分至每個孔 盤內。
四、 層黏蛋白 β1 報告基因表現量分析 (reporter gene analysis)
PC12 細胞培養在 12 孔盤 16~24 小時後，即可以 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 進行轉染。首先吸取 4 μl 的 Lipofectamine 2000 reagent 加至 100 μl DMEM 中，置於室溫下反應 5 分鐘；此時取 1.6 μg 質體 (1 μg flag-vector 或 STAT1-Flag vector、0.55 μg LB1 1.3kb-Luc 及 0.05 μg phRL-TK) 或 50 pmol STAT1 siRNA 與 0.6 μg 質體 (0.55 μg LB1 1.3kb-Luc 及 0.05 μg phRL-TK) 加至 100 μl DMEM 中，靜置 5 分鐘後，
與含有 Lipofectamine 2000 reagent 之 DMEM 混合均勻後，置於室溫下反 應 20 分鐘。此時將 12 孔盤內的細胞培養液移除，加入 800 μl DMEM，再 將已反應 20 分鐘的混合液加至 12 孔盤中，置於 37 ℃、5 %二氧化碳之濕 氏培養箱中作用5 小時後，移除轉染溶液加入 1 ml 細胞培養液培養 48 小 時。移除細胞培養液，以PBS 清洗兩次，加入 250 μl passive lysis buffer (Promega) 於室溫下置於平面震盪器 120 rpm 作用 10 分鐘，將細胞移到 微量離心管內，於 4 ℃、15000 rpm 進行高速離心 15 分鐘，吸取上清液至 新的微量離心管內，取出 10 μl 加入含有 50 μl LARⅡ (luciferase assay reagent Ⅱ；Promega) 的偵測管中，利用 Luminescence counter (Turner Designs Hydrocarbon Instruments, CA) 測定各個樣品中 firefly luciferase
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的螢光強度。接著加入 50 μl Stop＆Glo reagent (Promega)，偵測 phRG-TK 質體產生 renilla luciferase 的螢光強度。LB1 1.3kb-Luc 質體帶有 luciferase 基因，當轉錄因子結合到 LB1 啟動子區域會增加啟動子的活性，製造出 luciferase 蛋白質，因此藉由偵測報告基因的 luciferase 的強度來顯示 LB1 啟動子活化的程度。一般做為報告基因的 luciferase 是來自螢火蟲的基因，
這 種 生 物 性 冷 光 具 有 高 敏 感 度 、 穩 定 性 及 低 背 景 的 優 點 ， 除 了 測 量 luciferase 基因的表現外，同時利用 renilla luciferase (phRL-TK) 做為對照
這 種 生 物 性 冷 光 具 有 高 敏 感 度 、 穩 定 性 及 低 背 景 的 優 點 ， 除 了 測 量 luciferase 基因的表現外，同時利用 renilla luciferase (phRL-TK) 做為對照