棲地零碎化對諸羅樹蛙族群遺傳結構影響之探討

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(1)前. 言. 現今保育生物學的重要議題，包括棲地零碎化（habitat fragmentation）與外來物種入侵（invasive or alien species）。兩者均對原生動、植物造成不小的衝擊，並可能導致特有物種（endemic species）的滅絕，而目前全球兩棲類大量減少的現象，也與棲地零碎化有關(Blaustein, 2002)。棲地零碎化的形成，一般包括長時間的天然地質事件與短時間的人為干擾破壞，天然的地形地貌受到自然作用力影響，在時間與空間涉及較大尺度規模，而人為干擾造成的破壞，相對而言是較小規模的（Haila, 2002）。棲地零碎化影響可分成三個層面（Lidicker, 2003），在族群動態方面，當族群或群集的完整性被破壞時，族群滅絕機會將提高。社會行為方面，影響動物播遷的時段、規模與能力，並降低生殖的成功機率等。演化方面，天擇會篩選對群集或社會關係依存性低、在邊緣地帶有高度容忍性、能利用生態廊道(corridor)與遷移擴散能力較佳的個體。零碎化所產生的干擾效應（Schmiegelon & Monkkonen, 2002），包括面積效應（area effect）、隔離效應（isolation effect）及邊際效應（edge effect）。邊際效應又包括物理邊際效應（physical edge effect）與生物邊際效應（biological edge effect），前者是微棲地（microhabitat）的變化，後者以人為干擾最嚴重。 . 現今各分類物種皆面臨棲地零碎的影響，其威脅包括兩個層面，一是生態層. 面，造成族群數量減少，隨著環境不可預測災難（stochastic catastrophe），提高區域性小族群滅絕風險，例如：植物（Lamont et al., 1993）、魚類（曾，2003）、昆蟲（Ehrlich, 1987；徐，2002）、兩棲爬蟲類（Vos, 1998；Laurie, 2001；Joanna, 2004）、鳥類（James, 1991）、哺乳類（Grativol, 2001），或是邊際效應改變物種之間的依存交互關係（Laurance, 1998；Jules, 1998；Hans, 1999；Tomas, 2002；沈，2002），進而牽動生態系統（ecosystem）改變（Santo & Telleria, 1997）。二是基因層面，受限於低程度的基因交流，產生近交衰退（inbreeding depression）、. 3.

(2) 基因侵蝕（genetic erosion）、遺傳負荷（genetic load）、基因歧異度降低、異型合子減少與降低物種的對環境的適應力等，例如：植物（Aizen, 1994；Young et al., 1999；Buza et al., 2000）、魚類（Vrijenhoek, 1994）、昆蟲（Clarke & O’Dwyer, 2000； Gross, 2001）、兩棲類（Reh & Seitz, 1990；Driscoll, 1998）、鳥類（Bouzat, 1998； Caizergues, 2003）、哺乳類（Srikwan, 1998；Land et al., 2000）。但是在某些棲地零碎情況下，如果每個分化族群都能保留下來，整體的有效族群（Ne）與基因多樣性會是較高的（Whitlock & Barton, 1997）。另外，過去物種面臨的地理環境歷史變遷、兩個零碎棲地間的地理環境（Hale et al., 2001；Thomas, 2002）、物種之間依存相關性（White, 2002）、族群年齡結構、生殖行為、生活史、對環境的容忍程度、傳播遷移能力（Mossman, 2001）與自然和人為對棲地干擾程度不同（Kaufmann, 1992），呈現棲地零碎化對物種的影響並非都是負面的個案研究差異。諸羅樹蛙（ Rhacophrus arvalis ）屬於無尾目（ Anura ）中的樹蛙科（Rhacophoridae），是台灣特有的兩棲類。在嘉義民雄首次被發現後，經 Lue et al. （1994）鑑定為新種樹蛙，目前棲地僅限於雲林、嘉義、台南等少部分地區（莊， 1999）。因為有研究指出地面積水為其聚集最重要的生態因子（謝，2004），所以現今調查的族群地點紀錄，範圍侷限於北港溪、朴子溪中上游兩側的溪流氾濫區與麻豆地區。諸羅樹蛙的生活史不能脫離有水環境、移動能力不強、雄蛙具有相當程度的棲地忠誠度（site fidelity）的行為（謝，2004），族群容易受河流間陸域切割隔離而影響其傳播。另外，諸羅樹蛙有雄蛙停留在展示場（lek）的現象，雌蛙則在不同展示場之間遊走的行為習性（謝，2004）。因為棲地附近道路的開發，導致發現多筆諸羅雌蛙被壓死的紀錄。近期的道路興建顯然是造成人為棲地零碎化的重要因素，使諸羅樹蛙族群間基因交流受到干擾。由野外分佈及習性觀察推測(圖一)，諸羅樹蛙的蝌蚪或是成體，應是藉由同一條溪流進行傳播的機會較高，造成地理距離較近且同一水系的族群親緣關係較 4.

(3) 近，而不同流域的諸羅樹蛙受到陸域的隔離，基因交流可能已經不順暢。外加近一百年來嘉南平原農業的開發與道路的興建，更加形成諸羅樹蛙傳播上障礙，諸羅樹蛙由於上述特色，為探討族群遺傳結構受棲地零碎化影響的適合物種。但是目前並沒有諸羅樹蛙族群遺傳結構研究，而在文獻中，對於兩棲類受棲地零碎影響的研究報告不多，因此有進一步做探討的必要。近期的生物分子技術可以提供大量族群遺傳資料，並應用於親緣演化研究，其中粒線體 DNA 為一雙股封閉環形構造，包含 2 個 rRNA、22 個 tRNA、 13 個蛋白質基因，和一變異度較高的控制區（D-loop）。其具母系遺傳特性，無基因重組問題，由於缺少修補系統（repair system），比細胞核高出 5~10 倍的突變率，可提供大量的種內多型性（polymorphism）進行分析，適合用來探討族群結構、基因交流、生物地理學與類緣關係。聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）藉由預先設計的保守區域基因序列當引子（primer），經由適當溫度調控流程，增幅粒線體 DNA 片段， PCR 產物進行定序後可檢測族群間與族群內的變異情形。近期研究也指出，在兩棲爬蟲類的粒線體 COX1、cyto b 與 D-loop 基因片段，是研究族群遺傳結構適當的分子遺傳標記（marker）（Barber, 1999；楊，1994；郭，2002；黃，2002；林，2003）。因此選用上述三段片段進行定序與分析。 . 本研究利用 PCR 技術，增幅諸羅樹蛙粒線體 COX1、cyto b 與 D-loop 部分. 序列，以地理親緣學方法，探討族群遺傳分化與親緣關係，以此結果推論諸羅樹蛙是否受棲地零碎影響，研究主題包括下列三點： 1.棲地零碎化是否造成不同水系諸羅樹蛙族群之間缺乏基因交流?使族群遺傳結構有所不同？ 2.各地諸羅樹蛙族群演化歷史為何？ 3.對於有諸羅樹蛙稀有基因型的地點，提供保育建議。. 5.

(4) 材料與方法一、物種介紹：諸羅樹蛙（Rhacophorus arvalis Lue, Lai, and Chen, 1995）為一中型樹蛙，與台灣其它四種綠色樹蛙（台北、翡翠、莫氏與橙腹）的差別，在於體側邊緣有白色的細長帶和特殊叫聲，生殖配對系統為群集展示(lek)。二、研究方法： 1.標本採集地：採集時間自 2004 年 3 月至 2005 年 4 月，將諸羅樹蛙群族採樣點分成四個樣區，分別是北港溪北岸支流（雲林溪、虎尾溪、大湖口溪）、北港溪南岸支流（葉子寮溪、中林溪、三疊溪）、朴子溪支流（牛稠溪）與曾文溪流域（麻豆），每個地點採集 5~10 隻個體（圖一）。個體以徒手捕捉法採集，標記方式為 Martof（1959）的去趾法（toe-clipping），給予個體特定編號，剪完腳趾頭後於傷口處塗抹金黴素（aureomycin），再釋放於原位置，並使用 GPS 記錄捕抓地點的經緯度數值。去除的腳趾頭存放在 70% 酒精浸泡保存，供後續 DNA 萃取，腳趾標本存放於國立台灣師範大學生物系內， 2.萃取 DNA（crude DNA）（附錄一），與 PCR 流程 (附錄二)： 3.序列分析：使用 MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis, ver.2.1）（Kumar et al., 2001）軟體計算鹼基組成百分比、鹼基對替換（transition,兩個嘌呤或嘧啶突變， Ts）、鹼基對顛換（transversion, 嘌呤與嘧啶之間發生的突變，Tv）的發生率。在 DnaSP3.14 套裝軟體（Rozas & Rozas, 1997），將所得 DNA 序列進行中性假說測試（Neutral mutation hypothesis）（Kimura, 1983），使用 Tajima D test （Tajima, 1989）。 4.遺傳變異：在 DnaSP3.14 中進行族群間單基因型歧異度（haplotype diversity, h 値）（Nei. 6.

(5) & Tajima, 1983）、核甘酸歧異度（nucleotide diversity, π 値）（Nei, 1987）的計算，以量化族群的遺傳歧異度。以上兩者皆是族群內部的遺傳變異，h 為族群內不同對偶基因的頻率與數量，不受序列變異影響，π 為族群中兩個對偶序列核苷酸差異平均數，不受單基因型影響，比較兩者的數值大小可以推測族群演化歷史（Page & Holmes, 1998；Avise 2000；Graur & Li, 2000）。 5.基因交流與分化計算族群間分化指數（FST , fixation index or genetic differentiation）（Slatkin, 1993）、基因交流指數（Nm , gene flow index）（Slatkin, 1985）、Dxy 值（average number of nucleotide substitutions per site between populations）（Nei, 1987）。FST 為用來決定族群間遺傳分化的情形，物種若為兩倍體則 FST = 1/（1+4Nm），N 為母系有效的族群量，m 為母系遷徙速度，當 FST > 0.25 時為族群有非常高度的遺傳分化，0.15 < FST < 0.25 時為高度分化，0.05 < FST < 0.15 時為中度分化，FST < 0.05 時為族群沒有遺傳分化現象（Wright, 1978）。族群基因交流值（Nm）可從 FST 值計算，Nm 為每個世代個體在族群間遷徙的數目，當 Nm 值 ≥ 1 時，表示每一世代的族群最少有一個體進行基因交流，使族群不因基因漂變而產生分化，當 Nm 值 < 1 時，表示族群之間基因交流不順暢，在基因漂變作用下易造成族群分化。Dxy 值為兩族群間單基因型核苷酸置換的平均數，代表族群間的 DNA 歧異度；π 値為同一地區任取兩個體序列比較差異，代表族群內 DNA 的歧異度，比較兩數值可得知 DNA 的遺傳變異是分佈在族群間或是族群內。 6.遺傳距離與族群結構在 MEGA 軟體中以 Kimura 雙參數的模式（Kimura-2-parameter model）（Kimura, 1980），進行族群間與族群內個體的遺傳距離計算。使用 Arlequin 2.001（Schneider et al., 2000）進行階層性分子變異分析（analysis of molecular variance, AMOVA）（Excoffier et al., 1992），檢測不同階層（hierarchical levels）的遺傳分化程度，階層可細分成組間（among group）、組內族群間（among population within groups）及族群內（within populations）三個不 7.

(6) 同階層的差異。在分組的方式上，將每一條流域內及河岸所有採樣點當成一組，共有北港溪北岸支流、北港溪南岸支流、朴子溪與曾文溪的麻豆四組，組內族群間為同一條流域內的採樣點，族群內則為所有採樣點比較。 7.網狀親緣關係圖的建構與 NCA 分析將單基因型序列變異資料，利用 MEGA 軟體轉換成遺傳距離矩陣，再使用 MINSPNET 軟體（Excoffier & Smouse, 1994）進行最小關聯網狀圖（minimum spanning network, Excoffier et al., 1992；Excoffier, 1993）分析，以探討 haplotype 之間過去族群歷史親緣關係。 Nested clade analysis（NCA）由 Templeton（Templeton et al., 1995）所提出，在統計的架構上，利用地理上分佈的單基因型與世系關係（ genealogical relationships），說明族群演化事件，但是必須在野外進行適當且充足的族群地點採樣，才能得到正確分析結果。將上述的 minimum spanning network 轉換成 nested clade，這些規則由 Templeton（1987, 1993）所描述，最後利用 GEODIS2.0 （Posada et al., 2000）軟體進行計算 clade distance（Dc，同一基因型個體與此基因型分佈地理中心的平均距離）、nested clade distance（Dn，同一基因型個體與上一層分支地理中心平均地理距離）、I-T Dc（內部 Dc 值減掉平均所有到頂端支序數值）與 I-T Dn（內部 Dn 值減掉平均所有到頂端支序的數值）。利用這些參數，進行分支群在地理上的分佈情形，與分支群間是否有地理關聯的顯著統計計算，族群過去所發生的歷史可使用檢索表（Templeton et al., 1998）進行推論。. 8.

(7) 結. 果. 一、標本採集野外共採集 120 隻諸羅樹蛙個體，包括 117 隻公蛙與 3 隻母蛙（表一、圖一）。二、序列分析 120 隻諸羅樹蛙經 PCR 成功增幅出來的片段，包括 COX1、cyto b 與 D-loop 部分序列，沒有發現缺失（deletion)與插入（insertion)的現象。序列經由 NCBI 的 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)功能比對後，COX1 部分與兩生類的黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus）、Buergeria buergeria 類似，而 cyto b 與 D-loop 部分則與 Buergeria buergeria、莫氏樹蛙（Rhacophorus moltrechti）、台北樹蛙（Rhacophorus taipeianus）序列相似。各段序列長度、鹼基頻率（base frequency)、變異點數量、鹼基對替換（transition）、鹼基對顛換（transversion)，變異點位置如表二。COX1 與 cyto b 兩段基因經過 Tajima’s D test，都是中性基因（P > 0.1, NS)，不受天擇影響。三、遺傳變異各段序列中，各地區所出現的單基因型（haplotype)數目、單基因型歧異度（haplotype diversity)、核苷酸歧異度（nucleotide diversity)如表三、四、五所示。由於三段序列是連結在粒線體內，將上述三條序列合併進行分析，在單基因型歧異度方面，北港溪北岸與南岸支流有最高的基因多樣性，值介於 0.00038 ~ 0.00039，而麻豆地區的基因多樣性最低，h 與 π 值都是 0，也就是麻豆地區的所有分析個體序列皆一樣（表六），從合併序列所定義出的七種單基因型，A、B、 C、D 四種單基因型在北港溪北岸與南岸支流皆有分佈，另外三種是侷限性的地理分佈，為當地族群獨特單基因型，分別為 F 型分佈於北港溪南岸支流、E 型於朴子溪，G 型在麻豆地區，族群間單基因型分佈地點與頻率如表七、圖五所示。四、族群基因交流與分化利用 Dnasp4.02 版 Hudson (1990)的公式，計算族群分化指數（FST）與基. 9.

(8) 因交流指數（Nm），在族群分化指數方面，各段序列結果於表八、九、十，將序列合併之後（表十一），北港溪南北岸支流族群族群分化值最低為 0.21，朴子溪和其它族群值介於 0.518 ~ 0.591，而麻豆地區與其它族群值皆超過 0.95，顯示四條流域族群之間有高度分化現象。在基因交流方面，各地區各段序列結果於表十二、十三、十四，將序列合併後（表十五），麻豆和其它地區族群基因交流指數最低，值不超過 0.03，基因交流指數最高為北港溪北岸與南岸支流族群的 1.86，表示四條流域族群之間基因交流不順暢。另外諸羅樹蛙族群各段序列族群間 Dxy 與族群內π值結果於表十六、十七、十八，序列合併之後（表十九）的各地族群 Dxy 值介於 0.00049 ~ 0.00399， π值介於 0.00023 ~ 0.00039，Dxy 皆遠大於π值，顯示四條流域族群間的差異遠大於四條流域族群內部差異，基因歧異度大多存在於四條流域族群間，與族群分化和基因交流指數推論的結果相似。五、族群間與族群內遺傳距離使用 Kimura 2 parameter model 計算群族間與族群內的遺傳距離，各段序列結果於表二十、二十一、二十二，將序列合併方面（表二十三)，族群間不同個體以麻豆族群相較於其它族群遺傳距離最遠，值介於 0.00395 ~ 0.00401，最小的遺傳距離是北港溪北岸支流與南岸支流的 0.00049，而族群內不同個體最大的遺傳距離是北港溪南岸支流的 0.0038，最小是麻豆的族群 0。表示在族群間麻豆族群相較其它地區族群遺傳距離最遠，而在族群內北港溪南岸支流族群遺傳差異最大而麻豆最小。六、族群結構從 AMOVA 的巢式變方分析（nested analysis）來看族群結構（表二十四)，組間為北港溪北岸支流、北港溪南岸支流、朴子溪與麻豆四條流域，結果為組間（among group）變異佔所有變異的 51.88%，組內族群間（among population within groups）的變異僅 5.50%，而族群內（within populations）的變異佔 42.61 %，顯 10.

(9) 示大部分的變異存在組間與族群內。另外表示各階層是否有變異的 Φ 值，組間 ΦCT = 0.51883 （P = 0），組內族群間 ΦSC = 0.11436（P < 0.025 )，族群內 ΦST = 0.574 （P = 0），結果得知諸羅樹蛙組間、組內族群間與族群內三個階層都有顯著差異。七、網狀親緣關係圖合併粒線體定序資料，利用單基因型核苷酸差異數目所建立的遺傳距離矩陣，以 minimum spanning network 方法，重建諸羅樹蛙親緣地理關聯網狀樹狀圖（圖六），依據 nested clade 中內部（interior)分支群較尖端（tip）分支群古老（Templeton 1995）原則，探討 nested clade 周遭新的單基因型是從何祖先型衍生而來，結果顯示 A 型單基因型為相對古老，連接在 A 型周遭的 C、D、E 為相對年輕的單基因型，而尖端的 B、F 為最年輕的單基因型。八、NCA 分析結果全部的 Nested clade 總共包含 4 個 one-step clade，2 個 two-step clade，和 1 個 three-step clade（圖七)，由 nested design 跟地理相關的統計測試，從兩方法來看，一是最簡單的 nested contingency analysis，此虛無假設為分支群和地理位置沒有相關，另一種是 nested geographical distance analysis，將分支群區分成和其它分支群有兩個以上連接處的 interior clade，和僅有一端連接支序圖的 Tip clade，此種測試比 nested contingency analysis 多包含地理距離與各採樣點之間的位置考量，因此具有較高的解析能力。 nested contingency analysis（表二十五)，顯示除了分支群 1-2 外，其它的分支群都不符合此虛無假說，也就是分支群 1-1、1-3、2-1 與 3-1 皆和地理位置有相關，另外的 nested geographical distance analysis（表二十六)，從 Dc 與 Dn 關聯性分析顯示，在最高階分支群 3-1 中，以 Templeton’s Key 檢索得到“過去零碎化”（past fragmentation），次一階分支群 2-1 為“過去零碎化”，最低階分支群 1-1 是“沒有充分基因上的結果來區別分佈區擴張與族群拓殖或是受限傳播與基因交流 ” （ Insufficient genetic resolution to discriminate between range expansion/colonization and restricted dispersal/gene flow），分支群 1-2 無法分析得到結果，而分支群 1-3 結果也是為“過去零碎化”（表二十七)。 11.

(10) 討. 論. 一、分子序列遺傳變異從諸羅樹蛙定序出來的基因片段中，變異程度大小為 COX1 > D-loop > cyto b，與一般脊椎動物基因片段 D-loop > cyto b > COX1 結果並不相符， D-loop 演化速度一般較快，適合用於分析種內族群問題（楊，1994；黃，2002）。COX1 序列因保守特性，特別適合科、屬之間親緣關係探討。諸羅樹蛙在 COX1 的變異度最高，原因可能在族群間的變異點數過少，COX1 序列僅有 5 個，D-loop 與 cyto b 序列各 4 個（表二）所導致的誤差。二、族群分化與基因交流在諸羅樹蛙族群分化指數上，麻豆地區族群所具有的單基因型是北港溪南北支流與朴子溪族群所沒有的，造成相對於北港溪南北支流與朴子溪，麻豆族群有很高的 FST 值 (0.971~0.951，表十一)，另外北港溪南北支流與朴子溪族群間的 FST 值偏高 (0.591~0.518，表十一)，是因為在北港溪南北支流與曾文溪出現頻率最高的單基因型並不相同(圖五)，顯示兩流域族群有明顯的高度分化。除了北港溪南、北支流的族群因為地理距離最近，基因交流值 1.86 最大外，其它地區的族群交流指數都小於 1（0.46~0.02，表十五），表示其它地區族群幾乎不發生基因交流，低程度的基因交流將導致族群的分化與近交衰退的情形發生（Lynch & Walsh, 1998）。三、族群遺傳距離諸羅樹蛙族群間遺傳距離為 0.00038 ~ 0.004，平均為 0.0023，和國內已經發表的兩棲爬蟲進行比較（表二十七），為遺傳距離最低的物種，造成此結果可能與過去的歷史事件與現今的環境干擾有關，將在後續段落討論。另外，劉（2000）曾利用 RAPD（random amplified polymorphic DNA）技術來探討諸羅樹蛙族群結構，所得結果為族群內平均遺傳距離大於族群間，族群內與族群間基因交流頻繁，但是這兩項與本實驗結果都不相符，可能原因有以下兩點：1、取樣（sampling）. 12.

(11) 問題，劉僅採集 5 個地點，可能不足以採到諸羅樹蛙所有代表基因型。2、分子技術不同，RAPD 為利用隨機的引子（random primer），以基因組核酸（genomic DNA）為模版，進行 PCR 反應，但是分子遺傳標記最好從突變發生程度、基因座之間一致性與解析力來探討族群遺傳結構（ Bossart & Prowell, 1998 ； Desplanque et al., 2000），由於 RAPD 技術與本實驗定序的方法不同，而造成結果不同。四、族群結構四條流域族群，經 AMOVA 的運算結果 ΦCT = 0.576（P < 0.02），得知四個族群結構有顯著的不同，從現有的諸羅樹蛙分子資料與族群現況來看，雖然目前北港溪流域周遭基因多樣性最高，野外調查數量也最多，在關聯族群（metapopulation）的定義中可以當來源族群（source population），但是與其它地區諸羅樹蛙基因交流指數皆低於 1，推測因為河流間陸域產生的地理隔離，加上人為的開發干擾破壞，使個體擴散傳播與基因交流的現象不頻繁，因此較無來源族群到衰微族群（sink population）或是拓殖滅絕的動態過程，再加上嘉義朴子溪與麻豆地區諸羅樹蛙獨有的單基因型也無法從北港溪流域周遭補充獲得，雖然過往兩棲類的族群，常被認為是符合 metapopulation 的族群結構（Alford & Richards, 1999；Dodd, 1994），但是何種族群分子結構符合 metapopulation 是爭論的議題，而且也非受棲地零碎的族群就可定義為 metapopulation（Harrison & Hasting, 1996），從 FST 與 Nm 值得知諸羅樹蛙基因交流已經相當不順暢，因此將現今四條流域定義成不同的族群，而不當 metapopulation 較恰當。五、諸羅樹蛙親緣地理關係探討親緣地理學（phylogeography）是生物地理學新觀念（Avise et al., 1986），探討歷史地質事件對物種演化與親緣的相關性，研究對象以近緣種或是種內族群為主，但是當分類群呈現分離或是不連續分佈時，親緣地理學者提出兩種假說，來說明現今地理分佈與世系（genealogical lineages）的關連，一是傳播假說（dispersal hypothesis），由種源中心藉由分佈區擴張（range expansion）與跳躍傳 13.

(12) 播（jump dispersal）拓殖到其它地區，一是地理隔離假說(vicariance hypothesis)，從連續性的分佈區，因地理障礙被切割成零星獨立單位（Futuyma, 1998），因此若是族群受到棲地零碎化衝擊，將會符合親緣地理學地理隔離的說法。過往支序學派（Cladistics）可利用雙分叉樹狀圖來表示 operational taxonomic units（OTUs）關聯，進行種間親緣關係分析，但是對於種內基因演化與族群譜系中，共同祖先所形成的網狀結構則缺乏解析力。近年來族群遺傳學的溯祖理論（coalescent theory）與網狀親緣觀念（networking approach），則提供新的詮釋方法。溯祖理論為基因漂變的反向理論，探討近緣種或是種內基因譜系的統計學理論（Felsentein, 1981；Hudson, 1990），從現今族群遺傳變異中，推論過去族群基因交流、遷移、雜交、生殖隔離與譜系排序（lineage sorting）的理論應用。網狀親緣觀念可對古典族群遺傳所欠缺的目前基因交流模式，提供良好的統計基礎與解說。minimum spanning network 與 Nested clade analysis 為其中的一種工具。在 minimum spanning network 的分析方法中認為，祖先族群中的古老單基因型可經突變或重組衍生出新的單基因型，使古老單基因型有較大機會位於網狀樹狀圖內部，而新衍生的單基因型則位於網狀樹狀圖的邊緣（Golding, 1987； Crandall & Templeton, 1993），圖六為此項分析的結果，其中北港溪南北岸支流皆出現的 A 單基因型位於內部節點位置，是屬於相對古老基因型，而連接 A 型邊緣的單基因型，為離開祖先族群後所衍生的新單基因型分支，因此僅出現在嘉義的 E 單基因型，和北港溪南岸支流的 F 單基因型，推論皆由北港溪北岸流域的 A 單基因型演變而來，因此現今位於朴子溪棲地的群族，過去可能從北港溪周遭遷移而來。 NCA 方法為先將近緣的單基因型彼此連接，再進一步形成高階分支群，接著進行 clade distance （Dc）與 nested clade distance（Dn）的統計關聯性分析， Dc 為同一基因型（分支）個體與此基因型分佈地理中心的平均地理距離，Dn 為同一基因型（分支）與上一層分支地理中心的平均地理距離，利用這兩數值進行有無地理關聯的顯著性統計，最後對地理上非隨機的族群變異分佈，進行族群基 14.

(13) 因型分佈與地理親緣的探討，例如當族群是受限基因交流狀況時，計算出頂端的分支群(tip clade)，Dc 值會顯著性小。當族群是長距離的擴張時，頂端的分支群 Dc 值會顯著性大。當族群為由少數個體進行長距離拓殖時，少數頂端分支群 Dc 值是顯著性的大，剩下的 Dc 值為顯著性的小。當族群是異域零碎化時，Dc 值在低階的支序圖為顯著性的大，在高階支序圖為顯著性的小，而 Dn 隨階層增高而迅速增大（Templeton et al., 1995）。依據 Templeton 的檢索表，諸羅樹蛙族群演化歷史事件在高階（clade3-1）、次階（clade2-1）與最低階（clade 1-3）的三個層次，都是“過去零碎化”的結果，這種情形通常發生在地理邊緣或是島嶼上，有高比例的獨特基因型，而諸羅樹蛙族群在朴子溪與麻豆地區，都有高比例獨特基因型的分佈所造成，在高階與低階的分支群，可以代表族群演變時間上的先後順序，因此在 NCA 時間尺度上是一致支持過去零碎化結果，再對照野外捕抓地理位置，在空間尺度為流域間陸域的分割造成棲地零碎，顯示以往自然的地貌變動歷史，可能在諸羅樹蛙族群遺傳結構中扮演重要角色。從親緣地理探討結果，加上目前野外觀察，竹林的耕種方式為焚燒後再重新插枝，加上道路上被壓死的諸羅雌蛙多筆記錄，推測諸羅樹蛙可能受到早期自然地景與近期人為干擾的雙重影響，使得族群間基因交流減少，近年有文獻探討自然與人為干擾，造成棲地零碎將兩棲類族群隔離的現象，例如：河系所造成的地景隔離，使得兩生類 Gencronia lutea 與 Gencronia rosea 產生基因歧異度降低的情形（Driscoll, 1988）；穿越道路的兩棲類，受到交通流量的影響，道路面積密度越高，存活率會大幅下降（Fahrig et al., 1995）。六、AMOVA 與 NCA 結果討論藉由 AMOVA 與 NCA 兩種不同資訊進行的分析方法，顯示諸羅樹蛙受到過去棲地零碎造成基因交流中斷，進而使地理上四條流域族群有顯著的遺傳分化，兩者在本研究中提供相當一致的結果。 AMOVA 是目前廣泛使用分析族群結構的簡單技術，根據 Wright’的島嶼理論，來解釋目前族群結構與基因交流，但是 AMOVA 不能對過去所發生的歷史 15.

(14) 事件進行分析，例如當知道族群有遺傳分化的現象，無法得知此現象的原因是距離隔離效應（isolation by distance）、過去棲地零碎化（past fragmentation）或是分佈區擴張所造成（Paulo, 2002）。NCA 在這方面提供適時的彌補，其原本的假設是祖先基因型會比後代基因型分佈較廣，但是族群擴張的現實狀況可能會和假設相反，例如分佈較廣的後代基因型分佈較廣，而祖先基因型被侷限於過往棲地（Templeton, 1998），此時 NCA 的解析能力會變差。七、諸羅樹蛙各地族群歷史探討 Avise（2000）利用單基因型歧異度（h , haplotype diversity）與核苷酸歧異度（π, nucleotide diversity）的大小不同共分成四種組合，據此來說明諸羅樹蛙各地族群的歷史。北港溪南、北支流的族群 h 值高（0.54 ~ 0.51）而 π 值低（0.00038 ~ 0.00039，表六），為長時間維持低有效族群，且歷經瓶頸效應後，從少數創始者快速成長而來，雖然經歷的時間不足以累積大量序列變異，但是經由突變已經恢復單基因型變異。相似的探討也發生在北大西洋與北太平洋的鯡魚、西班牙的沙丁魚與八丈芒上（Grant & Bowen, 1998；江，2002）。另外，朴子溪與麻豆族群 h 與 π 值都偏低，加上實驗所選的基因片段為中性不受選汰壓力，所以為長期且明顯受瓶頸效應的小族群。在北大西洋的大西洋鱈魚（Mork et al., 1985）與最近由歐洲再傳入的南非鯷魚（Grant & Bowen, 1998）也有類似的族群變遷歷史。但是上述的結果可能還需要更多種方法來驗證，可是此結果與現今野外觀察的現況吻合，包括在北港溪南、北支流上游地區，由於農民在溪流兩側種植竹林形成連續性棲地，竹林底層的積水可吸引雄蛙聚集（謝，2004），因此在七、八月生殖季可以發現數量較多的諸羅樹蛙，在朴子溪與麻豆地區則無類似棲地，野外較不容易發現諸羅樹蛙蹤跡。綜合上述分子資料，諸羅樹蛙目前各地族群皆是從很小有效繁殖族群而來，且都經歷瓶頸效應，這個結果可能和本身播遷能力、流域間陸域隔離加上近期棲地破壞有關。目前族群分佈集中於雲嘉南溪流兩側農墾地，雲嘉南地區過去是漢人獵捕台灣梅花鹿的場所，其範圍北從虎尾，南至佳里麻豆（江,1985），而台灣 16.

(15) 梅花鹿是一種偏好淺水沼澤林地的物種，因此過往雲嘉南地區在雨季或是颱風過後，溪水暴漲淹沒兩側窪地，創造出許多暫時性的沼澤地，推測諸羅樹蛙早期族群就棲息於此類環境中（呂，2003）。但是此暫時性水域環境具不穩定性，諸羅樹蛙遭遇環境不可測的（stochastic）壓力影響可能很大，Robert（2001）曾利用 wood frog（Rana sylvatica）的進行短距離（1 ~ 5km）族群結構研究，發現池塘短暫積水與乾枯的動態過程，就足以產生創始者效應（founder effect），因此雲嘉南地區的沼澤窪地，就氣候型態與降雨情形，推測該地區過往應遭遇多次的長期乾枯，或是河道流域改變，加上近期人為的開墾與破壞，使適合諸羅樹蛙的原始棲地改變、喪失或是新形成，進而造成族群歷經多次瓶頸效應，使族群有效數量減少，產生創始者效應。族群面臨內外兩個限制：動物行為方面—本身移動能力不佳，平均活動面積僅 140m2，與雄蛙對於展示場鳴叫位置有忠誠度（謝， 2004），限制族群間的傳播；環境方面—溪流間的切割與人類近期的干擾破壞，使諸羅樹蛙不易進行不同流域間族群基因交流，這些殘存小族群伴隨著基因漂變，喪失大部分基因多樣性，形成目前族群現況。在棲地零碎化後，因為族群量減少與擴散上的隔離，將對族群長遠的族群遺傳和年齡結構產生影響（Young & Clarke, 2000），使地區有效繁殖族群量（Ne）、遷移速率（m）減少。在基因漂變的作用下，預期族群內的遺傳變異減少而族群間的遺傳變異增加，在諸羅樹蛙的族群遺傳結構上也獲得證實。八、未來研究展望本研究方法是採用特定時間的族群，由空間尺度探討棲地零碎，可惜的是目前諸羅樹蛙並無連續完整的棲地，無法比較完整和零碎棲地間的族群遺傳結構（Stow et al., 2001；Joanna et al., 2004）。另外，人為干擾對諸羅樹蛙棲地的破壞，在野外觀察是顯而易見。但是粒線體基因片段的演化速率是以每百萬年為單位，所以僅能“推估”過去族群變遷的歷史事件，無法對近期道路與農墾地開發所造成的隔離衝擊進行評估。由於微衛星體（microsatellite）DNA 能在短時間累積大量突變率，並追蹤每一個體來源，未來可利用微衛星體當分子遺傳標記，進行諸羅 17.

(16) 樹蛙族群遺傳結構的研究，探討近百年來受人為干擾所造成的改變。另外小族群伴隨基因漂變與近交衰退，產生對環境適應力下降的問題，也可深入探討。九、保育策略建議諸羅樹蛙學名為 Rhacophorus arvalis，“arvalis”的拉丁原意是農墾地，是當初最早發現諸羅樹蛙的棲地類型，但是能在人為干擾環境中，發現新種兩棲類的機會並不高，加上近年來國外兩棲爬蟲寵物的引進，產生諸羅樹蛙是否為外來種的疑惑？本研究的分子資料顯示四條流域的族群結構有顯著不同，加上具有地區性獨特單基因型，非外來種少數引入創始個體能在短短數年內演化而成，因此諸羅樹蛙為台灣本土特有兩棲類是無疑問的。保育遺傳學的目的有二個，一是能辨識作為保育目標的演化單位（ESUs, evolutionarily significant units）或是管理單元（MUs, management units），二是保持此種單元內的遺傳變異（Moritz, 1999），根據諸羅樹蛙部份粒線體序列的資料，由於地景切割造成的過往棲地零碎，使族群基因交流不順暢成為四個不同族群，另外三條流域皆有獨特的基因型，因此我們建議將北港溪北部支流、北港溪南部支流、朴子溪、與麻豆族群分成四個不同保育演化單元，以短期優先順序而言，麻豆地區族群受到瓶頸效應最明顯，遺傳多樣性最低，和其它族群基因交流指數最低、遺傳距離最遠，加上野外族群數量有隔年遞減的趨勢（莊，2005），成為目前最迫切需要保育的族群，以長期觀點來看，北港溪北、南部兩岸支流族群有較高的基因多樣性與單基因型數，為保育的熱點中心（hotspot）。本研究雖然使用分子工具，探討棲地零碎化對於諸羅樹蛙族群結構的影響，但是對於瀕臨滅絕的小族群長期經營管理而言，除了基因方面的考量外，需再加入多方面的思考，包括生態、經濟、社會、政治與資源經營考量，以期能得到多面象總體的整合（Clarke, 1999），以永續諸羅樹蛙的生存。. 18.

(17) 結. 論. 1. 諸羅樹蛙種內變異程度不高，為國內目前已發表兩棲類中最低者。 2. 北港溪北岸支流、北港溪南岸支流、朴子溪、曾文溪(麻豆) 諸羅樹蛙族群因為流域間陸域的隔離零碎化，使基因交流不順暢造成族群分化現象，存在顯著獨特的不同族群結構。 3. 現今位於朴子溪的群族，過去可能從北港溪流域周遭遷移而來，但伴隨著瓶頸效應與基因漂變影響，造成基因多樣性的流失，形成目前族群遺傳現況。 4. 北港溪北岸與南岸支流的諸羅樹蛙族群演化歷史，為歷經瓶頸效應後的小族群快速成長，而曾文溪與麻豆族群為長期且明顯受瓶頸效應的小族群。 5. 各地諸羅樹蛙族群從很小的有效繁殖族群而來，推測與過往溪流地貌不可測環境壓力和人為干擾有關。 6. 現今野外麻豆地區族群量最少，但具有其獨特單基因型，為短時間最需保育的優先對象，北港溪南、北流域周遭基因多樣性較高，為保育諸羅樹蛙的熱點。. 19.

(18)