基因轉殖植物檢測技術開發體系之建立
討 論
經由本研究，我們認為進行基因轉殖作物之檢測必須依著第一、二、三、
四層次的順序進行是相當重要的。在初步篩選時應先針對轉錄啟動子、終結 子、篩選基因這三種DNA 序列進行 PCR 反應，初篩結果若為陽性，再針對所 轉入的不同轉殖基因設計引子進行複檢確認，將可減少後續進行 PCR 反應的 數目。本研究中基因轉殖木瓜、水稻所使用的是 CaMV35S 啟動子、nos 終結
子與
nptⅡ基因，雖然這是根據統計現今基因轉殖作物最常被使用的序列之
一，但就目前發展中的基因轉殖作物而言，其所使用的啟動子已日趨多樣化(林 等, 2001)，因此，如何與我國基因轉殖作物研究人員充份溝通，使其願意提供 啟動子、終結子、篩選基因與所轉入之特殊基因序列的正確詳細資訊，將是研 發檢測技術與落實未來法規推動的重要基礎。
另日後若有基因轉殖種子種苗申請進口時，則應要求提出轉殖基因之詳細 資料及檢測方法，以為檢測之依據，否則若要全面篩檢，將增加困難度。
就本研究而言，所採用的CaMV35S 轉錄啟動子及 nos 轉錄終結子分別取 自於植物病毒 CaMV 及植物病源菌農桿菌，所以若作物受到 CaMV 或農桿菌 感染，雖初篩結果可能會呈偽陽性，但再進一步的針對轉殖基因本身設計引子 進行複檢時，將會呈陰性結果，因此不致造成檢測的誤判(Farid, 2002)。另就 本研究中的木瓜輪點病毒而言，其屬於馬鈴薯Y 屬病毒(Potyvirus genus)，可
經由機械接種或蚜蟲傳播，寄主範圍相當狹窄，僅限於番木瓜科(Caricaceae)，
藜科(Chenopodiaceae)及葫蘆科(Cucurbitaceae)等雙子葉植物。此病毒在番木瓜 科和葫蘆科植物上會引起系統性感染，在藜科上則造成局部病斑。該病毒為長 絲狀顆粒，大小約 780×12mm，在 PRSV 病毒顆粒內包含一條單鏈核醣核酸 (ssRNA)(包,2000)，由於其為 RNA 病毒，因此將不影響 DNA 層次之鑑定。
此外，在進行 PCR 檢測時，必須同時進行對照組試驗，以確立檢驗結果 的可信度。陰性對照組係不含任何轉殖作物來源的 DNA。而陽性對照組須依 據植物種類之不同而定，以確定DNA 品質、PCR 反應條件無誤，如：大豆係 針對lectin 基因、玉米係針對 invertase 基因設計引子(Meyer, 1999; Lin et al., 2000)。本研究中係以木瓜特有之木瓜酵素(papain)基因為標的，依據 papain 基 因序列(Cohen et al., 1986)設計引子，以作為木瓜物種陽性對照組之檢測。而水 稻亦同樣進行陽性對照組之檢測（結果未附）。
藉由本研究，雖然對於檢測是否為基因轉殖或傳統木瓜、水稻種苗之技術 研發已經成熟，但對於所檢出之基因轉殖木瓜的來源則尚須更進一步的研究，
由於第四層次的鑑定可偵測解析出植物受體轉殖品系基因組被外來基因插入 區域的序列，因此可作為轉殖作物之品種(系)鑑定之用，藉由此方式，就本試 驗所設計之引子，我們已可進一步確認所檢測出之基因轉殖木瓜樣品的來源品 系是由哪一株木瓜轉殖株系而來，可提供更確鑿的證據。
依據報告(包, 2000; Ling et al., 1991)，以美國與台灣所發展之 GM 木瓜為 例，其殖入之基因結構相類似，美國所發展的基因轉殖木瓜與本土的基因轉殖 木瓜相比較，其皆具有CaMV35S 啟動子、nptⅡ抗藥篩選基因與 nos 終結子，
即使在所轉入的外來基因部份，由於病毒親緣的關係，二者鞘蛋白基因的序列 亦具有頗高的相似度。解決途徑除了針對美國基因轉殖木瓜與本土基因轉殖木 瓜之基因構築找到可以區隔的序列設計引子以進行 PCR 鑑定之外，研發第四 層次的鑑定技術亦可解決上述問題。
結 論
本研究主要目的為研發應用 PCR 技術，進行基因轉殖木瓜、水稻植株與 種苗檢測方法之研究，目前已建立了基因轉殖木瓜植株與種苗檢測之第一層 次、第二層次、第三層次與第四層次的 PCR 鑑定作業流程，也已建立了基因 轉殖水稻植株檢測之第一層次、第二層次、第三層次的 PCR 鑑定作業流程，
對於用於種苗是否為GMO 或為傳統種（子）苗之檢測鑑定已經足夠，所以不 論苗木或田間篩檢，本試驗已研發出合宜之檢測鑑定技術。
為了健全種子與種苗法之落實，建立周延完善之基因轉殖作物檢測體系仍 為本研究最終之目標，根據研究結果，以及考慮到檢測實際之實用性，宜以農 委會農糧署為主體，成立標準作業審查委員會，並由防檢局提供防檢疫技術指 導，在農委會農試所成立木瓜與水稻的基因轉殖作物檢測核心實驗室；在種苗 繁殖場成立馬鈴薯與油菜的基因轉殖作物檢測核心實驗室，而各農業改良場負 責進行樣品採樣與初步篩檢，其中台中區農業改良場、花蓮區農業改良場、高 雄區農業改良場負責木瓜篩檢；台南區農業改良場負責玉米與番茄篩檢如圖十 七，再將各農業改良場檢出之疑似基因轉殖樣品進行二次檢測，如有篩出疑似 基因轉殖樣品，則送到核心實驗室作再確認及進一步之分析檢測，如此基因轉 殖植物之檢測體系即可完整妥善建置成立。
參考文獻
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142:271-285.
表一、供試之玉米品種與取得來源
代號 玉米品種 取得來源
1 H5 台灣農產公司 2 H10 台灣農產公司 3 Honey 236 台灣農產公司 4 MADONA 台灣農產公司 5 Shimmer 台灣農產公司 6 台南22 號 台南場朴子分場
7 金美2 號 和生種子
8 金蜜 台南場朴子分場
9 夏蜜 和生種子
10 華珍 台南場朴子分場
11 黑美珍 農友種苗
12 蜜珍二號 農友種苗
13 蜜珍三號 農友種苗
14 興農506 台南場朴子分場
15 興農好滋味 台灣農產公司
16 雙色金華 和生種子
17 雙色金蜜 和生種子
18 阪田 台灣農產公司
19 阪田610 台灣農產公司
20 夏強 台南場
21 PopCorn 超市
＊台南場提供
表二、供試之番茄品種與取得來源
番茄品種 取得來源 番茄品種 取得來源
Bolzano DeRuiter Seeds, Netherland 玉豐 和生種苗公司 Campari Enza Zaden, Netherland 朱蜜 農友種苗公司 Chapeau DeRuiter Seeds, Netherland 朱鳳 農友種苗公司
CHT1312 AVRDC 朱麗 農友種苗公司
Clarance DeRuiter Seeds, Netherland 秀珠 農友種苗公司 Daydream Enza Zaden, Netherland 明珠 農友種苗公司 DRK909 DeRuiter Seeds, Netherland 金光 農友種苗公司 Elstar Enza Zaden, Netherland 金剛二號 農友種苗公司
FA189 福埠實業公司 金珠 農友種苗公司
Lemance DeRuiter Seeds, Netherland 金龍 和生種苗公司 Lovett Enza Zaden, Netherland 春光 農友種苗公司 Nectar Enza Zaden, Netherland 紅瑞 和生種苗公司 Salomee Enza Zaden, Netherland 紅慧 和生種苗公司 Sensacion Enza Zaden, Netherland 夏津 農友種苗公司 Sensei Enza Zaden, Netherland 貴女 農友種苗公司 Sunstream Enza Zaden, Netherland 黃水晶 和生種苗公司 Tarantino Enza Zaden, Netherland 農友301 農友種苗公司 Temptation Enza Zaden, Netherland 翠紅 農友種苗公司 Tomato1306 福埠實業公司 嬌女 農友種苗公司 Y73-RedStone 台南區農改場 聯珠 農友種苗公司
四季紅 農友種苗公司 麗君 農友種苗公司
＊台南場提供
表三、甜玉米21 種、飼料玉米、黃豆分別以 41%嘉磷塞(Glyphosate，年年春) 稀釋80 倍及 18.02%固殺草(Glufosinate，百試達)稀釋 100 倍噴施檢測其 耐藥性比例
受檢樣品 殺草劑
嘉磷塞 固殺草
甜玉米（計21 種） 0 % 0 %
飼料玉米 60 % 5 %
大豆 89 % 0 %
＊台南場提供
圖一、進口飼料玉米除草劑耐受性篩檢(A)播種萌芽之進口飼料玉米。(B)非基 因轉殖玉米不耐除草劑全部死亡。(C)進口飼料玉米對嘉磷塞具有 60%
抗性。(D)進口飼料玉米對固殺草具有 5%抗性。（台南場提供）
A B
C D
圖二、針對基因轉殖木瓜株系與傳統木瓜品種偵測CaMV35S 啟動子之 PCR 擴增產物。M:100bp DNA ladder。品種代號：TN1：台農 1 號。TN2：
台農2 號。TN5：台農 5 號。TN6：台農 6 號。葉 TN2：葉錫東教授提 供之台農2 號。葉 16-0-1、葉 17-0-5、葉 18-2-4：葉錫東教授提供之基 因轉殖木瓜。日陞、紅妃、穗中紅、馬大瓜、泰國種：商業品種。（農 試所提供）
圖三、針對基因轉殖木瓜株系與傳統木瓜品種偵測kanamycin 抗藥篩選基因
nptⅡ之 PCR 擴增產物。M:100bp DNA ladder。品種代號：TN1：台農 1
號。TN2：台農 2 號。TN5：台農 5 號。TN6：台農 6 號。葉 TN2：葉 錫東教授提供之台農2 號。葉 16-0-1、葉 17-0-5、葉 18-2-4：葉錫東教 授提供之基因轉殖木瓜。日陞、紅妃、穗中紅、馬大瓜、泰國種：商業 品種。（農試所提供）870bp
810bp
圖四、針對基因轉殖木瓜株系與傳統木瓜品種偵測
nos 終結子之 PCR 擴增產
物。M:25bp DNA ladder。品種代號：TN1：台農 1 號。TN2：台農 2 號。TN5：台農 5 號。TN6：台農 6 號。葉 TN2：葉錫東教授提供之台農 2 號。葉16-0-1、葉 17-0-5、葉 18-2-4：葉錫東教授提供之基因轉殖木瓜。
日陞、紅妃、穗中紅、馬大瓜、泰國種：商業品種。（農試所提供）
圖五、針對基因轉殖水稻株系與傳統水稻品種偵測hygromycin 抗藥篩選基因 hptⅡ之 PCR 擴增產物。M:100bp DNA ladder。品種代號: A1:APU, 92 年第1 期水稻(余淑美)；A2:APU, 92 年第 2 期水稻(余淑美)；B: Phytase 基因轉殖水稻(余淑美)；C1、C2、C3:台農 67；D:Act LF 陳良築教授；
E: Phytase 基因轉殖水稻(國際)。（農試所提供）
E: Phytase 基因轉殖水稻(國際)。（農試所提供）