第三章 實驗部分
第四節 實驗方法
一、 實驗設計流程
菌株BCRC 36111, 36674於固態及液態培養基振盪或靜置培養，測量 菌絲乾重，ganoderic acid Me ，總靈芝酸量及胞內多醣量含量如 Fig.3-1所示。
Fig.3-1 實驗設計流程圖
菌源
G. lucidum
菌絲乾重 靈芝三萜量 總靈芝酸量 胞內多醣量
BCRC 36111 BCRC 36674
PDB,SGCM
二、培養基配製及種菌 1. 固態培養基配製及種菌
Potato Dextose Agar (3.9 g/100ml)，簡稱(PDA)，以 3.9g 溶於 100ml 蒸餾水中，以 121℃、25 分鐘之條件滅菌後，分別倒 25 ml/plate 各 4 個，置於培養皿中待其冷卻凝固後接入5mg 菌源 G. lucidum
，
置於28℃恆溫培養箱中。接種BCRC36111，BCRC36674 菌種培養 1 星期，2 星期，3 星期，4 星期後收菌絲產量，測三萜、總靈芝酸、胞內多醣 產量。
2. 液態培養基配製及種菌
Potato Dextose Broth (2.4g/100ml)，簡稱(PDB)，以 o.6g 及 25ml 蒸 餾水置入250 ml 的三角錐瓶，以 121℃、25 分鐘之條件滅菌後。待 其冷卻凝固後接入5mg 菌源 G. lucidum
，
至於 28℃恆溫培養箱中，以 轉速120rpm，分有振盪(shaking)及靜置(no shaking) 兩組培養。接種 BCRC36111，BCRC36674 菌種培養 1 星期，2 星期，3 星期，4 星期 後收菌絲產量，測三萜、總靈芝酸、胞內多醣產量。3. 探討水份潛勢對靈芝三萜類的影響
將 BCRC 36674 在 PDA 培養 7 天後，菌絲再轉植到 PDB 及分別 含NaCl(0.5M,1M,2M,4M)和 Sorbitol(1M,2M,4M)靜置培養 5 天，以高 效能液相層析儀(HPLC)來進行分析測靈芝三萜類產量。觀察 NaCl 及 Sorbitol 對三萜類產量的影響。
二、 菌重及代謝物分析方法 1. 菌體乾重
於液態培養基培養之菌絲，以濾紙過濾後用蒸餾水清洗菌體三次，
將所得到之菌絲取出置於50℃烘乾稱重；於固態培養基培養之菌絲則 直接取下併烘乾稱重。
2. 靈芝三萜分析法
菌絲稱重100mg，用N2(l)冷凍後磨成粉，加入3ml methanol 溶解，
再以0.22μm濾頭過濾後，注入20μL 於層析管柱中。以高效能液相 層析儀(HPLC)來進行分析，對照標準品Thymol濃度製成標準檢量 線，計算所含的三萜量。
HPLC分析使用實驗條件：
（1）管柱：Mightysil R P-18GP250-4.6(5μm)
（2）移動相：Eluent A , methanol-acetic acid(100：0.5,v/v)；
Eluent B, water-acetic acid(100：0.5,v/v)；
Gradient eluent stared 80% methanol,increased linearly to 84% in 15 min,to 86% in further 15 min,to 88% in 10 min,to 94% in a further 10 min and finaly to 100% in 20 min.
（3）流速：1ml/min
3. 總靈芝酸分析法 (Tang and Zhong 2002)
（1）取菌絲稱重50 mg，用N2(l)冷凍後磨成粉，加入3ml 50% (v/v) 的酒精萃取12 小時。
（2）將萃取液放入真空濃縮機下在50℃進行濃縮至乾。
（3）加3ml水回溶並加入3ml chloroform 萃取。
（4）吸取chloroform層加入3ml 5%(w/v) NaHCO3萃取。加入 2 N HCl 調整 pH ，使溶液之 pH 值＜3.0。
（5）取CH3Cl3層以40 ℃蒸餾移除chloroform。
（6）加 3 ml 100% ethanol 溶解靈芝酸後以UV 245 nm測吸光值。
（7）對照標準品Thymol濃度製成標準檢量線，計算所含的總靈芝酸 含量。
4. 靈芝胞內多醣分析(Dubois, Gilles et al. 1956; Tang and Zhong 2002)
（1）菌絲稱重50mg，用N2(l)冷凍後磨成粉，加入5ml 1M NaOH。放 到60℃、加熱1 hours 完成後 ，高速離心。
（2）吸取上層萃取液稀釋。
（3）使用酚-硫酸呈色法分析，吸 0.5ml 於試管，加入0.5ml 5﹪
Phenol，再加入2.5ml濃硫酸 ，均勻混合後，取出以分光光度計 在490nm波長下測其吸光值。
（4）對照標準品Glucose濃度製成標準檢量線，計算所含的總醣含量。