海馬迴內質體基因轉染 (transfection) 或藥物注射

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本實驗選用 Sprague-Dawley (SD) 品系雄性大白鼠 (購自樂斯科, BioLASCO Taiwan Co., Ltd)，年齡約八到十週，體重大約 300~350 克。大 白鼠飼養於中央研究院生物醫學研究所動物室，給予12 小時明暗週期，早 上 6 點開燈，晚上 6 點關燈。動物室之室溫維持在 25±1℃及固定溼度，按 時供給足量食物及飲水。實驗人員的操作均遵照中央研究院生物醫學研究 所實驗動物使用手冊之規章。

第二節 海馬迴內質體基因轉染 (transfection) 或藥物注射 ㄧ、 立體定位手術 (stereotaxic surgery) 與埋管

選取約八週的大白鼠，進行腦部立體定位手術。手術前先給予大白鼠麻 醉劑巴比妥鹽 (sodium pentobarbital, 40 mg/kg)，等待全身麻醉後 (足部 反射動作反應消失)，將大白鼠固定於立體定位儀 (stereotaxic instrument) 上，門牙固定桿 (tooth bar) 標高為 -2.4 mm。利用手術刀切開頭皮，露出 頭骨，用生理食鹽水清潔，並用乾棉花止血後，定出前囪 (bregma) 的位 置。依據大白鼠腦部定位圖譜 (Paxinos and Watson, 1986)，以前囪為原

點，定出後方 3.5 mm 兩側各 2.5 mm 為海馬迴 CA1 區域的位置，利用電 鑽鑽孔並埋入不鏽鋼管 (外徑 0.63 mm, 內徑 0.33 mm)。鋼管以三根螺絲 釘及牙粉固定於頭蓋骨，再放入等長的細鋼絲於鋼管中避免血液阻塞。動 物手術後待其清醒再送回動物室，休息一週等待其復原後即可進行實驗測 試。

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二、 質體基因與聚乙烯亞胺 (polyethylenimine, PEI) 混合物的製備 質體基因欲轉染至海馬迴 CA1 區域，需先配製質體基因與聚乙烯亞胺 的混合物。聚乙烯亞胺為帶正電的有機聚合物，藉由正負電相吸的特性包 覆具負電荷的質體基因形成微小體 (liposome)，透過細胞的內噬作用 (endocytosis) 進入細胞內。實驗證實聚乙烯亞胺和質體基因所形成的混合 物具有低毒性，同時發現聚乙烯亞胺所形成的微小體在轉染後 48 至 72 小 時可穩定在海馬迴 CA1 神經元細胞內表現 (Abdallah et al., 1996; Martres et al., 1998; Lungwitz et al., 2005)。

首先配置濃度 0.1 M 聚乙烯亞胺，取 25 mg 聚乙烯亞胺 (Sigma, St.

Louis, MO) 溶於 9 ml 5 % glucose，以 HCl 調成 PH7.0，再加入 5 % glucose 至 10 ml 體積，並以 0.22 μm 過濾膜過濾，接著將純化的質體基 因 (flag-vector, STAT1-Flag；Addgene, Cambridge, MA) 以 5 % glucose 配製成2.77 μg/μl。實驗要混合 DNA 與聚乙烯亞胺之前，先將 DNA 放置 於56 ℃加熱板加熱 5 分鐘，再靜置於室溫下等其降至室溫。接著取出 0.55 μl 的質體基因 (2.77 μg/μl) 和 0.45 μl 的 0.1 M 聚乙烯亞胺相互混合，並 持續震盪使DNA 完全溶解，於室溫下靜置 15 分鐘即可利用微量注射幫浦 注射至海馬迴CA1 區域。

三、 STAT1

siRNA 與 STAT2 siRNA 的配製

STAT1 siRNA、STAT2 siRNA 與 negative siRNA 序列皆購自 Ambion

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(Austin, TX)；實驗利用帶正電聚合物 jetSI™ (polyplus transfection, France)

進行動物轉染，由於其對細胞的傷害性極低，且可包覆住帶負電的 siRNA，

並有效的抑制蛋白質的表現 (Guissouma et al., 2006)，因此利用 jetSI™作

為 轉 染 載 體 ； 首 先 取 1 μl DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine, Sigma) 加入 4.53 μl 100 %酒精，配置成 80 mM DOPE，再取出 1 μl 80 mM DOPE 加入 4 μl 10 mM jetSI™混合均勻，為 溶液 A (solution A)，接著將 5 μl 溶液 A 加入 3 μl 100 %酒精混合均勻，則 為溶液 B，取出 1 μl 溶液 B 並加入 9 μl 二次水、2.5 μl 25 % glucose 混合 均勻後即為溶液 C。取 10 μl 20 μM siRNA 與 25 μl 20 % glucose 之溶液 加入溶液 C 充分混合即配製成 8 pmol/μl siRNA 混合溶液，即可利用微量 注射幫浦注射至海馬迴 CA1 區域。

四、 海馬迴

CA1 區域注射

將不繡鋼注射針連接聚乙烯管 (PE-20)，將聚乙烯管連接至微量注射幫

浦上的 10 μl 微量注射筒。注射前將聚乙烯管注滿蒸餾水，再吸入一小節空 氣柱，最後吸入質體基因/聚乙烯亞胺或 siRNA/jetSI™的混合物，藉由空氣

柱隔離藥物與蒸餾水避免混合。注射時先用酒精擦拭不繡鋼注射針，再以 0.35 μl/min 的 速 度 注 入 總 體 積 0.7 μl 的 質 體 基 因 / 聚 乙 烯 亞 胺 或 siRNA/jetSI™混合物至海馬迴 CA1 區域。注射完後將不繡鋼針停留在腦中 5 分鐘以避免藥物因腦部內外壓力的不同而滲出，注射後經 64 小時的轉染

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即可進行免疫組織化學染色或莫氏水迷津實驗。

第三節 免疫組織化學染色 (immunohistochemistry)