根據行政院衛生署公告2008 年國人十大死亡原因，惡性腫瘤、心臟 疾病、腦血管疾病等依序排前幾名。因此現代人非常注重養生保健之 道，所以「保健性食品」或其他醫藥上特用化學品的開發上，已成為新 興的研究重點。靈芝 Ganoderma lucidum 是我國著名的藥用真菌，靈芝 的藥理成分非常豐富，現代藥理和營養學研究證明，靈芝含有多種生物 活性成分，如多醣、靈芝三萜、甾醇、核酸、蛋白質、多肽、脂肪酸等 (水野卓 1997; Paterson 2006)，其中多醣和三萜是靈芝最關鍵的生物活 性物質或藥效成分。
現今靈芝由於市場需要大，傳統的栽培方法靈芝的生長週期長至少需 要3-5 個月；利用現代生物技術之液體發酵生產靈芝菌絲體，生產週期 短且不受季節的影響，且生產效率高。因此許多研究著重於如何以菌絲 培養方式來大量生產菌絲體、靈芝酸、多醣體等有效成分(Yang and Liau 1998; Fang and Zhong 2002; Fang and Zhong 2002; Tang and Zhong 2002;
Hsieh, Tseng et al. 2006; Xu, Ding et al. 2007)。
靈芝的藥理成分經現代藥理和營養學研究證明，靈芝含有多種生物活 性成分，其中多醣和三萜是靈芝是最關鍵的生物活性物質及藥效成分
。
and 楊春清 2006)，多數為高度氧化的羊毛固烷烷衍生物(lanostane-type triterpenes) 。
目前以菌絲體進行靈芝酸生產研究中，均是探討總靈芝酸之生成，並 沒有針對特定靈芝酸之生成進行探討。在本研究中我們利用HPLC的分 析系統探討不同培養條件對特定lanostane-type三萜化合物(ganoderic acid Me, ganoderic acid T)等生合成之影響。目前已知ganoderic acid Me 可經由提高免疫機能而抑制癌細胞生長(Liu and Zhang 2007)，另外 ganoderic acid T亦被研究具有促使肺癌細胞凋亡功能(Tang, Liu et al.
2006)。因此如何大量開發生產此類化合物為一重要之研究課題。
靈芝菌株BCRC 36111, BCRC 36674等菌株之多種lanostane-type三萜 化合物已被分離出來，並確定其結構式(Chyr and SHIAO 1991)。蕭 等人亦建立HPLC的分析系統，可快速的偵測各種三萜成份之含量(Chyr and SHIAO 1991)，其中包含ganoderic acid Me及ganoderic acid T，本研 究即利用此一系統來探討此類化合物的生合成。
本實驗中利用含有相同營養源之固態平板培養基以及液態培養基培 養BCRC 36111及BCRC 36674，實驗結果發現以固態PDA培養基進行培 養，可大量提升ganoderic acid Me成份產生，於固態培養基PDA培養一 個月後的三萜產量1.55 (mg/100mg菌絲)，為液態靜置培養基PDB 的三 萜產量0.20( mg/100mg菌絲)之8倍。菌株BCRC 36674於固態培養基PDA
培養四星期後的三萜產量11.28( mg/100mg菌絲) ，比液態靜置培養基 PDB的三萜產量3.50( mg/100mg 菌絲)高3倍，因此在生產lanostane-type triterpenes類的三萜化合物時固態培養基為較好的培養系統。
我們進一步探討固態及液態培養基影響lanostane-type三萜成分產生量 的可能因素，為確定是否是培養基中水分潛勢的差異而影響代謝物之生 合成，於液態PDB培養基中添加不同濃度的NaCl及Sorbitol以降低培養基 之水分潛勢，結果發現添加NaCl 1M，2M時可增加三萜成分的生合成，
但是添加Sorbitol確會減少三萜成分之產生。由結果可推論於固體PDA 培養基造成三萜成分增加的原因並不是因為培養基中水分潛勢較低所 造成。在本研究亦發現增加培養基的離子濃度(如NaCl) 會增加三萜成分 的生合成，未來可利用添加鹽類的培養基來增加lanostane-type三萜成分 之產生。此外，由文獻得知菌絲體生長於固態與液態不同環境下其菌絲 形態結構不同，由廖仁宏對固態培養生產靈芝菌絲體之研究發現固態培 養菌絲體同時具有生殖菌絲、骨骼菌絲、纏繞菌絲，是一種三次元菌絲，
其原基結構已有分化，只差無出菇的現象，是一種三級菌絲。而液態培 養之菌絲球，僅具有生殖菌絲及少數的骨骼菌絲，屬於二次元菌絲，並 無分化現象，僅是次級菌絲(廖仁宏 2003)。由實驗結果發現，兩株菌 (BCRC 36111及36674)於固態及液態培養基進行培養產生ganoderic acid
同，因而造成代謝產物產量不同，可進一步做相關研究探討。
菌株BCRC 36111以固體SGCM及PDA培養基進行，培養一個月後發現 SGCM固態培養其ganoderic acid Me產量極低，固體PDA 培養其
ganoderic acid Me量是1.55 (mg/100mg菌絲)。由本實驗研究結果發現 PDA固體培養其三萜產量遠大於是SGCM固體培養產量。根據Fang等人 研究發現培養基中當添加glucose含量至50g/l,peptone 5g/l ,yeast extract 5g/l可提升靈芝酸產量到最高量(Fang and Zhong 2002)。本實驗中BCRC 36111於PDA及SGCM中培養一星期後，lanostane-type三萜產量並無非常 大之差異，由此可推論較高glucose濃度，peptone, yeast extract會促進其 它非lanostane-type三萜之產生，在培養一個月後以PDA培養之三萜產量 遠高於SGCM固體。因此推論PDA培養基應該含有特殊成份可促進靈芝 三萜形成，其中potato starch萃取物成份複雜是否與三萜生成量有影響須 要進一步研究探討，所以這方面訊息應值得做為日後研究開發與探討。
此外亦有許多研究指出培養基中使用不同營養源會改變靈芝酸產 量，例如：培養基中添加 lactose 進行培養可得到靈芝酸量最高(Tang and Zhong 2002)。當培養基中添加 glucose 及 peptone 有助於靈芝酸產量(Xu, Ding et al. 2007)。在本研究中所使用之 SGCM 培養基亦含有等量
yeast-extract 及 pepton ，而且 glucose 含量 40g/l 亦較 PDA 所含 glucose (20g/l)高。
前人研究中發現培養基組成添加適當的氮源、碳源、酵素、微量礦物 質確實會影響菌絲生長發育以glucose-ammonium chloride medium 當碳 源、氮源所得菌絲濃度達到最高(Yang and Liau 1998)。以 glucose 當碳 源、以peptone 當氮源有助於菌絲細胞生長和靈芝酸產量(Xu, Ding et al.
2007)。以 maltose, lactose, glucose 當碳源可增加菌絲體生長(Tang and Zhong 2002)。以 brown sugar 或 lactose 當碳源相較於 frucotose,
glucose,malt extract,sucrose 可增加菌絲生長體(Chang, Tsai et al. 2006)。
Fang 等人指出提高 glucose 含量至 50g/l 可提高菌絲之生長，當提高 peptone 5g/l, yeast extract 5g/l 亦有提高菌絲產量(Fang and Zhong 2002)。在本研究中所使用之 SGCM 培養基亦含有等量 yeast-extract 及 Pepton，由實驗結果發現不論 SGCM 以固態及振盪或靜置培養所獲得菌 絲體乾重均比PDA 及 PDB 振盪或 PDB 靜置培養高。有可能是因為 SGCM 中含有 glucose, yeast-extract,Pepton 等營養源造成，然而以 PDA 培養所產生三萜量遠高於SGCM 培養，因此 PDA 培養基較適合生產三 萜化合物。
不同菌株對三萜產量比較，菌株BCRC 36111 以固態培養基 PDA 培養 四星期後其三萜產量1.55 (mg/100mg 菌絲)達到最高量。菌株 BCRC 36674 以固態培養基(PDA)，培養四星期後其三萜產量達 11.28
顯示BCRC 36674 這菌株適合大規模栽培量產三萜。
在培養天數對總靈芝酸產量的影響之研究方面，Fang 等人以不同培養 基配方進行培養，培養基添加適當營養源當提高glucose 含量至 50 g/l 培養到第10 天靈芝酸最高，當 peptone 5g/l, yeast extract 5g/l 培養到第 8 天靈芝酸產量最高(Fang and Zhong 2002)。Tang 等人研究發現以 lactose 當碳源進行培養發現培養12 天可得到靈芝酸最高(Tang and Zhong 2002)，由此可知靈芝酸培養 8-12 天後可較高總靈芝酸產量。由實驗結 果得知兩菌株BCRC 36111 及 36674 以固態培養基(PDA)及液態培養基 (PDB)振盪或靜置培養進 14 天後靈芝酸達到最高，本實驗所得之數據與 前人研究相似。
在固態及液態培養基對總靈芝酸產量的影響方面，由實驗結果發現菌 株BCRC 36111 及 BCRC 36674 以固態及液態靜置培養方式對靈芝酸產 量差異不大。此外比較不同菌株總靈芝酸產量的差異，兩菌株BCRC 36111 及 36674 以固態培養基(PDA)培養二星期後靈芝酸產量可達 36.61mg/g 菌絲及 29.74mg/g 菌絲產量最高。BCRC 36111 所產生總靈芝 酸較BCRC 36674 為高，顯示 BCRC 36111 這菌株適合大規模栽培量產 靈芝酸。
對不同時間對靈芝胞內多醣體產量的影響情形，由文獻得知Fang 等 人以不同培養基配方進行培養，培養基添加適當營養源當提高glucose
含量至50 g/l 培養到第 10 天胞內多醣體最高，當 peptone 5g/l 培養到第 8 天胞內多醣體最高；當 yeast extract 10g/l 培養到第 8 天胞內多醣體產 量到最高量(Fang and Zhong 2002)。Tang 等人研究發現以 lactose 當碳源 進行培養發現培養12 天可得到胞內多醣體最高(Tang and Zhong 2002)。
Yang 等人研究發現靈芝液體發酵培養 7 天可得最大量靈芝多醣 (Yang and Liau 1998)。綜合以上文獻得知，靈芝在菌絲培養 7-12 天可獲得較 高多醣體產生，本實驗數據亦發現在培養7-14 天後即可得到較高的胞內 多醣產量。
比較不同菌株胞內多醣產量的差異，36674 以不同方式進行培養均可 得到較高的胞內多醣產量。菌株BCRC 36111 以液態培養基獲得最高胞 內多醣為126.44 mg/g 菌絲。菌株 36674 則以固態培養基(PDA)培養產生 最多的胞內多醣產量可達272.53mg/g 菌絲。因此 BCRC 36674 菌株較適 合大規模栽培量產胞內多醣。
第六章結論
本研究的主要目的是探討不同培養條件對靈芝ganoderic acid Me 抗癌 成分，多醣體及靈芝酸產量影響，期望能夠找出提高靈芝代謝物產量的 方法。茲將實驗結果總結歸納出以下幾點：
一、固態培養基及液態培養基對ganoderic acid Me 產量之影響
由研究結果發現BCRC 36111 以固態 PDA 培養所產生的 ganoderic acid Me 量會隨培養天數增加而上升，培養四星期後每 100mg 菌絲可獲得 ganoderic acid Me 1.55 mg ，為液態靜置培養基 PDB 產量的 8 倍。
菌株BCRC 36674 於固態 PDA 培養基培養四星期後，ganoderic acid Me 產量為 11.28 mg/100mg 菌絲。液態 PDB 靜置培養四星期後 ganoderic acid Me 產量 3.50 mg/100mg 菌絲。由研究成果可知，固態培養基進行靈 芝菌絲培養可提高抗癌成分ganoderic acid Me 產量。
二、固態及液態培養基對靈芝菌絲產量之影響
菌株 BCRC 36111 以固態培養基(PDA)培養一星期後，菌絲產量即可 達0.21 g/substrate。以 PDB 靜置培養及振盪培養生長較緩慢，培養四 星期後菌絲產量分別為0.09 及 0.10 g/substrate。菌株 BCRC 36674 於 固態PDA 培養到第四星期菌絲產量亦可達 0.19 g/substrate 最高產量，
以PDB 靜置培養及振盪培養生長較緩慢且菌絲產量較低。
三、不同培養配方對 ganoderic acid Me 及菌絲產量之影響
菌株BCRC 36111 以固態 PDA 或液態培養基 PDB 進行培養，以 PDA 固態培養四星期後其ganoderic acid Me 產量 1.55 mg/100mg 菌絲。以
菌株BCRC 36111 以固態 PDA 或液態培養基 PDB 進行培養，以 PDA 固態培養四星期後其ganoderic acid Me 產量 1.55 mg/100mg 菌絲。以