探討不同培養方法對靈芝菌絲和多醣體與靈芝酸產量之影響;Factors affecting mycelial biomass, polysaccharide and ganoderic acid production in cultivation of Ganoderma lucidum using different media

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(1)中國醫藥大學藥學院中國藥學研究所碩士論文. 編號：ICPS-M362 指導教授：游邦照博士共同指導教授：陳玉芳博士探討不同培養方法對靈芝菌絲和多醣體與靈芝酸產量之影響. Factors affecting mycelial biomass, polysaccharide and ganoderic acid production in cultivation of Ganoderma lucidum using different media. 研究生：黃. 美. 嫆. Mei-Jung Huang. 中華民國. 九十八年七. 月.

(2) 誌謝本論文得以順利完成，首先感謝恩師游邦照博士，在碩士生涯的研究過程中，於實驗觀念及論文寫作的指導，投入相當多的心思與策勵。此外陳玉芳所長在日常生活做人處事的態度，也讓我獲益良多，致使我處事態度更為積極負責。此外，感謝研究室的雅停、淳謙、佩真、玟蒨幾位研究助理在實驗上的指導。學弟妹：佳欣、釋閔、瑋志、雪巖在實驗室事務的幫助。另外感謝陳昱璋老師及陳伯伯奮雄先生的鼓勵與實驗教導，減少作實驗以外的壓力，再此一併感謝。至於求學期間，不吝惜提供幫助與陪我度過低潮的同學與朋友，在此無法一一加以感謝，謝謝你們。最後，將本論文獻給我最親愛的家人：媽媽秀連女士，婆婆蔣月女士，丈夫忠炫先生與三位可愛的小朋友：大姐芳瑜、二姐庭禎、弟弟承翰。謝謝你們在我這兩年辛苦的求學路程，默默給予支持與鼓勵及諒解，使我得以順利完成學業。.

(3) 目錄目錄................................................................................................................ I 表目錄......................................................................................................... III 圖目錄......................................................................................................... IV 中文摘要..................................................................................................... VI 英文摘要.................................................................................................. VIII 第一章緒言................................................................................................. 1 第二章總論 ............................................................................................. 4 第一節靈芝藥用植物學考 ................................................................ 4 第二節靈芝的栽培方式 .................................................................... 7 第三節固態發酵培養技術的簡介 .................................................... 11 第四節靈芝的成分及藥理特性 ........................................................ 26 第五節靈芝三萜類化合物之結構及功能 ........................................ 32 第六節靈芝多醣體及結構 .................................................................. 41 第三章實驗部分 .................................................................................... 44 第一節實驗試藥與儀器設備 .......................................................... 44 第二節實驗材料 ............................................................................. 48 第三節實驗菌株 .............................................................................. 50 第四節實驗方法 .............................................................................. 51 第五節統計方法 .............................................................................. 56 第四章實驗結果....................................................................................... 57 第一節靈芝菌絲產量分析 .............................................................. 57 第二節靈芝三萜成分(ganoderic acid Me)產量分析 ...................... 63 第三節探討水分潛勢對 ganoderic acid Me 產量影響 .................... 70 第四節總靈芝酸產量的分析 .......................................................... 73 第五節靈芝胞內多醣產量的分析 .................................................. 77 I.

(4) 第五章討論 ............................................................................................... 80 第六章結論................................................................................................. 87 附錄............................................................................................................. 90 參考文獻..................................................................................................... 97. II.

(5) 表目錄 Table 2-1、從不同靈芝分離出具有生物活性之三萜類 ......................... 34 Table 2-2、分析到 2004 年靈芝成分具有藥理特性相關文獻 ............... 35 Table 2-3、從不同靈芝分離出具有生物活性之多醣體 ......................... 43 Table 3-1、實驗試劑 ................................................................................. 44 Table 3-2、實驗儀器與設備 ..................................................................... 46 Table 3-3、A 培養基組成 ......................................................................... 48 Table 3-4、固態培養基組成(SGCM) ....................................................... 48 Table 3-5、B 培養基組成.......................................................................... 49 Table 3-6、液態培養基組成(SGCM) ....................................................... 49. III.

(6) 圖目錄 Fig.2-1 靈芝 25 種 oxygenated triterpenoids 結構式，including eight pairs of stereoisomers and five pairs of positional isomers................................. 36 Fig.2-2 Ganoderic acid 結構式 .................................................................. 37 Fig.2-3 Ganoderiol 結構式......................................................................... 37 Fig.2-4 Lucidenic acid 結構式 ................................................................... 38 Fig.2-5-1 Ganolucidic acid D 結構式 ........................................................ 38 Fig.2-5-2 Ganolucidic acid E 結構式 ........................................................ 39 Fig.2-6 Ganoderic acid 結構式(A , B , C , C2 , DM , K ,LM2 , Ma , Mb , Mc , Md , Me , Mf , Mg ,Mh , Mi , Mj , P , Q , R , S1 , S2 , T , U , V ,W, X , Y,Z ,α,β,γ,δ,ε,ζ,η,θ).............................................................. 40 Fig.2-7 β-(1-3)-D-葡聚糖結晶結構 ......................................................... 42 Fig.2-8 具抗腫瘤活性的 β-(1,6)分支的 β-(1,3)-D-葡聚糖結構 .......... 42 Fig.3-1 實驗設計流程圖............................................................................ 51 Fig.4-1 BCRC 36111 以不同培養基培養之菌重 ..................................... 60 Fig.4-2 BCRC 36111 以 SGCM 培養基培養之菌重................................ 61 Fig.4-3 BCRC 36674 以不同培養基培養之菌重..................................... 62 Fig. 4-4 靈芝標準品 ganoderic acid Me 在 35 分鐘的 HPLC 圖譜 ........ 63 Fig. 4-5 靈芝標準品 HPLC 圖譜 4 個波峰結構式 .................................. 64 Fig. 4-6 ganoderic acid Me 的結構式 ........................................................ 64 Fig.4-7 BCRC 36111 於不同培養基三萜量 ............................................. 67 Fig.4-8 BCRC 36674 於不同培養基三萜量 ............................................. 68 Fig.4-9 BCRC 36111、36674 於不同培養基三萜量 .............................. 69. IV.

(7) Fig.4-10 BCRC 36674 於含不同濃度 NaCl 培養基進行培養之三萜量 ..................................................................................................................... 71 Fig.4-11 BCRC 36674 於含不同濃度 Sorbitol 培養基進行培養之三萜量 ..................................................................................................................... 72 Fig.4-12 BCRC 36111 於不同培養總靈芝酸 ........................................... 75 Fig.4-13 BCRC 36674 於不同培養總靈芝酸 ........................................... 76 Fig. 4-14 BCRC 36111 於不同培養基胞內多醣量 .................................. 78 Fig. 4-15 BCRC 36674 於不同培養基胞內多醣量.................................. 79. IV.

(8) 探討不同培養方法對靈芝菌絲和多醣體與靈芝酸產量之影響研究生. 黃美嫆. 中國醫藥大學藥學院中國藥學研究所. 摘要. 靈芝的藥理成分非常豐富，其中靈芝多醣及靈芝酸具有抗腫瘤、降血壓、降血糖和提昇免疫能力的功效。但一般野生靈芝大都為多年生且採集不易，現今大多採用人工栽培靈芝；然而靈芝的生長期至少需要 3-5 個月。本研究目的將探討不同培養方法對靈芝菌絲和多醣體與靈芝酸產量之影響，期望提高靈芝菌絲和靈芝多醣靈芝酸產量。靈芝以不同培養基 A 及 B 培養，培養基 B 分振盪及靜置培養，菌株 BCRC 36111 於 A 培養 4 星期後可獲得較高的菌絲重及 ganoderic acid Me(分別為 0.19 g/substrate 菌絲及 1.55mg /100mg 菌絲)；而 B 振盪培養之菌絲重及 ganoderic acid Me 分別為 0.09 g/substrate 菌絲及 0.48mg/100mg 菌絲， B 靜置培養之菌絲重及 ganoderic acid Me 分別為 0.11g/substrate 菌絲及 0.20mg /100mg 菌絲。菌株 BCRC 36674 於 A 培養所獲得之菌重及 ganoderic acid Me 亦較培養基 B 高。然而 A 培養基促使較多 ganoderic acid Me 之產生並非是 A 培養基中較低的水份潛勢所造成。比較不同營養源培養基 A 與 SGCM 之差異，菌株 BCRC 36111 以 SGCM 培養獲得較高的菌重，但 ganoderic acid Me 產量卻遠低於 A 培養基。靈芝酸產量方面發現 BCRC 36111 培養 2 星期產量最高，A 培養基及 B 培養基振盪與靜置培養產量分別為 36.61、30.88、35.84 VI.

(9) mg/g，BCRC 36674 的 A 培養基及 B 培養基振盪與靜置培養產量分別為 29.74、24.32、26.73 mg/g。兩菌株靈芝酸產量方面差異不大。靈芝胞內多醣產量方面發現 BCRC 36111，培養 1 星期 A 培養基及 B 培養基振盪與靜置產量分別為 106.88 、126.45、66.47mg/g ，BCRC 36674 的 A 培養基及 B 培養基振盪與靜置產量分別為 244.43、 261.07 、136.49 mg/g。研究發現 BCRC 36674 對靈芝胞內多醣產量是比 BCRC 36111 高。由本研究數據顯示，以 A 培養基技術進行培養可提高靈芝菌絲生長和 ganoderic acid Me 產量。期許本研究對靈芝將來放大規模栽培與最適當的培養條件，提供一些培養條件因子訊息，對靈芝栽培產量方面提供一些貢獻力量。. 鍵字：靈芝；菌絲；靈芝酸；胞內多醣. VII.

(10) Factors affecting mycelial biomass, polysaccharide and ganoderic acid production in cultivation of Ganoderma lucidum using different media Mei-Jung Huang Institute of Chinese Pharmaceutical Science China Medical University Abstract Ganoderma lucidum produces polysaccharide and triterpenoids with biological activity such as anti-tumor, anti-hypertension, anti-hyperglycemia and displays strong immunomodulatory activity. However, the production of basidiocarp of G. l. takes at least 3 to 5 months. The purpose of this study is to evaluate the factors affecting mycelial biomass, polysaccharide and ganoderic acid production in different cultural condition. G. l. BCRC 36111 was cultured for 4 weeks on A and B medium, B medium with shaking or non- shaking.The mycelial biomass and ganoderic acid Me were 0.19( g/ plate )and 1.55(mg /100mg biomass) in A medium respectively, which were greater than B medium without shaking ( 0.11 g/plate and 0.20mg /100mg biomass) and B medium with shaking(0.09 g/plate and 0.48mg /100mg biomass).The production of biomass and ganoderic acid Me of BCRC 36674 was also increased by cultivation in A medium than in B medium with shaking or non- shaking. Lower water potential of medium did not increase ganoderic acid Me production in BCRC 36111. Comparing the effect of different nutritional medium(A and SGCM),the liquid SGCM VIII.

(11) medium resulted in more biomass production but much lower ganoderic acid Me production.Production of ganoderic acids was similar in A and B medium.However, G. l. BCRC 36111 strain produced more ganoderic acid than BCRC 36674.When the Intracellular polysaccharide was evaluated, the production of polysaccharide was enhanced by cultivation in A medium than in B medium.In addition, BCRC 36674 strain produced more intracellular polysaccharide than strain BCRC 36111.Our data conclude that A medium provides better production of biomass and ganoderic acid Me.. Key words: Ganoderma lucidum; Mycelial biomass; Intracellular polysaccharide; Ganoderic acid. IX.

(12) 第一章緒言. 近年來由於人口結構的改變，中老年人人口比例增加，環境污染日益嚴重、生活壓力也隨社會競爭激烈而加重，導致慢性病、心血管疾病及癌症發生率持續升高。根據行政院衛生署公告 2008 年國人十大死亡原因，惡性腫瘤、心臟疾病、腦血管疾病等依序排前幾名。因此現代人非常注重養生保健之道，所以「保健性食品」或其他醫藥上特用化學品的開發上，已成為新興的研究重點。靈芝 Ganoderma lucidum 是我國著名的藥用真菌，在我國靈芝藥用已有 2000 多年的歷史, 其子實體、孢子粉、菌絲體均可入藥。在《神農本草經》中記載著赤芝、黑芝、白芝、黃芝、紫芝等幾種靈芝的功效，將靈芝列為［上藥］，意即為最高貴的藥材，可久服，完全沒有副作用(Huang 1983)。明朝李時珍所著《本草綱目》中記載：「靈芝可久服輕身不老，延年神仙」。由於它能預防和治療許多疾病，在古代曾被稱為“仙草”。靈芝的藥理成分非常豐富，現代藥理和營養學研究證明，靈芝含有多種生物活性成分，如多醣、靈芝三萜、甾醇、核酸、蛋白質、多肽、脂肪酸等(水野卓 1997; Paterson 2006)，其中多醣(水野卓 1997; Ho, Yeung et al. 2007; Ma, Guan et al. 2008)和三萜是靈芝最關鍵的生物活性物質或藥效成分( Ho, Yeung et al. 2007; Ma, Guan et al. 2008)。因此. 1.

(13) 靈芝確實為優秀的保健食品題材之一，值得深入研究探討。傳統上，靈芝是通過野外採集或人工栽培獲得，靈芝以子實體或孢子入藥，但靈芝子實體形成週期長，受氣候影響產量及品質均不穩。而一般野生靈芝大都為多年生且採集不易，現今由於市場需要大，因此大多採用人工栽培靈芝。由於傳統的栽培方法靈芝的生長週期長至少需要 3-5 個月；利用現代生物技術通過液體發酵生產靈芝菌絲體，菌絲增殖速度快，生產週期短，生產效率高，可實現靈芝的工業化生產。因此利用液體深層發酵技術生產靈芝具有生產週期短、活性物質和野生靈芝基本一致等特點，現成為獲取靈芝和其生物活性物質的最有效方法(Fang and Zhong 2002; Chang, Tsai et al. 2006)。近年來，靈芝的液體發酵技術取得了很大進展，但如何進一步促進靈芝細胞生長和提高活性物質的產量仍是人們希望解決的課題(Fang and Zhong 2002; Hsieh, Tseng et al. 2006) 。因此許多研究著重於如何以菌絲培養方式來大量生產菌絲體、靈芝酸、多醣體等有效成分 (Yang and Liau 1998; Fang and Zhong 2002; Fang and Zhong 2002; Tang and Zhong 2002; Hsieh, Tseng et al. 2006; Xu, Ding et al. 2007)，因現今大多採用液體深層發酵技術生產靈芝，查文獻回顧國內外研究現況 ( Yang, Wu et al. 2004; Huang, Chen et al. 2009)，關於靈芝固態發酵培養的報導甚少。而目前以菌絲體進行靈芝酸生產研究中，均是探討總. 2.

(14) 靈芝酸之生成，並沒有針對特定靈芝酸之生成進行探討。因此在本研究中我們利用 HPLC 的分析系統探討不同培養條件對特定 lanostane-type 三萜化合物(Ganoderic acid Me, Ganoderic acid T) 等生合成之影響；且目前已知 Ganoderic acid Me 可經由提高免疫機能抑制癌細胞生長(Liu and Zhang 2007)，另外 Ganoderic acid T 亦被研究具有促使肺癌細胞凋亡功能(Tang, Liu et al. 2006)，此類三萜化合物對惡性腫瘤、提高免疫機能及抑制癌細胞生長方面均有重要療效，因此如何大量開發生產此類化合物為一重要且迫切研究課題。為此，本研究目的將探討不同培養方法及培養配方對菌絲體生長、三萜化合物 ganoderic acid Me 總靈芝酸及多醣產量之影響。期望經由不同培養方式能夠找出來提高靈芝三萜化合物 Ganoderic acid Me 產量的方法，結果發現固態培養基 PDA 在生產 Ganoderic acid Me 產量時為較好的培養系統。. 3.

(15) 第二章總論. 第一節靈芝藥用植物學考察. 【來源】本品為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(LEYSS.ex FR.) Karst.或紫芝Ganoderma sinense ZHAO，XU et ZHANG的乾燥子實體。全年採收，除去雜質，剪除附有朽木、泥沙或培養基質的下端菌柄，陰乾或在40 ～50℃烘乾。(中華人民共和國藥典；常用中藥鑒定大全；中藥辭海) 【形態】 1. 靈芝又名: 赤芝. 腐生型或生於樹木根部。擔子果一年生，有柄，. 栓質。赤芝外形呈傘狀，菌蓋腎形、半圓形或近圓形，直徑 10～18cm，厚 1～2cm。皮殼堅硬，黃褐色至紅褐色，有光澤，具環狀棱紋和輻射狀皺紋，邊緣薄而平截，常稍內卷。菌肉白色至淡棕色。菌柄圓柱形，側生，少偏生，長 7～15cm，直徑 1～3.5cm，紅褐色至紫褐色，光亮。皮殼部菌絲呈棒狀，頂端膨大。菌絲系統三體型，生殖絲透明，薄壁；骨架菌絲黃褐色，厚壁；纏繞菌絲無色，厚壁彎曲，均分枝。孢子卵形，雙層壁，頂端平截，外壁透明，內壁淡褐色，有小刺，大. 4.

(16) 小 9～11μm X 6～7μm，擔子果多在秋季成熟，華南及西南可延至冬季成熟。生於向陽的殼斗科和松科松屬植物的跟根部或枯樹桩上。 2. 紫芝與靈芝不同點是：紫芝菌蓋多呈紫黑色至近褐黑色；菌肉呈均勻褐色、深褐色至栗褐色；孢子頂端臍突形，內壁突出小刺明顯，孢子較大，大小 9.5～13μm X 6.9～8.5μm。生於闊葉樹或松科松屬植物的樹桩上，引起木材自腐。為中國特有種，分佈于長江以南高溫多雨地帶。【產地分佈】中國普遍分佈，但以長江以南為多。在朝鮮半島和日本亦有分佈。【採集】靈芝的乾燥子實體。全年採收，除去雜質，剪除附有朽木、泥沙或培養基質的下端菌柄，陰乾或在40～50℃烘乾。【靈芝科及靈芝屬的特徵】（靈芝科）子實體木生，一年生或多年生；菌蓋半圓形或扇形，蓋面上常有硬質皮殼，有柄或無柄。雙系或三系菌絲，具骨架菌絲，有鎖狀聯合。子實層托為管狀；孢子卵圓形至球形杏仁形，頂端常呈平截狀，雙層壁，. 5.

(17) 內孢壁褐色，有刺狀突起或疣等紋飾，外孢壁平滑，無色，非澱粉質。本科包括有 105 種，分為三個屬。（靈芝屬）靈芝屬 Ganoderma Karst. (REV. MYC. 3(9):17. 1881.) 子實體一年生或多年生，木質或木栓質，有柄側生、偏生或中生；菌蓋表面常有硬質皮殼，皮殼有油漆樣光澤。菌肉一層，單色或 2~3 層，不同色；三系菌絲。菌管單層至多層；孢子卵形、頂端平截，內孢壁褐色，有小刺突或較粗造。模式種：Ganoderma lucidum(LEYSS.ex FR.) Karst.. 6.

(18) 第二節靈芝的栽培方式. 一、靈芝的來源可分為野生與人工栽培：（一）野生靈芝－野生靈芝在台灣的平地及高海拔山區皆有分佈，常常生於闊樹、針葉樹、相思樹及豆科植物，大部分為一年生的子實體。缺點是生長期過長產量少且品質不易控制。（二）人工栽培靈芝－靈芝目前因研究及應用需求迫切，而有人工栽培法出現。最常見的品種為赤芝，其產量有一定經濟規模，且可以有效控制其生長過程，能達到最接近天然靈芝的成份及品質，為大部分靈芝產品的原料來源。目前人工栽培靈芝其方法有二(林哲聖) ： 1. 子實體栽培方面（1）段木栽培：將靈芝的生長菌絲種植在櫟木或是枹木的枯木段上。（2）木屑培養瓶或太空包栽培：於廣口瓶或太空包中填裝木屑與生長培養基，將靈芝菌絲接入後塞上棉塞培養，在30 ℃栽培70~90 天即可採收子實體。 2. 菌絲體液態培養方面由於靈芝子實體的培養一般要2~3 個月的時間，而且從開始到採收相當費力，又因為野生靈芝不易取得，所以發展出像生產抗生素那樣以. 7.

(19) 液體發酵的辦法，即為靈芝液體培養。將靈芝菌絲培養於液態培養基中，給予足夠的氧氣，使菌絲生長、繁殖並累積有效物質，發酵培養期僅五至七天。利用生物科技方法將靈芝菌種作發酵培養，以生產大量靈芝菌絲體。其成本最低，但常會缺乏一些天然靈芝中特有的成分（例如三萜類），在效果及品質上難免與靈芝子實體有所差異及療效有所影響。. 二、靈芝子實體的栽培方法分析靈芝生長的環境便可知道，靈芝以木材中各種成分作為它的營養，需要較高的溫、濕度和良好的通風透光的環境。故以下就營養、溫度、濕度、空氣、光線五個方面來討論：（1）營養真菌所需的營養基本上有三大類：碳素營養、氮素營養和礦質營養。靈芝在朽木或樹樁上生長，無疑木材是靈芝的營養來源。木材的化學成分相當複雜，概括起來可包括兩大類：有機物質和礦物質。而靈芝菌絲可分泌多種將有機成分分解利用，礦質營養則可從木材中各種礦質元素吸收得到。此外，在人工栽培方面為了促使靈芝生長更加快速，一般會在木屑培養基中添加適量富含營養的物質（如米糠、麩皮、玉米渣等）當作配料。需注意的是配料比例高，除了感染雜菌的機會. 8.

(20) 增加，更重要的是富含營養的配料太多，會使營養生長特別旺盛，因而抑制了子實體的分化（生殖生長）。（2）溫度對於靈芝生長與溫度的關係，有研究指出(陸文梁, 林忠平 et al. 1993)：25~30℃是菌絲體生長的最適溫度，較高或較低的溫度都會使菌絲體生長速度減慢，同時子實體原基分化的最適溫度也在25~30℃ 之間。在接近25℃中培養的子實體生長較慢，質地較緊密，皮殼層發育的較好，色澤也較光亮。在30℃左右培養的子實體生長較快，個體發育週期較短，質地不如25℃中培養的緊密，皮殼及色澤也較差。（3）濕度水分是細胞內含物重要組成部分，又是有機生命活動中營養物質的運輸工具及溶劑，各種物質只有在溶解的情況下才能被吸收。在自然界中靈芝的發育離地面很近，又正值夏秋季節，雨量充足，這些都說明了靈芝生長發育需要很充足的水分和空氣濕度。因為菌絲體的生長主要是依靠分生能力旺盛的菌絲尖端來實現的。子實體的生長也是依靠菌絲尖端組成的菌柄頂端或菌傘邊緣來實現的。這些菌絲尖端特別幼嫩，其外表又沒有任何覆蓋物或保護物，如果濕度較低的話，這些幼嫩的尖端很快就會乾死，一旦菌絲尖端死亡，靈芝的生長停止。. 9.

(21) （4）空氣靈芝是屬於異營性，依靠氧化和分解現成的有機物為自己的養料，所以不發生光合作用過程，在它的生命過程中只進行呼吸作用。空氣中通常含有0.03﹪的二氧化碳，當空氣中二氧化碳濃度超過0.1﹪時，靈芝子實體就不能發育菌傘。通常人工栽培中出現的各種不正常型態大都是由於培養室中二氧化碳濃度過高所造成的(林志彬 2001)。（5）光線一般可能認為，光照對於進行光合作用的綠色植物是必不可少的，而對於進行呼吸作用的靈芝而言似乎不是必須的。其實不然，經實驗證實光照對靈芝正常生長發育的影響是多方面的，如光照對菌絲體的生長有抑制作用；對子實體的生長有促進作用以及菌柄和菌傘的生長有明顯的向光性。而光強度在15000~50000勒克司，生長情況最佳(陸文梁, 林忠平 et al. 1993)。. 10.

(22) 第三節發酵培養的技術. 一、固態發酵培養技術固態發酵是微生物培養的一種方式，使用固態物質當作基質，讓微生物生長在上面。與液態深層發酵相比，使用固態發酵培養，微生物有時能有良好的生長情形，也可產生較大量的胞外酵素，或其他代謝產物。固態發酵有獨特特性與限制。胞外水解酵素與其他代謝產物有時藉由固態發酵生產較大量的產物。雖然原因不是很清楚，但此特性對固態發酵的應用很重要。固態發酵與液態深層發酵主要的不同點(Sato and Sudo 1999) ： (1) 固態發酵，微生物分佈在固體表面，微生物生長與產物生成也主要在表面進行。基質不易攪拌均勻。因此培養環境為不均勻的。 (2) 固態基質的水分含量一般都非常低，必需依基質的物理性質與化學性質而定。對於高水分含量的培養基而言，通氣均勻通過基質床很困難，通常會發生＂渠道＂效應。 (3) 由於菌體的新陳代謝與生長產生熱，提高了基質的溫度，造成水分的流失。此現象使得固態發酵的控制更具挑戰性。 (4) 固態發酵的基質通常是天然物質，如：穀類、大豆、農業的生物量、固體廢棄物等。. 11.

(23) (5) 一般使用在固態發酵的微生物為黴菌，固態發酵中，黴菌的菌絲型態與液態深層發酵之菌絲型態不同。這兩種菌絲有不同的生理活性，複雜的控制過程。 (6) 對基質床進行攪拌非常困難，某些產物的活性對剪應力非常敏感，所以培養一般是靜態的，除了轉鼓反應器與流體化床發酵槽。由於這些固態發酵的獨特性質引發了一些優點與缺點(Sato and Sudo 1999)。固態發酵優於深層發酵的主要優點是： (1) 因為細菌的生長受到低水活性的限制，因此固態發酵較不易受到污染。 (2) 固態發酵的填充容積比液態深層發酵高，因為固態發酵水含量低。 (3) 如果產物必需從固態發酵中來萃取，只需要較少的溶劑與較低的回收成本。 (4) 發酵殘餘物的處理非常簡單。因為發酵殘餘物的水含量很低，可將之乾燥做為動物飼料或肥料。 (5)允許分化的結構生長，對某些發酵而言是產物生成的關鍵點。. 12.

(24) 固態發酵的主要缺點是： (1) 固體基質床的攪拌非常困難，造成基質床異質性的生理、物理、化學環境不均勻。因此細胞、養分、溫度、水含量分佈不規則，這個複雜性使得過程控制非常困難。 (2) 微生物呼吸或代謝產生熱使得溫度控制非常困難。因為固態基質床的熱傳導係數非常低。通常強制通氣是控制培養溫度的唯一方法。 (3) 菌體生長與其它發酵參數的快速測量非常困難，尚無有用的感測器可供直接測量。 (4) 微生物被限制在低水含量的基質上生長。黴菌或其他菌絲真菌最適合，細菌則不適合生長。 (5) 目前仍然缺少有效的方法可用來分析發酵的狀況，連續操作與自動化非常困難。 (6) 由於固態發酵高產率的影響因子間的交互作用相當複雜，培養策略通常是依靠經驗與實驗結果。固態發酵因天然基質具異質性，很難混合均勻，造成控制上的問題 (pH、DO、溫度)。為減少控制上的困難，基質通常以連續式或是間歇性攪拌來達到混合。對大型的發酵體積而言，菌絲細胞在高攪拌速率下會造成傷害，但低攪拌速率又無法避免濃度梯度的產生。因此，固態發酵系統通常採用滾動式的反應器，但必需找出最適合的滾動速. 13.

(25) 率。固態發酵新技術與液態深層發酵技術一樣，是一種普遍性的微生物生產應用技術，不限於某一種產品。隨著該技術體系的不斷改進與完善，以技術開發帶動產品開發，擴大應用範圍。所此現代固態發酵技術有著無限廣闊的應用前景。以下針對固態發酵技術相關因素及特性做討論：（一）固態基質研究在固態發酵中，固體基質常是不溶於水的天然聚合物，不僅提供微生物所需營養(碳源、氮源、無機鹽、水及其他營養物)，還作為細胞的固定物，能提供微生物所需一切營養的基質被認為是理想基質。基質在固態發酵中具有獨特的作用，它影響微生物發酵過程的質傳、熱傳及微生物的代謝功能等。所以對基質研究比較透徹，主要集中在基質的特性、預處理及滅菌等方面(林志彬 1996; 林志彬 2001)。 (1) 基質特性微生物要在基質上進行生長並生產代謝產物，必將受到基質本身的物理因素(基質顆粒大小、形狀、空隙率、纖維含量、黏度、顆粒之間擴散率等)和化學因素(聚合度、疏水性、結晶度及電化學性質等)的影響。基質顆粒的大小直接影響到單位體積反應表面積，也會影響顆粒間菌體的生長、氧的供給率及二氧化碳的移出率等。一般來講，小的基質顆粒可以提供微生物生長的表面積較大，可以明顯提高固態發酵. 14.

(26) 反應速率，被認為是理想的選擇。但是在許多情況下太小的顆粒容易造成基質積團，顆粒間空隙率也減小，對熱傳、質傳產生不利的影響，以致於妨礙微生物的呼吸或通氣，結果導致微生物生長不良；同時，大顆粒由於存在較大間隙，有利於提高質傳和熱傳效率，還可提供更好的呼吸及通氣條件，但提供較小的微生物生長表面積。隨著菌絲的增長，空隙大小在反應過程中會減小，氧、二氧化碳有效擴散係數降低。 (2) 基質預處理及吸收大多基質都是聚合物，不僅不溶於水，在微生物開始發酵初期不易被利用等特性，而且基質經常缺少某些微生物所需的營養，這時需要從外部添加營養。為了使基質更容易地被微生物利用，經常對基質進行化學或機械預處理。包括：汽爆、浸提、粉碎、裂解、研磨等機械處理及鹼化學處理(林志彬 1996; 林志彬 2001)。 (3) 培養基滅菌隨著反應器的放大，培養基大規模滅菌會帶來許多問題，如：培養基物理、化學性質改變、有毒化合物的形成及營養物的損失等。滅菌加熱及冷卻時間隨培養基規模而變，滅菌過程受不同因素影響如殺死微生物的速率、不同微生物對溫度的敏感性差別等。培養基滅菌遇到的另一個棘手問題是：培養基有的有機成分易受熱分解，甚至在較高溫. 15.

(27) 度下互相作用，形成對微生物有毒害作用的物質。有時培養基滅菌除了考慮殺死微生物外，還應考慮溫度對基質的物理、化學性質的影響。例如：麩皮(培養基中經常用的物質)在較高溫度下物理、化學性質發生改變，較有利於微生物的吸收，所以滅菌時間可以長一些(林志彬 1996; 林志彬 2001)。（二）無菌操作相對概念在任何液態發酵中，大多都要求無菌操作，這是因為雜菌可以在含水量高的液體培養基中比發酵使用的微生物生長更好。而對於固態發酵來說，其菌種一般可以在含水量低的情況下快速生長；如果固態發酵所用微生物接種到已滅菌的基質上，此過程有利於微生物，優於雜菌生長。這意味著嚴格的無菌操作在固態發酵不是十分重要。這種生化反應器設計要求低，相對費用也低，這些可能是固態發酵備受青睞的重要原因(林志彬 1996; 林志彬 2001)。（三）固態發酵培養重要參數 (1) 水分含量、濕度(Moisture) (Chisti 1999; 賀世紅 2000) 在固態發酵過程，基質的水分含量是一個很重要的考量。水分含量中的自由水明顯的依固態基質的本質而有不同。典型的基質水分含量約為 30-80％(w/w)。高水分含量會造成基質分子聚集在一起、通氣不良，或是缺氧環境。對一般真菌而言，最適水分介於40％與80％之. 16.

(28) 間。對於相同微生物而言，生長在不同基質，最適水分含量會明顯不同。大部分固態發酵的低水分環境較有利於酵母菌與真菌的生長。除了影響生長，水活性還會影響產物的生成。產物的性質會被影響，例如香味。對某些例子而言，菌體生長與產物生成的水活性不同。最適水活性會依攪拌速率與培養溫度而不同。由於水活性會因為溶解溶質的濃度而不同，有時候加入鹽糖或其他溶質來改變水活性，產生相同的水活性，不同的添加劑還是會對發酵產生不同的影響。此外，發酵過程中，產物生成與基質水解皆會導致水活性改變。發酵過程中，常利用通入潮濕的空氣或間歇性的噴灑水來控制水活性，通入飽和氣體通常被使用來增加基質的水含量。通入氣體的相對濕度通常為60-80 ％。理想上，為了避免從未接菌基質流失或增加水分，必需將通入的氣體與基質的水活性一致。實際上，發酵會產生水分，為了達到蒸發冷卻，通入的氣體必需稍微乾於基質。通入氣體的溫度和濕度藉由空調系統來控制，溫度和濕度感測器可提供需要的數據，冷空氣藉由噴灑水或乾淨的蒸汽來調整濕度，或是提高溫度降低濕度到所需的值。 (2) 溫度(Temperature)(Chisti 1999) 固態發酵最大菌體濃度，約10-30kg/m3，似乎比典型的液態發酵(4050kg/m3)還低，但因為固態發酵只有少許的水，因此，每單位質量發酵物所產生的熱比液態發酵大。溫度會快速上升，因為固態發酵只有. 17.

(29) 少許水能吸收熱量(平均單位熱容量遠低於水的)。因此，大規模發酵的溫度很難控制。代謝熱的移除有時變成最主要的限制，特別對於熱傳導困難的多孔性發酵物。發酵過程的溫度控制幾乎都是藉由蒸發冷卻的方法。因此，較乾的空氣提供較好的冷卻效果。控制空氣溫度，有時間歇性的噴灑冷卻水可防止基質脫水。對於大量堆積的基質而言，間歇性的攪拌可幫助熱移除。因此對於最佳生長期的菌體培養，溫度梯度問題的解決還是相當困難 (3) pH (Chisti 1999) 對於固態發酵而言，基質的預處理通常都沒有pH的控制。對於某些無菌過程，都將初始pH調到4或以下，可防止細菌污染。酵母菌與真菌通常都可以忍受較酸的環境。此外，大部分的基質都是很有效的緩衝劑，可防止發酵過程中pH劇烈變化。對於富含蛋白質的基質，特別是蛋白去氨作用很微小的基質，都是很好的緩衝劑。可使用尿素與硫酸氨結合當作氮源來維持基質的pH的穩定。富含蛋白質或胺基酸的基質中，去氨反應會造成pH上升。發酵過程中pH穩定，對某些發酵很重要。酵素與某些二次代謝產物的穩定性會受pH的影響，即使產生速率不受pH影響，但因為產物被破壞，所以總產率會下降。. 18.

(30) 二、深層液態發酵培養深層發酵培養是指使用固定組成之液態培養基，在控制適當的pH 值、溫度以及通氣量和攪拌速率的條件下，進行微生物的培養，以製造菌體與其他的代謝產物。發酵環境中，需要考量物理化學因素的影響，一般常見的有培養基之影響、攪拌速率、溫度、pH 值、黏度與溶氧值等因素，以下介紹物理化學因子可能對發酵結果所產生的影響。（一）培養基組成培養基組成往往會影響菌絲生長發育及二次代謝物差異。根據相關文獻佐證發現基質方面添加適當的氮源、碳源、酵素、微量礦物質確實會影響菌絲生長發育及二次代謝物形成。（1）碳源凡是構成菌絲細胞和代謝產物中碳基來源之營養物質均稱為碳源。碳源的主要作用是構成細胞物質和供應菌絲生長所需要的能量，在好氧發酵的操作下，大約有50%碳源會用於菌體的生長，而另外的50%則是用於能量的生成，但在厭氧的情況下，大部份的碳源則會轉化成產物，只有少部份的碳源會用於菌體生長(＜30%) (許英欽 2002)。一般碳源有葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖以及乳糖等等。一般來說，大部份碳源應該皆可被真菌吸收代謝以提供能量，並用來支持菌體生長與. 19.

(31) 代謝物的生成。但事實上卻又有某些特定的碳源。例如(1)蔗糖，最適合Neotyphodium uncinatum生產loline生物鹼，最佳產量可達 500~750 mg/l，相當於4mM以上。於葡萄糖和果糖中培養，雖有不錯效果，但是仍不如以蔗糖培養的產量。此外，若以右旋葡萄糖培養甚至會使菌體無法生產生物鹼(Blankenship, Spiering et al. 2001);(2)蔗糖和葡萄糖最適合Glomerella Cingulata用來產生β-glucan(陳宏文 2001);(3)可以生長在廣泛碳源的Nigrosporaoryzae var glucanicum，只有在葡萄糖或麥芽糖當碳源下可以明顯增加其多醣產量(陳宏文 2001)。當培養基中添加lactose進行培養可得到靈芝酸量最高(Tang and Zhong 2002)。對碳源影響菌絲產量方面根據文獻得知以maltose, lactose, glucose當碳源可增加菌絲體生長(Tang and Zhong 2002)。以 brown sugar或lactose當碳源相較於frucotose, glucose,malt extract,sucrose可增加菌絲生長體(Chang, Tsai et al. 2006) 陳愷之研究中發現生物質量以碳源(Maltose)培養G. lucidum，生物質量提升產量最多(陳愷)。林佳滿之研究發現不同碳源(蔗糖)所得菌絲濃度最高(林佳滿 2003) 。曾曉希等人發現靈芝液體發酵以碳源(Glucose)所得菌絲濃度最高(馮小黎 1995; 曾曉希, 周洪波 et al. 2007)。. 20.

(32) （2）氮源氮源主要是以蛋白質和核酸的形式存在於菌體，一般氮源並不提供能源，而氮源可分為無機氮源與有機氮源兩種，前者如銨鹽、硝酸鹽等，後者如麩皮、酵母萃取物、胺基酸等。一些研究靈芝的相關文獻發現無機氮源在靈芝液態培養時有利於菌絲生成的現象，且若添加有機氮源比無機氮源更利於靈芝之生長((Tseng, Shiao et al. 1984)。又例如，菌體轉化氮源生成生物鹼需要一連串的代謝反應，因此氮源中成分結構愈接近產物生物鹼結構者，愈可被菌體利用來合成生物鹼，進而促使產量上升(Blankenship, Spiering et al. 2001)。一些工業發酵上氮源的適當選擇，也會影響到多醣體的合成，並影響菌體的代謝途徑，代謝途徑的改變直接控制細胞內的碳源，用來形成生物質量及產生多醣(許英欽 2002)。對碳、氮源影響菌絲產量方面根據文獻得知以glucose-ammonium chloride medium當碳源、氮源所得菌絲濃度達到最高(Yang and Liau 1998)。以glucose當碳源、以peptone當氮源有助於菌絲細胞生長和靈芝酸產量(Xu, Ding et al. 2007)。Fang等人指出提高 glucose含量至50 g/l可提高菌絲之生長，當提高peptone 5g/l, yeast extract 5g/l 亦有提高菌絲產量(Fang and Zhong 2002)。曾曉希等人發現以yeast-extract為氮源可產生菌體、胞外多醣較高產量(曾曉希, 周洪波 et al. 2007)。王明珠等人研究發現以yeast-extract +Pepton為氮源. 21.

(33) 可產生較高菌體乾重及粗多醣乾重(王明珠，黃瑞珊，吳其威，黃為群，朱章玉 1994)。（3）碳氮比一般所謂的碳氮比是指培養基中總含碳量和總含氮量的比值，通常以C/N 表示。碳氮比除了會影響到菌絲生長的快慢，也會影響菌體內蛋白質與脂質的含量，一般菌體生長的過程中約有50%的碳源組成為菌體細胞成份，另外的50%是提供呼吸需要的能量來源，所以C/N 以5:1至25:1 之範圍為宜。反之，碳氮的比值如果太小則會有延長菌體生長期的缺點，以Agrobacterium sp.為例，在發酵過程中會產生相當大的黏稠性，這對產物收集造成相當大的困擾，但若藉由改變碳氮比，則有效降低發酵過程中所產生的黏稠度，以提高產物的產量。廖仁宏實驗結果發現以麥糠添加蒸餾水為基礎培養基，培養以添加碳源 (Fructose)與添加氮源(Malt extract)為最佳，培養7天之菌體濃度可達最高產量(廖仁宏 2003)。Yang等人研究以glucose-ammonium chloride medium當碳源、氮源所得菌絲濃度達到最高(Yang and Liau 1998)。 Xu等人研究發現當以碳源(glucose)、氮源(peptone)有助於菌絲細胞生長和靈芝酸產量(Xu, Ding et al. 2007)。Lin等人研究發現樟芝菌液體深層培養使用混合培養基以高碳源/氮源比例為40時會提升菌絲生長 (Lin and Chen 2007)。. 22.

(34) （4）無機鹽類無機鹽類是指含磷、硫、鎂等的鹽類，主要作用為下列: (1)構成細胞組成成份；(2)構成酵素的組成成份；(3)維持酵素作用；(4)調節新陳代謝。磷在生物體內是構成蛋白質磷脂體與磷酸脂等物質不可缺少的成份，尤其對於發酵及呼吸作用，這些磷酸之類成為能量代謝的核心。硫含於膀胱酸(cystine)、甲硫胺酸(methionine)與穀光甘肰 (glutathione)等，對菌體構成成份或菌體之生理作用主演重要角色。鎂在糖分解的過程中，成為酵素之重要賦活劑(activator) (許英欽 2002)。馮小黎等人研究發現無機鹽KH2PO4和 MgSO4‧7H2O對菌絲體生長都有顯著的作用(馮小黎 1995)。. （二）攪拌速率一般攪拌式發酵槽中，攪拌速率的大小是決定溶氧量的操作條件之一，適當地提高攪拌速率，不但能提高發酵液的溶氧量，還有助於菌絲生長以及產物的生成。但是過高的攪拌速率，其剪切力也將對菌體造成負面的影響，不但會抑制菌絲的生長及產物的生成，甚至造成細胞破裂。對於不同的菌種，最適當的攪拌速率也不一樣，因此在一個發酵工程上，考量適當的攪拌速率是必須的，為此可以改變操作條件，以達到最高的生產效率。. 23.

(35) （三）溫度微生物對生長環境中的溫度很敏感，大部分的微生物適合在溫度範圍為20 至40℃生長。然而每種微生物都有其生長所能承受的最低溫度、最適溫度及最高溫度。例如靈芝菌絲生長及的最適溫度範圍為 30-35℃，選擇適合菌體生長的溫度是很重要的(Yang and Liau 1998; 宋景平 2000; 臧晉, 羅建成 et al. 2007)。（四）pH 值一般在發酵的環境中，pH 值不但會影響微生物生長，另外pH 值的變化也會對副產物酸類物質、營養源的消耗、氧化還原反應與培養液的緩衝效果造成很大的影響。有文獻指出營養源的消耗與有機酸的生成會因為受到pH值的變動而影響到細胞膜的功能、細胞的型態與結構、鹽類在培養液的溶解度、受質的離子狀態、不同營養物質的消耗情形及代謝產物等(Forage, Harrison et al. 1985)。不同微生物有其最適合生長的pH 值範圍，而真菌類特別對低pH值有其特殊的容忍度，以最適合菌絲生長的pH 值範圍分布在4 到7 之間。（五）黏度(viscosity) 真菌菌絲經過液態培養分泌於胞外的高黏度多醣，往往是造成液態發酵形態改變的變因之一，多醣產生造成發酵液體黏稠，使發酵環境的供氧速率、攪拌效果及營養物與細胞間的輸送速率受到限制，導致. 24.

(36) 抑制代謝物抑或產物的生成(許英欽 2002)。（六）溶氧值(DO) 當耗氧菌內進行氧化反應，氧氣為代謝反應中的終端電子接受者，以產生能量供細胞活性的作用。由於在代謝過程有眾多酵素的參與，因此氧氣也有調節酵素之間的協調作用。因此，發酵環境中溶氧值的改變通常造成呼吸速率、酵素合成及代謝產物的生成(Forage, Harrison et al. 1985; Rau, Gura et al. 1992)。（七）接種量接種時種菌的形態大小、接種量以及當時的物理狀態都會嚴重地影響菌體在發酵槽內的生長形態，且較低的接種量適合球狀菌體的生成，較高接種量則較適合菌絲的生成，其原因在於高接種量下，初期菌絲體即因濃度較高而相互作用使得菌體無法呈現球狀形態，但是在 Aspergillus and Aspergillus nidulaus 中任何胞子接種濃度菌體皆會形成球狀(Metz and Kossen 1977)。另外，接種量的多寡也影響到發酵時間、發酵所生成的多醣產量以及菌重等，因此選擇適當的接種量在發酵操作上也是重要的課題。. 25.

(37) 第四節靈芝的成分及藥理特性. 根據現代科學家的研究指出，靈芝成分中主要具有藥性的有：多醣類（polysaccharides）、三萜類（triterpenoids，為靈芝苦味的來源）、蛋白質（proteins）、核酸（nucleic acid）、固醇類（steroids）等(Paterson 2006)。具有生理作用及藥效之研究成果如下列所述：一、抗癌作用（一）靈芝多醣之抗癌作用靈芝對於抗癌的主要成分為多醣體；具抗癌及免疫增加作用之靈芝多醣體為β型之高分子多醣體，即必須有C-6 側枝，（1-3）-β-D-gluco -pyr-anosyl-（1-3）-α-D-glucopyranosyl 之結構(Sone, Okuda et al. 1985)。可刺激巨噬細胞（macrophage）產生interlukin (IL) β，tumorcrosis factor (INF) -α、I L-6等細胞激素(cytokinase)及T cell釋放干擾素INF-γ (interferon)等，來增強免疫系統(Wang, Hsu et al. 1997)。Bao等人研究從靈芝得到(1-3)- α-D-glucan增強免疫活性。Berovic等人從靈芝深層發酵得到多醣體具有刺激免疫(Berovic, Habijanic et al. 2003)。（二）靈芝三萜類等化合物之其抗癌作用從靈芝孢子中分離出來的三萜類化合物, lucidimols A 和B、靈芝萜酮二醇(ganoderm anondiol)、靈芝醇(ganoderol) F 和靈芝萜酮三醇. 26.

(38) (ganodermanontriol) 對小鼠肉瘤Meth-A有細胞毒活性；而靈芝萜烯二醇(ganodermadiol)對小鼠LLCM eth-A有細胞毒活性(Min, Gao et al. 2000)。靈芝孢子的乙醇提取物經矽膠層析分離得到的三萜類能抑制 HeLa 細胞生長, 使細胞分裂停留在G1 期, 這些提取物能明顯降低細胞外鈣的濃度, 並能抑制Ras 癌蛋白並抑制癌細胞的轉化(Gao, Min et al. 2002)。靈芝子實體三萜類化合物進行小鼠灌胃後, 能抑制脾外移植的lewis 肺癌細胞的生長, 還能阻止轉移的腫瘤細胞浸潤到脾和肝臟(Kimura, Taniguchi et al. 2002)。Hu等人進行靈芝乙醇提取物對於MCF27 細胞的抗癌效應, 發現在一定劑量和時間下靈芝乙醇提取物能抑制細胞增殖, 凋亡蛋白Bax的正調節作用能誘導MCF27 程式性凋亡(Hu, Ahn et al. 2002)。靈芝孢子中分離出來的三萜類化合物具毒殺癌細胞株功能(Min, Gao et al. 2000; Wu, Shi et al. 2001)。靈芝分離得到的三萜類化合物具有毒殺Hep G2, Hep G2,2,15, and P-388等癌細胞的功能(Wu, Shi et al. 2001)。以外，本研究所探討的主要化合物lanostane 類之衍生物ganoderic acid Me ，其可經由提高免疫機能抑制癌細胞生長(Liu and Zhang 2007)，而ganoderic acid T則被發現具有促使肺癌細胞凋亡功能(Tang, Liu et al. 2006)。. 27.

(39) 二、降血壓作用靈芝三萜類化合物其主要為lanostane 類之衍生物某些三萜類化合物，其中Ganoderic acid F可抑制腎臟angiotensin converting enzyme(ACE)的活性，而達到降血壓的目的(Morigiwa, Kitabatake et al. 1986)。三、抗過敏作用由靈芝萃取的化合物如ganoderic acid A、ganoderic acid B、ganoderic acid C 和ganoderic acid D可以抑制histamine 釋放的功能(Kohda, Tokumoto et al. 1985)。四、降血糖與血脂作用主要為靈芝多醣體 glucan 之結構化合物，如ganoderan A、 ganoderan B 和ganoderan C，具有降血糖的功用(Hikino, Konno et al. 1985)，Ganoderan B 降血糖機制與血中胰島素的增加及加速葡萄糖代謝有關(Hikino, Konno et al. 1985; Hikino and Mizuno 1989)，靈芝多醣體能有效的降低糖尿病老鼠血液中血糖含量(Kiho, Hui et al. 1993)。除具降血糖之功能外亦具有抗發炎作用(Li, Zheng et al. 2004)。Hajjaj等從靈芝萃取得到26-oxygenosterols 可抑制膽固醇合成作用，可用於調降血脂肪功能(Hajjaj, Mace et al. 2005)。. 28.

(40) 五、免疫作用靈芝多糖具有廣泛的免疫調節活性, 能提高機體免疫活性。實驗證明, 大多數具有生理活性的靈芝多糖是β-D葡聚糖(Gao and Zhou 2003)。靈芝多糖提取物能提高癌症晚期病人的免疫功能。肺癌病人、乳腺癌病人、肝癌病人、前列腺癌患者、膀胱癌患者和腦癌患者, 用靈芝多糖治療兩周後, 發現原生質中L -2、L -6 和IFN-γ的濃度有顯著提高，N K 細胞活性增強, 而IL -1 和TN F-α的濃度明顯下降(Gao, Zhou et al. 2003)。亦有研究指出靈芝多醣體可提高宿主免疫能力，如 NK 細胞之增加等，以對抗移植之肉瘤細胞。所以多醣體是一種生物學反應調節劑長期服用可提高免疫系統(Ji, Tang et al. 2007)。多醣體能抑制人類單核白血球增殖，促進其分化成熟之巨噬細胞，具有吞噬及生成細胞質超氧化功能(Lei and Lin 1992) ，靈芝多醣(GL-B)也能促進介白素(interleukin IL-2)生成，明顯增強T 淋巴細胞的活性(Lei and Lin 1992)。此外由靈芝菌絲體中抽取的蛋白質成分具有增強免疫功能藥效(Hanlin and Ulloa 1979)，研究進一步發現由靈芝菌絲體中分離之蛋白質L-Z8(Ling Zhi-8)是一種免疫調節功能蛋白質，並可促細胞有絲分裂(van der Hem, van der Vliet et al. 1995) 。. 29.

(41) 六、保肝作用在膽汁阻塞引起小鼠肝硬化的實驗中, 靈芝蛋白多醣能降低血清中天冬氨酸轉移酶、丙氨酸轉移酶、鹼性磷酸酶和總膽紅素的含量, 同時能改善膠原蛋白和肝細胞的組織形態(Kim, Eo et al. 2000)。小鼠以芽孢桿菌、結核菌感染後同時服用靈芝多醣，能減輕中央靜脈周圍肝小葉出血和組織壞死, 以來減輕淋巴細胞的炎症浸潤(Zhang, Wang et al. 2002)。對肝受損之動物，靈芝可降低SGPT，則具有解毒之作用，並促進肝細胞再生(Li, Yang et al. 2006; Li and Wang 2006) 。七、抗氧化作用 Zhu等人從赤芝水煮提取物中得到含有三萜類成分的粗提物,觀察該粗提物對聯苯三酚誘導的紅細胞膜氧化以及Fe ( II)2抗壞血酸誘導的脂質過氧化反應的影響,受試物表現出劑量依賴性的抗氧化作用。進一步的分離提取證實該粗提物的主要成分是ganoderic acid A , B , C , D , lucidenic acid B 和ganodermanontriol (Zhu, Chang et al. 1999) 。八、抗病毒作用靈芝中的蛋白多糖有抗病毒活性, 與酸結合的靈芝多糖(A PBP) 有抗皰疹病毒(HSV ) 21 和HSV 22 的活性(Kim, Eo et al. 2000); 靈芝中triterpenes 具有抑制HIV-1 protease (Min, Nakamura et al. 1998)； Mothana等人之實驗證實Ganoderma pfeifferi 中lanostanoid 三萜成分. 30.

(42) 具有抗virus type A 及 HSV type 1的功能(Mothana, Awadh Ali et al. 2003)。九、抗血栓作用靈芝子實體中的核酸具有抑制血小板凝集作用(Shimizu, Yano et al. 1985; Kawagishi, Fukuhara et al. 1993)，另外，靈芝菌絲體中的核酸具有提升血液中Aldolase活性而抗血小板凝集(Lin, Tome et al. 1991)，Su 等從由靈芝萃取得ganodermic acid S 發現可抑制血小板凝集，使血小板凝集抑制劑prostaglandin E1引起 cyclic AMP合成，併與 PGE1協同作用抗血栓(Su, Shiao et al. 2000)。. 31.

(43) 第五節靈芝三萜類化合物之結構及功能. 於1982年，Kubota 等首先從靈芝G. lucidum的子實體中萃取而得的三萜類化合物命名為靈芝酸A、B (ganoderic acid A and B) 後迄今分離有超過130種新的三萜類化合物自靈芝的子實體、菌絲體和擔孢子中被發現(Shiao, Lee et al. 1994; Kim and Kim 1999; Paterson 2006)。 Table 2-1分析到2004年從不同靈芝的子實體、菌絲體和擔孢子中分離出具有生物活性之三萜類，Table 2-2分析到2004年靈芝成分具有藥理特性相關文獻。其它靈芝三萜類藥理相關研究到2006年後亦有研究被報導，目前已知lanostane 類之衍生物ganoderic acid Me可經由提高免疫機能抑制癌細胞生長(Liu and Zhang 2007)，另外lanostane 類之衍生物ganoderic acid T亦被研究具有促使肺癌細胞凋亡功能(Tang, Liu et al. 2006)。 Akihisa等研究從靈芝分離出一系列抗發炎及抗癌效果lanostane-type triterpene acids(Akihisa, Nakamura et al. 2007)，Ko從ganoderma lucidum and G. tsugae分離出triterpenoids and steroids具有抗發炎效果 (Ko, Hung et al. 2008)。由上述可知豐富的三萜類化合物提供了靈芝多樣的生理活性，但一百多種的三萜類化合物並非穩定的存在同一物種中，而隨著菌種、栽培方式、採收時期與萃取程序等的不同，改變其. 32.

(44) 中三萜類的組成與含量。靈芝從1982年來約有超過上百種以上的新三萜類被發現(Huie and Di 2004)，靈芝三萜類化合物分為四環三萜和五環三萜。從靈芝四環三萜類化合物的結構來看，這些化合物結構上多數屬於高度氧化態的羊毛甾烷衍生物，結構特徵是有著四個的環結構(Chyr and Shiao 1991; Kim and Kim 1999)如Fig.2-1所示。根據目前相關文獻報導並按其從靈芝分離出種類的多寡分四大類。第一大類為 ganoderic acids(Fig.2-2) 約40種，其次分別為ganoderiols (Fig.2-3)，lucidenic acids (Fig.2-4)， ganolucidic acids(Fig.2-5) (Paterson 2006)。 2004年曾祥麗將靈芝三萜類中最主要靈芝酸 37種化學名稱及結構做整理(Ganoderic acid A , B , C , C2 , DM , K ,LM2 , Ma , Mb , Mc , Md , Me , Mf , Mg ,Mh , Mi , Mj , P , Q , R , S1 , S2 , T , U , V ,W, X , Y, Z ,α,β,γ,δ,ε,ζ,η,θ)(曾祥麗 2004)，化學名稱及結構如Fig.2-6所示。. 33.

(45) Table 2-1、從不同靈芝分離出具有生物活性之三萜類 (Huie and Di 2004) Triterpene/triterpenoid Ganoderic acid A Ganoderic acid B Ganoderic acid C1 Ganoderic acid C2 Ganoderic acid D Ganoderic acid E Ganoderic acid F Ganoderic acid G Ganoderic acid H Ganoderic acid R Ganoderic acid S Ganoderic acid LM2 Ganoderic acid α Ganoderic acid β Ganoderic acid γ Ganolucidic acid A Ganolucidic acid D Ganoderiol A Ganoderiol B Ganoderiol F Ganodermanondiol Ganodermanontriol Lucidenic acid A Lucidenic acid N Lucidumol A Lucidumol B Lucialdehyde B Lucialdehyde C Methyl ganoderate A Tsugaric acid A Tsugaric acid B Tsugaric acid C. Source. Reference. Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Cultured mycelia of G. lucidum Cultured mycelia of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Spores of G. lucidum Spores of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. lucidum Fruiting body of G. tsugae Fruiting body of G. tsugae Fruiting body of G. tsugae. 34. [16,28,32,37,49,51,52] [26,39] [16,43,44,49,51,52] [26,39] [32,37,43,46,51] [26] [43,49] [35] [32,47] [36,43,47] [45,47] [49,52] [39] [47,49,51,52] [27] [27] [50] [51] [26] [50] [26] [47] [35] [29,51] [29,45,49,51] [51] [26] [26] [37] [29,37,45,51] [26] [36,47,48] [36] [26] [26] [37] [37] [43] [31] [31] [34].

(46) Table 2-2、分析到2004年靈芝成分具有藥理特性相關文獻 (Paterson 2006) Compound. Effect. Reference. Adenosine. Antiplatelet aggregation. Kawagishi et al. (1993), Shimizu et al. (1985). Lectins. Mitogenic. Ngai and Ng (2004). Polysaccharides Antifibriotic. Park et al. (1997). Antiherpetic. Eo et al. (1999a,b, 2000), Kim et al. (2000), Oh et al. (2000). Anti-inflammatory. Ukai et al. (1983). Hepatoprotective. Zhang et al. (2002). Hypoglycaemic. Hikino et al. (1985, 1989), Hikino and Mizuno(1989), Tomoda et al. (1986),Zhang and Lin (2004 ). Immuno-modulatory – anti-tumour. Gao et al. (2000a,b), Li et al. (2000),Li and ,Zhang (2000), Ooi et al. (2002), Sasaki et al.(1971), Sone et al. (1985). Miscellaneous (radiation protection,. Kim and Kim (1999b), Lee et al.(2001). DNA damage, anti-oxidant). Protein (“LZ-8”) / Immunodulatory, Immunosuppressive Terpenoids and related compounds. van der Hem et al. (1995) /. Anti-bacterial. Smania et al. (1999). “Anti-complement”. Min et al. (2001). Anti-inflammatory. Kleinwa‥chter et al. (2001). Anti-oxidant. Zhu et al. (1999). Antiplatelet aggregation. Shiao (1992). Antiviral. El-Mekkawy et al. (1998), Mothana et al. (2003). Cytotoxicity. Gao et al. (2002), Gonzalez et al. (2002), Kimura et al. (2002), Lin et al. (1991), Su et al. (2000), Wu et al. (2001). Enzyme inhibitors. Lee et al. (1998). Hepatoprotective. Chen and Yu (1999), Kim et al. (1999). Hypolipidemic (chloresterol inhibitors). Komoda et al. (1989), Shiao (1992). Hypotensive. Morigiwa et al.(1986). 35.

(47) Fig.2-1 靈芝25種oxygenated triterpenoids結構式，including eight pairs of stereoisomers and five pairs of positional isomers (Chyr and Shiao 1991; Huie and Di 2004) 36.

(48) Fig.2-2 Ganoderic acid結構式 (Nishitoba, Sato et al. 1985; 曾祥麗 2004). Fig.2-3 Ganoderiol結構式 ( Sato, Nishitoba et al. 1986; 曾祥麗 2004). 37.

(49) Fig.2-4 Lucidenic acid結構式 ( Nishitoba, Sato et al. 1985; 曾祥麗 2004). Fig.2-5-1 Ganolucidic acid D結構式 D : R1 = O R2 = R3 = R5 = H R4 =β-OH C23 =OHΔ24(25) (Nishitoba, Sato et al. 1985; Nishitoba, Sato et al. 1986; 曾祥麗 2004). 38.

(50) Fig.2-5-2 Ganolucidic acid E結構式 E : R1= O R2= R4 = H R3 = OH C26 = COOCH3 (Nishitoba, Sato et al. 1985; Nishitoba, Sato et al. 1986; 曾祥麗 2004). 39.

(51) Fig.2-6 Ganoderic acid 結構式 (A , B , C , C2 , DM , K ,LM2 , Ma , Mb , Mc , Md , Me , Mf , Mg ,Mh , Mi , Mj , P , Q , R , S1 , S2 , T , U , V ,W, X , Y, Z ,α,β,γ,δ,ε,ζ,η,θ)(曾祥麗 2004) 40.

(52) 第六節靈芝多醣體及結構. 靈芝多醣體由數十萬到數百萬的葡萄糖組合而成，是一種螺旋狀立體構形。目前已分離到的200多種中大部分為β-D-glucan，大多存在於靈芝細胞壁內壁，不溶於高濃度的酒精中，但可在熱水中溶解。靈芝 (Ganoderma lucidum)多醣，是具β-(1,6)-D-glucosyl 分支的β-(1,3)-D葡聚醣，用X-ray 繞射分析如Fig.2-7，以β-1,3 鍵結的D-glucan 骨架呈現三股鏈右螺旋(helix)結構如Fig.2-8，而這種螺旋型結構可能是引發抗腫瘤作用的重要因素(水野卓 1997)，因此β-1,3-D-glucan 含量越高，其抗癌活性越高。多醣分支度多寡與分子量大小都會影響其活性表現， Table2-3為從不同靈芝分離出具有生物活性之多醣體分子量整理(Huie and Di 2004)。目前已證實具有調節免疫的能力，β-(1,3)-D-glucan抗癌機制作用並非直接殺死或是抑制癌細胞，經由提高人體的免疫能力來表現其抗癌活性，如促進Interleukin-2( IL-2)分泌而增加T細胞數目和能力 (Lei and Lin 1992)。. 41.

(53) Fig.2-7 β-(1-3)-D-葡聚糖結晶結構(用 X 射線衍射)(水野卓 1997). Fig. 2-8 具抗腫瘤活性的 β-(1,6)分支的 β-(1,3)-D-葡聚糖結構 (水野卓 1997) 42.

(54) Table 2-3、從不同靈芝分離出具有生物活性之多醣體 (Huie and Di 2004) Polysaccharide. Molecular weight. Source Reference. SP. 1.0 × 104. Spores of G. Lucidum. [111]. PL-1. 8.3 ×103. Fruiting body of G. lucidum. [112]. PL-3. 6.3 ×104. Fruiting body of G. lucidum. [112]. PL-4. 2.0 ×105. Fruiting body of G. lucidum. [112]. PSGL-I-1A. 7.18 ×105. Spores of G. Lucidum. [113]. Ganoderan A. 2.3 ×104. Fruiting body of G. lucidum. [87]. Ganoderan B. 7.4 × 103. Fruiting body of G. lucidum. [86,87]. Ganoderan C. 5.8 ×103. Fruiting body of G. lucidum. [86]. GL-1. 4.0 ×104. Fruiting body of G. lucidum. [115]. G-A. 8.2 ×104. Fruiting body of G. sinense. [115]. FI0-b-α. 1.0 ×104. Mycelia of G. Tsugae. [85]. FA-1-b- α. 1.6 × 104. Mycelia of G. tsugae. [85]. TGLP-2. 2.1 ×105. Fruiting body of G. tsugae. [88]. TGLP-3. 4.5 ×104. Fruiting body of G. tsugae. [88]. TGLP-6. 3.2 ×104. Fruiting body of G. tsugae. [88]. TGLP-7. 1.0 ×105. Fruiting body of G. tsugae. [88]. 43.

(55) 第三章實驗部分. 第一節實驗試劑與儀器設備一、實驗試劑 Table 3-1、實驗試劑藥品名稱 Glucose 葡萄糖 Sorbitol. 廠牌波斯特生物科技. 實驗用途培養基. SIGMA. 培養基培養基. 培養基培養基. KH2PO4. (BD)Becton, Dickinson (BD)Becton, Dickinson 波斯特生物科技 (BD)Becton, Dickinson (BD)Becton, Dickinson J.T.Baker. K2HPO4. J.T.Baker. 培養基. MgSO4 ． 7H2O. J.T.Baker. 培養基. NaCl. 波斯特生物科技. 培養基. 化學名稱 C6H12O6. Potato Dextose Agar( PDA) Potato Dextose Broth( PDB) Agar Peptone Yeast extract 酵母萃取物 Potassium dihydrogen Phosphate 磷酸二氫鉀 Potassium Phosphate 磷酸氫二鉀 Magnesium sulphate-7-Hydrate 硫酸鎂 Sodium Chloride 氯化鈉. 44. 培養基. 培養基培養基.

(56) Phenol 酚. C6H5OH. J.T.Baker. 總糖分析. Sulfuric Acid 硫酸 Ethyl Alcohol 乙醇 Methol 甲醇 Acetic Acid 醋酸 Chloform 氯仿. H2SO4. Merck. 總糖分析. C2H5OH (95%) CH3OH. 靈芝酸分析. CH3COOH. 台灣省菸酒公賣局 Mallinckrodt Chemical J.T.Baker. CHCL3. Merck. 靈芝酸分析. Sodium Hydroxide 氫氧化鈉 Sodium hydroxide Carbonate 碳酸氫鈉 Hydrochloric acid 鹽酸. NaOH. Merck. 總糖分析. NaHCO3. Merck. 靈芝酸分析. HCL. Merck. 靈芝酸分析. 45. 靈芝酸分析靈芝酸分析.

(57) 二、實驗儀器與設備實驗儀器與設備如Table 3-2。 Table 3-2、實驗儀器與設備設備樣品培養分析系統. 儀器設備名稱無菌操作台高溫高壓滅菌釜酸鹼電極測定儀去離子水製造機恆溫振盪培養箱 ORBITAL SHAKER INCUBATOR 錠劑粉碎機均質機減壓濃縮機. 規格型號 Autoclave(TM-328) Denverinstrument 18.2MΩ-cm. 製造廠商造鑫 TOMIN ULTRA BASIC Millipore-RO 10. LM-570R. YIH DER. HC-848. 永和. 12 Speed Osterizer Blender Coolace CCA-110. Osterixer EYELA. Evaporatr N-1000 Digital water bath SB-1000 雜交烘箱DNA Hybridization Oven 水振機 Transsonic 780/H. YIH DER ELMA. 恆溫循環水槽. BH-230. YIH DER. 電子天平高效能液相層析儀 (HighPerformance. GF 400 Pump L-2130. AND HIACHI. Autosampler L-2200 46.

(58) Liquid Chromatography, HPLC D-2000). Diode Array Detecor L-2455. HPLC Column. Mightysil RP-18GP250-4.6(5μm). 紫外光偵測器. DU 800. 桌上型冷凍離心機 Centrifage 5810R 桌上型微量離心機 Legend Micro 17. 47. BECKMAN COULTER EPPENDORF Thermo.

(59) 第二節實驗材料. 本研究使用的靈芝固態平面培養基之組成如下表所示。一、固態培養基本實驗使用的固態培養基如Table 3-3、Table 3-4所示。 Table 3-3、固態PDA(Potato Dextrose Agar)培養基組成成份(PDA ). 含量g/每100ml去離子水. Potato Starch Dextrose Agar. 0.4 g 2.0 g 1.5 g. PDA(Potato Dextrose Agar). 3.9 g. Table 3-4、固態培養基組成(SGCM)(Ko, Leem et al. 2001) 成份. 含量g/每100ml去離子水. Agar. 1.5. Glucose. 4. Yeast-extract. 0.5. Malt-extract. 0.5. Pepton. 0.5. K2HPO4. 0.1. KH2PO4. 0.046. MgSO4‧7H2O. 0.05. 48.

(60) 二、液態培養基本實驗使用的液態培養基如Table 3-5、Table 3-6所示。 Table 3-5、液態PDB (Potato Dextrose Agar)培養基組成. 成份(PDB). 含量g/每100ml去離子水. Potato Starch Dextrose PDB(Potato Dextrose Broth ). 0.4 g 2.0 g 2.4 g. Table 3-6、液態培養基組成 (SGCM)(Ko, Leem et al. 2001) 成份. 含量g/每100ml去離子水. Glucose. 4. Yeast-extract. 0.5. Malt-extract. 3. Pepton. 0.5. K2HPO4. 0.1. KH2PO4. 0.046. MgSO4‧7H2O. 0.05. 49.

(61) 第三節實驗菌株. 本實驗使用靈芝 (Ganoderma lucidum) 購自食品所菌種生物資源保存研究中心(Bioresearch collection and Research center)，編號BCRC 36111, 36674。進行實驗所用菌體是以 PDA平板28℃培養活化為接種種源。. 50.

(62) 第四節實驗方法. 一、實驗設計流程菌株BCRC 36111, 36674於固態及液態培養基振盪或靜置培養，測量菌絲乾重，ganoderic acid Me ，總靈芝酸量及胞內多醣量含量如 Fig.3-1所示。. 菌源 G. lucidum. BCRC 36111. BCRC 36674. PDB,SGCM. PDA,SGCM. PDB shaking. PDA. Shaking 28℃. 28℃. 28℃,120rpm. 28℃. PDB,SGCM no. PDB no. shaking 28℃. Shaking 28℃. 菌絲乾重. 靈芝三萜量. 總靈芝酸量. Fig.3-1 實驗設計流程圖. 51. 胞內多醣量.

(63) 二、培養基配製及種菌 1. 固態培養基配製及種菌 Potato Dextose Agar (3.9 g/100ml)，簡稱(PDA)，以 3.9g 溶於 100ml 蒸餾水中，以 121℃、25 分鐘之條件滅菌後，分別倒 25 ml/plate 各 4 個，置於培養皿中待其冷卻凝固後接入 5mg 菌源 G. lucidum，置於 28℃ 恆溫培養箱中。接種 BCRC36111，BCRC36674 菌種培養 1 星期，2 星期，3 星期，4 星期後收菌絲產量，測三萜、總靈芝酸、胞內多醣產量。 2. 液態培養基配製及種菌 Potato Dextose Broth (2.4g/100ml)，簡稱(PDB)，以 o.6g 及 25ml 蒸餾水置入 250 ml 的三角錐瓶，以 121℃、25 分鐘之條件滅菌後。待其冷卻凝固後接入 5mg 菌源 G. lucidum，至於 28℃恆溫培養箱中，以轉速 120rpm，分有振盪(shaking)及靜置(no shaking) 兩組培養。接種 BCRC36111，BCRC36674 菌種培養 1 星期，2 星期，3 星期，4 星期後收菌絲產量，測三萜、總靈芝酸、胞內多醣產量。. 52.

(64) 3. 探討水份潛勢對靈芝三萜類的影響將 BCRC 36674 在 PDA 培養 7 天後，菌絲再轉植到 PDB 及分別含 NaCl(0.5M,1M,2M,4M)和 Sorbitol(1M,2M,4M)靜置培養 5 天，以高效能液相層析儀(HPLC)來進行分析測靈芝三萜類產量。觀察 NaCl 及 Sorbitol 對三萜類產量的影響。. 53.

(65) 二、菌重及代謝物分析方法 1. 菌體乾重於液態培養基培養之菌絲，以濾紙過濾後用蒸餾水清洗菌體三次，將所得到之菌絲取出置於50℃烘乾稱重；於固態培養基培養之菌絲則直接取下併烘乾稱重。 2. 靈芝三萜分析法菌絲稱重100mg，用N2(l)冷凍後磨成粉，加入3ml methanol 溶解，再以0.22μm濾頭過濾後，注入20μL 於層析管柱中。以高效能液相層析儀(HPLC)來進行分析，對照標準品Thymol濃度製成標準檢量線，計算所含的三萜量。 HPLC分析使用實驗條件：（1）管柱：Mightysil R P-18GP250-4.6(5μm) （2）移動相：Eluent A , methanol-acetic acid(100：0.5,v/v)； Eluent B, water-acetic acid(100：0.5,v/v)； Gradient eluent stared 80% methanol,increased linearly to 84% in 15 min,to 86% in further 15 min,to 88% in 10 min,to 94% in a further 10 min and finaly to 100% in 20 min. （3）流速：1ml/min （4）偵測儀：L-2455 UV-VIS Detector （5）偵測波長：243nm 54.

(66) 3. 總靈芝酸分析法 (Tang and Zhong 2002) （1）取菌絲稱重50 mg，用N2(l)冷凍後磨成粉，加入3ml 50% (v/v) 的酒精萃取12 小時。（2）將萃取液放入真空濃縮機下在50℃進行濃縮至乾。（3）加3ml水回溶並加入3ml chloroform 萃取。（4）吸取chloroform層加入3ml 5%(w/v) NaHCO3萃取。加入 2 N HCl 調整 pH ，使溶液之 pH 值＜3.0。（5）取CH3Cl3層以40 ℃蒸餾移除chloroform。（6）加 3 ml 100% ethanol 溶解靈芝酸後以UV 245 nm測吸光值。（7）對照標準品Thymol濃度製成標準檢量線，計算所含的總靈芝酸含量。 4. 靈芝胞內多醣分析(Dubois, Gilles et al. 1956; Tang and Zhong 2002) （1）菌絲稱重50mg，用N2(l)冷凍後磨成粉，加入5ml 1M NaOH。放到60℃、加熱1 hours 完成後，高速離心。（2）吸取上層萃取液稀釋。（3）使用酚-硫酸呈色法分析，吸 0.5ml 於試管，加入0.5ml 5﹪ Phenol，再加入2.5ml濃硫酸，均勻混合後，取出以分光光度計在490nm波長下測其吸光值。（4）對照標準品Glucose濃度製成標準檢量線，計算所含的總醣含量。. 55.

(67) 第五節統計方法. 將實驗得到結果利用Microsoft Excel (2003)及SPSS 17統計分析，各平均值皆和其標準偏差一起顯示(mean±SD)，以Sigma plot 10.0繪製成圖表。. 56.

(68) 第四章實驗結果. 第一節靈芝菌絲產量分析. 一、固態及液態培養基對靈芝菌絲產量之影響菌株 BCRC 36111 以固態培養基(PDA)及液態培養基(PDB)靜置或振盪培養，培養一星期後 PDA 產量可達 0.21 g/substrate 且菌絲產量不會隨培養天數增加。PDB 靜置培養及振盪培養生長較緩慢， PDB 靜置培養一星期後產量 0.05 g/substrate，需培養四星期後菌絲產量 0.09 g/substrate 才可達到最高產量。PDB 振盪培養一星期後產量 0.04 g/substrate ，需培養三星期後菌絲產量 0.10 g/substrate 才可達到最高產量，且菌絲產量不會隨培養天數增加如 Fig.4-1 所示。由研究結果發現固態培養基 PDA 培養的菌絲產量遠較液態培養基 PDB 產量高。 BCRC 36111 若以固態及液態培養基 SGCM 進行靜置或振盪培養，以固態 SGCM 培養一星期後菌絲產量為 0.16 g/substrate ，菌絲產量會隨培養天數增加到第三星期可達最高產量 0.27 g/substrate。液態 SGCM 靜置培養一星期後菌絲產量 0.13 g/substrate ，且菌絲產量會隨培養天數增加，到第三星期可達最高產量 0. 49 g/substrate。SGCM. 57.

(69) 振盪培養一星期後菌絲產量 0.07 g/substrate ，培養至第三星期可達 0.29 g/substrate 最高產量(Fig.4-2)。由研究結果發現液態培養基 SGCM 靜置培養的菌絲產量遠較固態培養基 SGCM 產量高。菌株 BCRC 36674 以固態培養基(PDA)及液態培養基(PDB) 靜置或振盪培養，培養一星期後 PDA 產量可達 0.11 g/substrate 到第四星期可達 0.19 g/substrate 最高產量。PDB 靜置培養一星期後產量 0.05 g/substrate 且菌絲產量會隨培養天數增加到第四星期可達 0.10 g/substrate 最高產量。PDB 振盪培養一星期後產量 0.02 g/substrate ，到第三星期可達 0.06g/substrate 最高產量如 Fig.4-3 所示。由研究結果發現固態培養基 PDA 的菌絲產量較液態培養基 PDB 產量高。. 二、不同營養配方對靈芝菌絲產量之影響 BCRC 36111 以固態之 SGCM 及液態之 SGCM 培養二到四星期後，其菌重均高於固態之 PDA 及液態之 PDB 培養基。在培養三星期後，液態 SGCM 靜置培養可獲得菌重 0. 49 g/substrate ，為培養基 PDB 菌絲重的 5 倍如 Fig.4-1,4-2 所示。由研究結果發現 BCRC 36111 無論以固態或液態之 SGCM 培養基進行培養，所生產的菌絲量遠較以固態培養基(PDA)及液態培養基(PDB)培養之產量高。結果顯示不同營養組成的培養基對靈芝菌絲產量提升確實有重要影響。. 58.

(70) 三、不同菌株對菌絲產量比較菌株 BCRC 36111 以固態(PDA)培養一星期後，其菌絲重即可達到最高量為 0.21 g/substrate。菌株 BCRC 36674 固態 PDA 培養一星期後其菌絲重為 0.11g/substrate，需培養四星期後產量才達到飽和 0.19 g/substrate。由研究結果發現 BCRC 36111 在短時間(一星期) 即可獲得大量菌絲體(Fig.4-1,4-3)。若以 PDB 培養基進行靜置或振盪培養，BCRC 36111 菌絲生長之速度亦較 BCRC 36674 快(Fig.4-1,4-3)。此外 BCRC 36111 分離株菌絲較厚且緊緻，而菌株 36674 菌絲生長則較緩慢且較薄、細緻、枯黃。. 59.

(71) PDA PDB(S) PDB(N,S). 0.24 0.22. Biomass (g/substrate). 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 1. 2. 3. 4. week. Fig.4-1 BCRC 36111 以不同培養基培養之菌重. BCRC 36111 以固態培養基 PDA 及液態培養基靜置(PDB,NS)或振盪培養(PDB,S,120 rpm)，培養一到四星期菌絲產量。結果發現 PDA 培養一星期菌絲產量最高。. 60.

(72) 0.6 SGCM SGCM(S) SGCM(N,S). Biomass(g/substrate). 0.5. 0.4. 0.3. 0.2. 0.1. 0.0 1. 2. 3. 4. week. Fig.4-2 BCRC 36111 以 SGCM 培養基培養之菌重. BCRC 36111 以固態培養基 SGCM 及液態培養基靜置(SGCM,NS)或振盪培養(SGCM,S,120 rpm)，培養一到四星期菌絲產量。結果發現 SGCM 靜置培養三星期菌絲產量最高。. 61.

(73) 0.22 0.20. PDA PDB(S) PDB(N,S). Biomass (g/substrate). 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 1. 2. 3. 4. week. Fig.4-3 BCRC 36674 以不同培養基培養之菌重. BCRC 36674 以固態培養基 PDA 及液態培養基靜置(PDB,NS)或振盪培養(PDB,S,120 rpm)，培養一到四星期菌絲產量。結果發現 PDA 培養四星期菌絲產量最高。. 62.

(74) 第二節靈芝三萜成分(ganoderic acid Me)產量分析. 一、三萜成分 ganoderic acid Me 之 HPLC 圖譜及結構式. 本實驗靈芝的成份指標準品是由 Chyr and Shiao 等所提供，分離出 HPLC 圖譜及結構式如 Fig.4-4，4-5 所示。本實驗三萜主要看 35 min peak ,OD (243 nm) 吸光值下的面積如 Fig.4-4 所示。此 peak 結構式已被分離出(Chyr and Shiao 1991)，化學名 ganoderic acid Me(Nishitoba, Sato et al. 1988)及結構式如 Fig.4-6 所示。. Fig. 4-4 靈芝標準品ganoderic acid Me在35分鐘的HPLC圖譜. 63.

(75) Peak 28 min structure ：R1 =α-OAc, R2= OH , R3= H2 , R4= H2 Peak 31 min structure ：R1 =β-OAc, R2 = OH , R3= H2 , R4= H2 Peak 35 min structure ：R1 =α-OAc, R2 = OAc, R3= H2 , R4= H2 Peak 39 min structure ：R1 =β-OAc, R2 = OAc, R3= H2, R4= H2 Fig. 4-5 靈芝標準品 HPLC 圖譜 4 個波峰結構式 (Chyr and Shiao1991). Fig. 4-6 ganoderic acid Me 的結構式(GA-Me) (Chyr and Shiao 1991) 64.