探討剔除白色念珠菌ENG1之影響

國

立

交

通

大

學

生化工程研究所

碩

士

論

文

探討剔除白色念珠菌 ENG1 之影響

Effect of ENG1 null mutations in Candida albicans

研 究 生：蔡馨儀

指導教授：楊昀良 博士

探討剔除白色念珠菌 ENG1 之影響

Effect of ENG1 null mutations in Candida albicans

研 究 生：蔡馨儀 Student：Hsin-Yi Tsai

指導教授：楊昀良 Advisor：Dr. Yun-Liang Yang

國 立 交 通 大 學 生化工程研究所

碩 士 論 文

A Thesis

Submitted to Institute of Biological Engineering National Chiao Tung University

in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of

Master in

Biological Engineering July 2009

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

摘要

白色念珠菌為人類常見之共生菌，也是一種伺機性病原菌。白色念珠 菌之致病機轉與其型態變化的能力是相關的；當失去菌絲型和酵母菌型 之型態互換的能力時，此白色念珠菌也失去造成毒性的能力。β-glucan 是真菌細胞壁中最主要的成分，研究指出白色念珠菌細胞壁的β-glucan 與調節宿主免疫機轉相關。白色念珠菌之 CaENG1 可轉譯出 β-1,3-glucan 內切酶，此基因與啤酒酵母菌之 ENG1 有很高的同源性。因此本文為探 討 CaENG1 對於白色念珠菌型態轉變扮演之角色。實驗策略以抗藥性篩 選標記 SAT1 flipper 剔除白色念珠菌雙套 CaENG1，再以南方點墨法和 RNA 表現量確認建構之單套 CaENG1 突變株、雙套 Caeng1 突變株以及 補償單套 CaENG1 之補償株；檢驗符合預期之突變株進行下一步性狀分 析。然而至目前所進行的實驗，在生長曲線測定、芽管試驗、誘發菌絲 生長觀察型態變化和侵犯力試驗中，Caeng1 雙套突變株與野生株相比， 性狀上沒有明顯的差異，指出以目前的結果分析，CaENG1 並不會影響 白色念珠菌型態轉變之過程；在化學藥品感受性實驗中也發現 Caeng1 雙 套突變株生長表現也與野生株無明顯差異；在細胞分裂時，觀察到 Caeng1 雙套突變株有少數細胞分裂不完全，形成四、五顆細胞聚集的現象。然 而，將 Caeng1 雙套突變株從 a/α 基因型誘發為 a/a 之 a-type 型態之菌株， 可發現在添加血清誘發菌絲生長時，a-type 型態的 Caeng1 雙套突變株有 3/5 機率，其菌絲生長能力下降。而當中一 a-type 型態的 Caeng1 雙套突 變株對於0.1％ SDS 有高度敏感性，推測此突變株之細胞壁組成有缺 陷，進而提高對SDS 的感受性。

Abstract

Candida albicans is a commensal fungus and a major opportunistic pathogen. The pathogenicity of C. albicans is related to its ability to switch between yeast and filamentous forms and cells defective in the switching is avirulent. β-glucan is a major structural component of fungal cell wall and several studies have suggested that the β-glucan of C. albicans has

immunomodulatory effects on the host defense system. CaENG1 shares homology with Saccharomyces cerevisiae ENG1, which encodes an

endo-1,3-β-glucanase. Hence, it is interested to know the role of CaENG1 in the morphogenesis and virulence. I used the SAT1 flipper, a drug resistance marker to disrupt CaENG1 in C. albicans. The genomic constructions of the heterozygous, homozygous knock-out mutants and a rescued strain have been confirmed by Southern blot and RNA expression analysis. However, there is no significant difference between the wild-type strain and the Caeng1 null mutant strains in all the morphology analyses conducted, including growth rate, germ tube assay, colony morphology observation and invasion assay. These results indicate that CaENG1 is not involved directly in hyphal morphogenesis in C. albicans under experimental conditions. In various chemical susceptibility tests, the null mutants displayed the same phenotypes as the wild type. I also analyzed the cell morphology of the null mutant cells, and few could form small clusters of cells that were defective in completing cellular separation. However, after the Caeng1 null mutants were induced to form a-type cells from initial heterozygous a/α type, in 3/5 chance the a-type Caeng1 null mutants have reduced hyphal formation in the presence of serum. An a-type Caeng1 null mutant, EKP2-3a, defective in hyphal growth was also

hypersensitive to 0.1％ SDS. It is suggested that this mutant strain was defective in cell wall composition or organization to become more sensitive to SDS.

誌謝

碩士班這兩年中，做實驗的日子雖然感覺很漫長，不過還是很快就到 了可以寫這篇文章的時候，既開心又不捨。能夠順利的度過碩班生涯， 最主要感謝指導教授楊昀良老師，謝謝老師的收留與指導，對於分生技 術完全一竅不通的我給予耐心的教導。也非常感謝國衛院羅秀容老師和 本校彭慧玲老師，在口試時給予present和論文上很多指導。 而實驗室同玩樂、共患難的夥伴們也謝謝你們這一兩年來的陪伴！外 表溫柔、講話犀利的惠菁學姊，感謝妳讓我的實驗柳暗花明又一村；而 又白又漂亮的師傅淑貞，謝謝妳教我分生入門的所有技術；做自己的實 驗室燈塔淑萍，有你在的地方氣氛就很high；講話很多笑點的旻秀以及熱 心助人但不能被嗆太久的敏書，謝謝你們完全沒有學長的架子，和你們 這屆相處很開心。再來是我親愛的同學們：外表不笑很冷豔但內心孩子 氣到極點的小倩，跟妳同一組真好；號稱lucky queen以及我心目中一姐 的阿毛，妳是我見過最開心的人，可愛這形容就讓給你唄；氣勢女王兼 美食老饕佳真，跟妳一起奮鬥口試的日子真難忘；活潑又愛笑的妍寧是 兩年來實驗室座位難分難捨的鄰居；傑尼斯外型、公主脾氣的阿澎有時 也是滿溫馨的。以及可愛的學弟妹：Sunny mama的貼心乖女兒阿大，人 超好但氣勢也要大喔；疼妹妹的好老爸兼ppt天才重延、愛籃球的小 隻Ubi、其實很豪邁的幸璇、專題生祖元和俊嵐、新加入成員阿賢和慧婷。 還有小楊家榮譽成員咏馨、很懂facebook的助理阿金吳、常幫我們換燈管 辛苦的葉大哥、管理confocal的佳穎學姊。在此感謝大家的溫馨相伴！ 還要謝謝朋友們的噓寒問暖，讓我初到新竹不孤單。最後，尤其要感 謝家人的支持和鼓勵，這是我們一起完成的學業！

目錄

中文摘要 ... i 英文摘要 ...ii 誌謝 ... iv 目錄 ... v 表目錄 ... x 圖目錄 ... xi 附錄目錄 ... xiii 一、緒論 ... 1 1.1 前言 ... 1 1.2 白色念珠菌型態變化與致病機轉之關聯 ... 1 1.3 白色念珠菌之細胞壁相關研究 ... 4 1.3.1 細胞壁之組成 ... 4 1.3.2 β-glucan 與型態變化及引發宿主免疫機轉之研究 ... 5 1.3.3 1,3-β-glucan 為生物膜之細胞壁主要成分 ... 6 1.3.4 白色念珠菌中與 1,3-β-glucanase 相關之基因 ... 6 1.4 ENG1 之相關研究 ... 7 1.4.1 CaENG1 之相關研究 ... 7 1.4.2 高同源性物種之 ENG1 相關研究 ... 8 1.5 CaENG1 與 MTL 基因之研究 ... 9 1.6 篩選標記之介紹 ... 10 1.7 本文之研究起源及目的 ... 12 二、材料與儀器 ... 14 2.1 菌株 ... 14

2.2 質體 ... 15 2.3 引子 ... 16 2.4 化學藥品 ... 18 2.5 酵素 ... 20 2.6 藥品配製 ... 20 2.6.1 培養基及培養液配製 ... 20 2.6.2 緩衝溶液及試劑 ... 21 2.7 儀器設備 ... 23 三、方法與步驟 ... 25 3.1 質體 DNA 的萃取 ... 25 3.2 聚合酶連鎖反應) ... 25 3.2.1 一般 PCR 反應 ... 25 3.2.2 Rescued ENG1 PCR 反應... 25 3.3 大腸桿菌勝任細胞的製備 ... 26 3.4 限制酶反應 ... 27 3.4.1 確定質體 DNA 片段大小之限制酶反應 ... 27 3.4.2 為 clone 所需之限制酶反應 ... 27 3.5 接合反應 ... 27 3.6 轉形反應 ... 27 3.7 洋菜膠內之 DNA 萃取 ... 28 3.7.1 結晶紫洋菜膠之製備 ... 28 3.7.2 洋菜膠內之 DNA 片段萃取 ... 28 3.8 白色念珠菌轉形反應 ... 28 3.8.1 白色念珠菌勝任細胞之製備 ... 28 3.8.2 電穿孔 ... 29

3.9 SAT1 flipper 之剔除 ... 29 3.10 複製平皿培養法 ... 30 3.11 白色念珠菌染色體 DNA 之萃取 ... 30 3.11.1 方法一 ... 30 3.11.2 方法二 ... 31 3.12 南方點墨法 ... 31 3.12.1 製備 DNA 探針 ... 31 3.12.2 轉漬 DNA ... 32 3.12.3 雜交反應 ... 32 3.12.4 免疫偵測 ... 33 3.13 RNA 萃取 ... 33 3.14 RNA 電泳 ... 34 3.14.1 RNA 電泳前處理 ... 34 3.14.2 RNA 電泳 ... 34 3.15 反轉錄聚合酶連鎖反應 ... 35 3.16 突變株之性狀分析 ... 35 3.16.1 生長曲線之測定 ... 35 3.16.2 芽管試驗 ... 36 3.16.3 誘發菌絲生長觀察型態變化 ... 36 3.16.4 侵犯力試驗 ... 36 3.17 細胞分裂之觀察 ... 36 3.18 化學藥品感受性測試 ... 37 3.19 類接合型之基因型分析 ... 38 四、結果 ... 39 4.1 建構 CaENG1 突變株之流程 ... 39

4.2 建構 CaENG1 單套、雙套基因剔除之突變株 ... 40

4.2.1 建構含篩選標記及 CaENG1 上下游同源區域之質體 ... 40

4.2.2 確認 CaENG1 單套基因之剔除 ... 40

4.2.3 確認 Caeng1 雙套基因之剔除 ... 41

4.3 建構 CaENG1 補償之突變株 ... 42

4.3.1 建構含 CaENG1 open reading frame 之質體 ... 42

4.3.2 CaENG1 open reading frame 序列分析 ... 42

4.3.3 確認 CaENG1 補償之突變株 ... 43 4.4 南方點墨法檢驗 CaENG1 各突變株 ... 43 4.5 反轉錄聚合酶連鎖反應檢驗 CaENG1 各突變株 ... 44 4.6 CaENG1 各突變株之性狀分析 ... 44 4.6.1 CaENG1 各突變株之生長曲線 ... 44 4.6.2 芽管試驗之結果 ... 45 4.6.3 菌落型態變化之結果 ... 46 4.6.3.1 含 4％山羊血清之 Bacto agar 培養基上之生長 ... 46 4.6.3.2 含 4％山羊血清之 YPD 培養基上之生長 ... 46 4.6.4 侵犯力試驗之結果 ... 47 4.7 營養素 uridine 影響營養基因缺陷野生株 BWP17 之結果 ... 47 4.8 細胞分裂觀察之結果 ... 48 4.9 CaENG1 各突變株於化學藥品感受性試驗之結果 ... 49 4.10 確認 Caeng1 類接合型突變株 ... 50 4.11 Caeng1 類接合型突變株菌落型態之變化 ... 51 4.11.1 於含有 4％ 山羊血清之 YPD 培養基 ... 51

4.11.2 於 YPD、solid Spider 及含 10％山羊血清之 YPD 培養基 ... 52

五、討論 ... 54

5.1 以抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 剔除 CaENG1 結果之探討 ... 54

5.2 以南方點墨法及分析 RNA 表現量檢驗 Caeng1 突變株 ... 55 5.3 CaENG1 各突變株性狀分析之探討 ... 55 5.3.1 生長曲線之探討 ... 56 5.3.2 芽管試驗之探討 ... 56 5.3.3 以血清誘發菌絲生長之型態探討 ... 56 5.3.3.1 含 4％山羊血清之 Bacto agar 培養基 ... 56 5.3.3.2 含 4％山羊血清之 YPD 培養基 ... 57 5.3.4 侵犯力試驗之探討 ... 58 5.4 營養素 uridine 影響營養基因缺陷野生株 BWP17 之結果探討 ... 58 5.5 細胞分裂之結果探討 ... 59 5.6 化學藥品感受性試驗之結果探討 ... 60 5.7 以南方點墨法檢驗 Caeng1 接合型突變株 (a/a or α/α) 之探討 ... 60 5.8 以血清誘發 Caeng1 接合型突變株菌絲生長之型態探討 ... 60 5.8.1 於含 4％山羊血清之 YPD 培養基上的菌落型態 ... 60 5.8.2 於三種不同之培養基上菌落型態變化之探討 ... 61 5.9 Caeng1 接合型突變株於化學藥品感受性試驗之結果探討 ... 62 5.10 結語 ... 63 5.11 未來展望 ... 64 六、參考文獻 ... 65 簡歷 ... 112

表目錄

圖目錄

圖一、建構 Caeng1 突變株之示意圖 ... 82

圖二、以限制酶確認plasmid SAT1-BA ... 83

圖三、PCR確認CaENG1 heterozygous knock-out突變株 ... 84

圖四、Replica plating及PCR 檢驗CaENG1 heterozygous knock-out突變株 ... 85

圖五、PCR確認Caeng1 homozygous knock-out突變株 ... 86

圖六、Replica plating及PCR檢驗Caeng1 homozygous knock-out突變株 . 87 圖七、建構帶有CaENG1 ORF之質體 ... 89

圖八、質體Res 20 中CaENG1

之

定序結果 ... 93

圖九、PCR及Replica plating確認CaENG1 rescued突變株 ... 94

圖十、南方點墨法分析Caeng1 之突變株 ... 95 圖十一、利用反轉錄聚合酶連鎖反應檢驗Caeng1 之突變株 ... 96 圖十二、CaENG1 各突變株在YPD培養液之生長曲線 ... 97 圖十三、芽管試驗 ... 98 圖十四、CaENG1 各突變株於含 4％山羊血清的Bacto-agar培養基之菌落 型態 ... 99 圖十五、CaENG1 各突變株於含 4％山羊血清的YPD培養基之菌落型態 ... 100 圖十六、CaENG1 各突變株之侵犯力試驗 ... 101 圖十七、比較uridine對各突變株在含 4％山羊血清之YPD培養基上的影響 ... 102 圖十八、細胞分裂型態之觀察 ... 104 圖十九、化學藥品感受性試驗 ... 105

圖二十、南方點墨法分析a-type及α-type mating strain ... 106

圖二十一、Caeng1 類接合型突變株於 4％山羊血清的YPD培養基 ... 108

圖二十二、Caeng1 類接合型突變株於三種不同培養基之菌落型態 ... 109

附錄目錄

一、緒論

1.1 前言

白色念珠菌 (Candida albicans) 是雙倍體的真菌 (diploid fungus)，屬於 酵母菌 (yeast)，為人體中常見之共生菌，同時也是一種盛行率高的伺機 性病原菌 (opportunistic pathogen) (Odds, 1988; Edmond et al., 1999;

Edwards, 2000)。在健康的人體中，白色念珠菌會伺機造成表面黏膜的感 染，但在免疫功能不全之患者 (如化療患者、器官移植患者及愛滋病患 者) 或接受侵入性治療之患者，白色念珠菌可造成嚴重的感染，如全身 性念珠菌血症，致死率約高達三至五成 (Odds, 1988; Fisher-Hoch and Hutwagner, 1995; Vincent et al., 1998; Edmond et al., 1999; Kullberg and Filler, 2002)。

目前普遍使用之抗真菌藥物 (polyenes，如 amphotericin B; triazoles，如 itraconazole、fluconazole; imidazoles，如 miconazole) 因受限於其活性範 圍、毒性或副作用等而效用下降 (Groll et al., 1998b; Jack, 1998)。而隨著 目前增加抗真菌藥物之使用，抗藥性菌株的發生率也隨之增加 (Pfaller et al., 2000; Vanden Bossche et al., 1994)。近年來由於抗藥性菌株產生，azoles 類等抗真菌藥物的治療效果已大幅下降 (De Backer et al., 2001)。感染白 色念珠菌盛行率增加，但目前現有藥物的效用卻下降，如何克服白色念 珠菌抗藥性及找到適合藥物標的以開發新穎抗真菌藥物，是目前重要的 課題。 1.2 白色念珠菌型態變化 (morphogenesis) 與致病機轉 (pathogenesis) 之關聯 白色念珠菌是一種多形態的真菌 (polymorphic fungus)，可生成酵母菌

型 (yeast form)、假菌絲型 (pseudohyphae form) 和菌絲型 (hypae form)。 酵母菌型和菌絲型皆有在感染的組織中發現，因此推測這兩種型態可能 在致病機轉 (pathogenesis) 中扮演重要的角色：型態上菌絲型跟假菌絲 型具侵入性，在實驗環境培養下皆可侵入洋菜膠中，此特性則是促進白 色念珠菌在感染宿主初期可以滲透組織；而酵母菌型則適合散播在血液 中 (Sudbery et al., 2004)。白色念珠菌由單一酵母菌細胞形成假菌絲狀或 菌絲狀，其病原性 (pathogenicity) 可被血清或巨噬細胞 (macrophage) 誘 發 (Shepherd et al., 1980; Dabrowa and Howard, 1981)。而在實驗環境培養 下，例如額外添加血清以及培養在37℃，也可誘發菌絲的生長，由酵母 菌型轉變至菌絲型 (Odds, 1988)。 白色念珠菌細胞型態大部分在一般情況下為光滑、白色圓頂形之菌落 (Sudbery et al., 2004)。然而，白色念珠菌不同的菌株在不同情況下可轉變 不同的型態，如菌株3153A 在少數情況下，可自發且可逆轉地轉變為多 樣菌落型態 (如星狀、環狀、不規則狀、皺摺狀、絨毛狀等)，這些菌落 都是同時包含酵母菌細胞和菌絲狀細胞。而菌株WO-1 和其它在類接合 型位置 (mating type like locus) 上為同型合子 (homozygote) 之菌株可做 較簡單之white-opaque 型態轉變 (Miller and Johnson, 2002)；white 細胞為 一般橢圓形平滑之酵母菌形態，opaque 細胞則為兩倍 white 細胞長之橢 圓形，且細胞壁表面有不規則小突出，而opaque 細胞較容易進行接合 (mating) (Miller and Johnson, 2002)。White-opaque 型態轉換對白色念珠菌 於哺乳類宿主中的致病機轉相關 (Gow, 2002; Johnson, 2003; Magee and Magee, 2004; Soll, 2004)。

研究指出降低白色念珠菌EFG1 之表現可抑制菌絲的形成，但血清仍 可誘發其生成假菌絲 (Stoldt et al., 1997)；而突變 EFG1 影響菌絲生成並 降低白色念珠菌對小鼠之毒性 (virulence) (Lo et al., 1997)。此外，白色

念珠菌雙突變株HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 則失去了在血清誘發下形 成菌絲的能力，且以此雙突變株感染小鼠，小鼠死亡率大幅降低，證明 雙突變株HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 不會造成毒性 (avirulent) (Lo et al., 1997)。因此，白色念珠菌雙型態現象 (dimorphism) 至少有兩種途徑 調控：一為MAPK (mitogen-activated protein kinase) 途徑調控的轉錄因子 Cph1p；二為 cylic AMP protein kinase A 途徑調控的轉錄因子 Efg1p (Lengeler et al., 2000)。受此二轉錄因子調控之下游基因，有哪些具有影 響型態變化的能力且如何影響，都為可進行研究之方向。

而另一方面，主要負向調控白色念珠菌型態變化為Tup1p，此蛋白質 可抑制菌絲的生長 (Braun and Johnson, 1997)，而研究指出其它基因產 物，如Nrg1p、Rfg1p 或 Mig1p，可與 Tup1p 形成 DNA-binding protein 以 抑制基因的表現 (Kaneko et al., 2006; Sprague et al., 2000)。剔除 TUP1 使 得白色念珠菌無法形成酵母菌型，而固定在菌絲型態 (Braun and Johnson, 1997)，此負向調控型態變化的基因剔除後，更影響了白色念珠菌近三分 之ㄧ的基因表現 (Murad et al., 2001a; Murad et al., 2001b)，也降低突變株 對老鼠的毒性。其它研究也指出，白色念珠菌spt3 雙套突變株為高度菌 絲狀的表現型，即使在不誘發菌絲生長的環境下，spt3 雙套突變株依然 生長菌絲；以此突變株感染小鼠亦無造成毒性 (Laprade et al., 2002)。白

色念珠菌SPT3 在大多數酵母菌及其它真核類生物，如人類皆有保存相似

DNA 序列 (Madison and Winston 1998; Ogryzko et al., 1998; Yu et al., 1998)，故也非為理想藥物標的之基因。

影響白色念珠菌型態變化的基因，部分研究發現同時也影響其毒性，

如剔除CPH1 和 EFG1 之菌株，無法表現菌絲型，此菌株對小鼠不會造

成毒性 (Lo et al., 1997)；而剔除 TUP1 或 SPT3 之菌株則大量表現菌絲型 態，失去形成酵母菌型之能力，這些突變株也不會對小鼠造成毒性 (Braun

and Johnson, 1997; Laprade et al., 2002)。因此研究認為白色念珠菌雙型態 的變化和其致病力相關 (Saville et al., 2003)；而型態轉換之能力被認為對 於白色念珠菌之毒性是重要的 (Cutler, 1991)。 1.3 白色念珠菌之細胞壁相關研究 白色念珠菌細胞壁為細胞最外層之結構，和細胞生長及分裂有密切相 關，並具在不同滲透壓下使細胞維持完整、黏附宿主等功能 (Cid et al., 1995)，同時細胞壁也是病原菌和宿主細胞最初的接觸點 (Groll et al., 1998a)。此外，哺乳類動物的細胞缺少細胞壁，因此這層結構也許適合作 為研發抗真菌藥物 (antifungal drugs) 之標的位置 (Odds, 2003; Gimeno et al., 1992; Liu et al., 1994)。而研究細胞壁的結構、組成和一些未知的細 胞壁蛋白質之功能，可促成更進一步了解細胞壁在型態變化和致病機轉 上參與的過程，以及開發新穎的抗真菌治療法 (Martinez-Lopez et al., 2004)。 1.3.1 細胞壁之組成 白色念珠菌細胞壁主要包含碳水化合物、蛋白質 (6～25％) 及脂質 (1 ～7％)。其中主要多醣體為三種結構：1,3-β-glucan 和 1,6-β-glucan (50～ 60％)、mannoproteins (15～22％)，以及 chitin (0.6～9％) (Calderone and Braun , 1991; Chaffin et al., 1998)。而白色念珠菌細胞壁的組成和啤酒酵 母菌 (Saccharomyces cerevisiae) 的組成很相似，1,3-β-glucans 則是真菌 細胞壁中主要的成分之一 (Klis et al., 2001; Cid et al., 1995;Mouyna et al., 2002 )。而已有文獻認為，細胞壁中的 β-glucans 經由內生性的 β-glucanases 水解，可能是發生於一些型態變化的過程中，例如出芽 (budding)、細胞 壁生長、接合作用 (conjugation) 等 (Cid et al., 1995; Nombela et al., 1988)。

1.3.2 β-glucan 與型態變化及引發宿主免疫機轉之研究

在型態的變化上，芽管 (germ tube) 為白色念珠菌由酵母菌型態轉為菌 絲的初期過渡型態 (Odds, 1988)，當芽管生成時，β-glucans 中 1,3-β 鍵結 的含量由30～39％提升至 67％，1,6-β 鍵結的含量由 43～53％降低至 14 ％ (Ruiz-Herrera et al., 2006)。而細胞分裂時 (cell separation)，母細胞 (mother cell) 與子細胞 (daughter cell) 之間有一中隔 (septum)，此組織由 三層構造組成：中心的初級中隔 (primary septum)，主要包含線性 1,3-β- glucan 以及中心外圍兩層次級中隔 (secondary septa)，為 1,3-β-glucan、 1,6-β-glucan 構成 (Humbel et al., 2001)。細胞分裂需要分解初級中隔，子 細胞才能變成兩個獨立之個體 (Martín-Cuadrado et al., 2003)。

而在引發宿主免疫機轉方面相關研究指出，當白色念珠菌被巨噬細胞 吞噬後，野生株可被誘發生成菌絲，最終殺死巨噬細胞，而菌絲型態也 可躲避宿主免疫細胞之作用;酵母菌型態則為在宿主組織內增生的形式 (Gow, 1997; Mitchell, 1998)。因此菌絲型態被認為提供了白色念珠菌對於 哺乳類免疫系統相互作用的好處 (Lo et al., 1997; Calderone and Fonzi, 2001; Saville et al., 2003)。而細胞壁成分對於宿主的免疫防禦系統也有免 疫調節的作用，如細胞壁中含量最多的β-glucan 會抑制人類單核球 (monocytes) 釋放細胞激素 (cytokine)，可因而避免引發後續之免疫反應 (Nakagawa et al., 2003a)。

在人體中Dectin-1 為一接受體 (receptor)，廣泛表現於吞噬細胞 (phagocytes)，如巨噬細胞或樹突細胞，此接受體辨別真菌細胞壁上之 β-glucan，進而引起免疫反應 (Brown and Gordon, 2003)。2005 年研究中 發現，Dectin-1 能辨別白色念珠菌酵母菌型態中的 β-glucan，而菌絲型態 細胞則因在細胞分裂時不會產生bud scars，所以不會暴露出 β-glucan，因 此Dectin-1 無法辨識菌絲型態的細胞而引起免疫反應 (Odd, 1988;

Gantner et al., 2005)。近年來已研究出一些單株或融合之抗真菌的抗體 (antifungal antibodies)，可提供對抗真菌感染之預防，當中有一些抗真菌 之抗體可藉由阻斷病原菌致病因子而提供保護作用 (De Bernardis et al., 2007; Vilanova et al., 2004; De Bernardis et al., 2002 )。研究指出藉由抗 β-glucan 抗體的保護，可抑制白色念珠菌之生長及附著力 (Torosantucci et al., 2009)。 所以白色念珠菌細胞壁成分β-glucan 與其細胞分裂型態變化及宿主之 免疫機轉息息相關，研究β-glucan 相關之基因也許可找到藥物治療的新 方向。 1.3.3 1,3-β-glucan 為生物膜 (biofilm) 之細胞壁主要成分 生物膜 (biofilm) 為許多病原微生物常見的汙染方式，由於生物膜可以 抵抗多種抗生素，並容易在侵入性導管內形成，使得治療不易且容易引 起院內感染 (Andes et al., 2004)。已生長成熟之生物膜 (mature biofilm) 與剛開始形成的浮游狀細胞 (planktonic cells) 相比，抗藥性可高達一千 倍 (Lewis et al., 2002; Mukherjee et al., 2003)。

白色念珠菌之生物膜也具有抗藥性，如抗amphotericin B 和 triazoles (Ramage et al., 2001; Ramage et al., 2002)。研究證實生物膜中細胞壁主要 成分為1,3-β-glucan，成熟的生物膜細胞較浮游狀細胞含較高 1,3-β- glucan 的含量；而加入 1,3-β-glucanase，則提高抗真菌藥物 fluconazole 和amphotericin B 對生物膜的效用。推測可能因 1,3-β-glucan 和抗真菌藥 物相互作用，而抑制藥物穿透，而經由1,3-β-glucanase 降解後則減少抑 制藥物穿透的現象；另一推測為細胞壁成份含量改變，以致無法保護生 物膜細胞抵抗外在的抗真菌藥物 (Nett et al., 2007)。

1.3.4 白色念珠菌中與 1,3-β-glucanase 相關之基因

1,3-β-glucanases 所降解 (Adams, 2004; Chaffin et al., 1998)。CaGsl1p 為 1,3-β-glucan synthase，此基因為白色念珠菌生存所必需，故無法剔除 CaGSL1 以進行研究 (Mio et al., 1997)。而與 1,3-β-glucanase 相關基因有 轉譯出酵素exo-1,3-β-glucanases 的 CaEXG1、CaEXG2、CaSPR1，和轉 譯出endo-1,3-β-glucanase 的 CaENG1 (又稱 DSE4)、CaENG2 (在 S. cerevisiae 中的 homolog 為 ACF2)，如表一所示，比對白色念珠菌中與 CaENG1 轉譯出之胺基酸序列相似度較高的基因則為 CaENG2。

白色念珠菌有關exo-1,3-β-glucanases 之研究可追溯至 1984 年，近年來 多篇研究此蛋白質之發表，對於相關基因已有深入的了解；CaEXG1 為 主要轉譯exo-1,3-β-glucanases 的基因，CaExg1p 並不為白色念珠菌生長 所必需，剔除CaEXG1 不會對白色念珠菌造成型態變化上的差異，然而 Caexg1 突變株會增加對 chitin 和 glucan 合成抑制劑的感受性 (Ram et al., 1984; González et al., 1997)。

而關於白色念珠菌 endo-1,3-β-glucanase 之研究相對較少，僅有 2005 年 對於CaENG1 之研究，提到 CaEng1p 功能和啤酒酵母菌 Eng1p 功能相似， 並與細胞分裂相關 (Esteban et al., 2005)；以及文獻提到 CaENG2 基因表 現對於生物膜生成並無影響 (Murillo et al., 2005)。

1.4 ENG1 之相關研究

1.4.1 CaENG1 之相關研究

白色念珠菌 CaENG1 蛋白質產物為 endo-1,3-β-glucanase，此對偶基因 分別位於Contig19-10163 的 orf19.3066 (3438 bp, 1145 amino acids) 和 Contig19-20163 的 orf19.10584 (3441 bp, 1146 amino acids) (Candida Genome Database; Esteban et al., 2005)。CaEng1p 可在啤酒酵母菌中表 現，並補償啤酒酵母菌eng1 突變株分裂缺陷的情況 (Esteban et al.,

2005)。CaEng1p 有一段大約 700 個胺基酸之區域，和 ScEng1p 相似 (P437 至A1136)，為高度保留，此區域特徵屬於 GH81 (glycosyl hydrolases family 81) 家族，此家族之蛋白質皆擁有大約 650 個胺基酸之區域，其中包含 可能具催化能力的部份 (Martín-Cuadrado et al, 2008)；GHF81 當中有些 酵素高度專一於1,3-β 鍵結，具有以內部水解模式降解 glucans 之特色 (Esteban et al., 2005; Baladrón et al., 2002; Martín-Cuadrado et al., 2003; Mouyna et al., 2002; Coutinho et al., 1999)。

而文獻發表CaENG1 與 CaCHT2 (轉譯出 chitinase) 之轉錄皆和細胞分 裂過程有關，並在酵母菌型態至菌絲型態轉變期間，二者表現量皆下降， 說明二者之酵素活性在型態轉變過程中是被抑制的 (Esteban et al., 2005; McCreath et al., 1995)。而白色念珠菌 CDC14 可轉譯出蛋白質磷酸酯酶 (protein phosphatase)，可負向調控 B 型細胞週期蛋白 (B-type cyclcins)， 而細胞週期蛋白則可能影響菌絲型態；剔除CDC14 導致嚴重細胞分裂的 缺陷，而cdc14 突變株中，和細胞壁相關基因 CHT3 (轉譯出 chitinase)、 CaENG1、DSE1 (預測其基因產物為細胞壁蛋白質) 表現量皆顯著下降 (Clemente-Blanco et al., 2006)。文獻也指出 Sep7p 為 septin，野生株侵入 性生長所必須，當剔除SEP7 後，抑制了誘發白色念珠菌菌絲生長時的細 胞分裂，而其sep7 突變株中，CaENG1、DSE1 及轉錄因子 ACE2 之表現 量皆上升 (González-Novo et al., 2008)。

1.4.2 高同源性物種之 ENG1 相關研究

不同物種中ENG1 之研究，在啤酒酵母菌 (S. cerevisiae) 和裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe) 的 endo-1,3-β-glucanases 屬於醣基水解酶 (glycosyl hydrolases) 家族 81 (family 81, GH81)，皆發表與細胞分裂有 關，剔除ENG1 會造成細胞分裂的缺陷 (Baladrón et al., 2002; Martín- Cuadrado et al., 2003; Coutinho et al., 1999)。

在啤酒酵母菌 (S. cerevisiae) 中，比對出其 Eng1p 和 CaEng1p 在保留 區 (conserved region) 有高達 54％同源性 (identity)，而啤酒酵母菌 ENG1 的轉錄只表現在營養性細胞中 (vegetative cells)，在孢子繁殖 (sporulation) 過程中表現量則顯著下降以致無法被偵測 (Baladrón et al., 2002)。而啤酒 酵母菌有一轉錄因子ACE2 也可活化及轉譯出和 endo-1,3-

β-glucanases 相同功能之蛋白質，研究發現 ace2 突變株中，偵測不到 ENG1 和CTS1 (轉譯出 chitinase) 基因之表現，故認為 ENG1 轉錄需要 Ace2p， 且此現象與CTS1 相似 (Baladrón et al., 2002; Doolin et al., 2001)。

在裂殖酵母 (S. pombe)中，Eng1p 則參與了初級中隔 (primary septum) 裂解的過程 (Martín-Cuadrado et al., 2003)。而在煙麴菌 (Aspergillus fumigatus) 中，缺少 ENG1 轉譯之蛋白質並無造成明顯不同的表現型 (phenotype) (Mouyna et al., 2002)。

1.5 CaENG1 與 MTL 基因 (mating type like) 之研究

白色念珠菌目前尚未發現有性生殖，雖然近來研究發現白色念珠菌可 進行接合作用 (mating) 以及無性生殖周期 (parasexual cycle)，但並不能 進行減數分裂 (meiosis) (Hull et al., 2000; Tzung et al., 2001; Bennett and Johnson, 2003; Forche et al., 2008)。白色念珠菌雖然可經由增加 mating type locus 之變異而誘發其進行接合 (Magee and Magee, 2000; Hull et al., 2000)，但在正常生長下，極少機率進行 mating，故其基因雜交 (genetic crosses) 極具困難 (De Backer et al., 2001)。

誘發白色念珠菌進行接合作用，首先需將白色念珠菌由a/α 型態細胞 轉變為a/a 或 α/α 型態之細胞：白色念珠菌在五號染色體上帶有 MTLa1 之基因，而另一條allele 則帶有 MTLα1 和 MTLα2 (Hull and Johnson, 1999)。當給予白色念珠菌山梨糖 (sorbose) 培養時，會致使白色念珠菌

失去一條五號染色體 (Janbon et al., 1998)，推測因為負調控利用山梨糖 (negative regulator of the sorbose-utilization gene) 之基因存在於五號染色 體上，當減少此負調控者的表現，例如失去其中一條五號染色體，則可 以使菌株生長於山梨糖培養基中 (Bennett and Johnson, 2005)。當將菌株 移除山梨糖培養的環境以後，剩下的一條五號染色體將會進行複製，產 生兩條相同的五號染色體，故形成基因型a/a 或 α/α 的 a-type 細胞或 α-type 細胞 (Janbon et al., 1998; Janbon et al., 1999)。

而a-type 細胞及 α-type 細胞則較容易進行 white-opaque 型態轉變，當 菌株轉變為opaque 型態時，進行接合的效率約為 white 型態 106倍 (Miller and Johnson, 2002)。文獻也指出，opaque 型態之細胞可分泌高表現量之 毒性因子aspartyl proteinase，white 型態則無此現象 (Morrow et al., 1992)；動物實驗中則發現 white 型態細胞較 opaque 型態細胞更具毒性， 而opaque 型態則適合在感染處聚集增生 (Kvaal et al., 1997; Kvaal et al., 1999)；white-opaque 型態轉換也影響了白色念珠菌的致病機轉 (Gow, 2002; Johnson, 2003; Magee and Magee, 2004; Soll, 2004)。

Alpha pheromone 由 α opaque 細胞分泌，並影響接合初期時的 a opaque 細胞 (Miller and Johnson, 2002; Lockhart et al., 2003)。在 2006 年研究以 microarray 分析發現，在營養源不足、甘露醇 (mannitol) 作為唯一碳源 之培養環境下 (SpiderM 培養基)，給予野生株 SC5314 衍生出之 opaque 狀態a/a 細胞 alpha pheromone (10 μg/ml)，其 CaENG1 表現較正常情況下 減少了三倍以上的表現量 (Bennett and Johnson, 2006; Côte and Whiteway, 2008)。而 CaENG1 與 MTL 基因之相互影響，或在 white-opaque 型態轉 變中扮演之角色目前並無研究探討。

研究白色念珠菌之基因功能的困難度在於：一、基因雜交 (genetic

crosses) 是困難的 (De Backer et al., 2001)。二、沒有已知質體 (plasmid)， 故目前沒有較方便突變基因的方法 (Matthews et al., 1997)。三、由於是 雙倍體真菌，因此剔除基因需要重覆流程 (Pla et al., 1996)。四、轉形的 效率很低。先前研究常以營養性篩選標記 (ARG4, HIS1, URA3 marker) 剔 除白色念珠菌標的基因 (Dennison et al., 2005)，不但要在三種不同的篩選 標記上建構標的基因上下游相似序列，花費較多的時間，也因白色念珠 菌沒有已知質體、轉形困難，增加了基因剔除的難度 (Matthews et al., 1997; De Backer et al., 2001)。且近年來研究發現篩選標記 URA3 會隨插入 不同基因體中的位置而有不同程度的表現量，進而影響菌株型態之變 化，而剔除URA3 的菌株則無毒性 (avirulence) (Lay et al., 1998; Staab and Sundstrom, 2003; Kirsch and Whitney, 1991; Cole et al., 1995)。白色念珠菌 對宿主細胞之附著力及其它毒性因子也會因URA3 表現的程度而受影響 (Bain et al., 2001)。因此以 URA3 篩選標記作為研究白色念珠菌中標的基 因之工具會無法避免URA3 此基因在菌株內表現而帶來的影響 (Staab and Sundstrom, 2003)。

故近年來發展適用於白色念珠菌野生株 SC5314 之篩選標記 SAT1 flipper (Reuss et al., 2004)，其所在之質體 pSFS2 上帶有白色念珠菌 caSAT1，可抗藥物 nourseothricin 以作為篩選；以及 caFLP，轉譯出蛋白 質 (site-specific recombinase) 會和 SAT1 flipper 兩端特定序列 FRT

(minimal FLP recombination target sequence) 結合，彎曲兩端 FRT 包圍之 DNA 序列並進行切除，進而將序列從基因體中 pop-out，而後只剩下一端 FRT 序列留於基因體中，此法可減少外來基因對白色念珠菌造成之影響 (Reuss et al., 2004; Wirsching et al., 2000;Luetke and Sadowski, 1995; Shaikh and Sadowski, 2000)。而 pop-out 篩選標記另一好處，則可再重覆

使用篩選標記剔除另一股allele 之標的基因，故節省許多時間與精力。

1.7 本文之研究起源及目的

由於白色念珠菌伺機感染免疫功能不全之患者，造成嚴重症狀且有高

致死率 (Kullberg and Filler, 2002; Ruan and Hsueh, 2009 )，而近年來抗藥 性菌株的產生，使得治療上更加困難 (De Backer et al., 2001)。白色念珠 菌細胞壁的相關基因應是理想的藥物標的，在細胞壁中1,3-β-glucan 為主 要成分之ㄧ，而β-glucan 也被研究證實與宿主的免疫機制相關

(Nakagawa et al., 2003a; Brown and Gordon, 2003)。CaENG1 之蛋白質產物 為endo-1,3-β-glucanase，裂解 β-glucan 中 1,3 共價鍵 (Esteban et al., 2005)。研究證實在不同物種中 ENG1 和細胞分裂相關 (Baladrón et al., 2002; Martín-Cuadrado et al., 2003; Esteban et al., 2005)；在酵母菌型態至 菌絲型態轉變期間CaENG1 表現量下降 (Esteban et al., 2005)；剔除 CDC14 導致細胞分裂嚴重的缺陷，且 CaENG1 表現量顯著減少

(Clemente-Blanco et al., 2006)；剔除 SEP7，野生株侵入性生長所必須之 基因，CaENG1 表現量明顯上升 (González-Novo et al., 2008)。以上研究 顯示了CaENG1 在型態變化上的重要性。

承襲實驗室先前發表之論文，以營養篩選標記 ARG4、URA3 及 HIS1 剔除CaENG1，結果發現 CaENG1 和篩選標記 URA3 會影響白色念珠菌 菌絲的生成：剔除CaENG1 降低同環境下細胞菌絲的生長；而營養性篩 選標記URA3 則會增加同環境下細胞菌絲的生長，此二者對菌絲生長出 現相反的誘因，故於結果判斷上顯得困難 (交大碩士論文 謝志豪, 2006)。然而重新檢驗先前建構之 Caeng1 突變株、驗證營養性篩選標記 影響菌絲生長之程度，以及確認實驗流程之設計需耗費大量時間。 因此本論文之目的為排除營養性篩選標記 URA3 之影響，探討 CaENG1

對白色念珠菌型態變化及致病力是否相關。實驗策略為以抗藥性篩選標

記剔除CaENG1，再以南方點墨法和 RNA 表現量來檢驗突變株之建構，

之後進行突變株的性狀分析，觀察剔除CaENG1 後的結果是否與先前之 研究相符合，以求更進一步確認CaENG1 對白色念珠之影響為何。

二、材料與儀器

2.1 菌株 (strain)

(1) Escherichia coli (strain：DH5α)：

其 基 因 型 為 supE44△lacU169 (Φ80lacZ△M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1。

(2) Candida albicans：

菌株 (Strain) 基因型 (Genotype) 來源 (Sources) SC5314 wild-type strain (Gillum et al.,1984)

BWP17 arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3 (Wilson et al., 1999) JKC19 cph1/cph1 EFG1/EFG1 (Liu et al.,1994)

HLC52 CPH1/CPH1 efg1/efg1 (Lo et al., 1997)

HLC54 cph1/cph1 efg1/efg1 (Lo et al., 1997)

EHK1 CaENG1/Caeng1::FRT 本實驗 EKG7 Caeng1::FRT/Caeng1::FRT 本實驗 EKP2 Caeng1::FRT/Caeng1::FRT 本實驗 EGR Caeng1::FRT/CaENG1::FRT 本實驗 WT-1a WT-2a WT-3a

a/a, CaENG1/ CaENG1 交大楊昀良實驗室 博士生 柯惠菁

菌株 (Strain) 基因型 (Genotype) 來源 (Sources) WT-4α WT-5α WT-6α α/α, CaENG1/ CaENG1 交大楊昀良實驗室 博士生 柯惠菁 EKP2-1a EKP2-3a EKP2-4a EKP2-5a EKP2-6a a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT 交大楊昀良實驗室 博士生 柯惠菁 EKP2-2α α/α, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT 交大楊昀良實驗室 博士生 柯惠菁 2.2 質體 (plasmid)

質體 (Plasmid) 描述 (Description) 來源 (Sources) pSFS2 帶有SAT1 marker，可抗

nourseothricin。並含 caFLP 及 MAL2p，可經 maltose 誘使 marker 從 genome 中 pop-out。 在E.coli 中篩選標記為抗 ampicillin。 (Reuβ et al.,2004) pSAT1-B pSFS2 質體外接 CaENG1 下游 約360 bp 的片段。 本實驗

pSAT1-BA pSAT1-B 質體外接 CaENG1 上 游約600 bp 的片段。

pRes20 pSAT1-B 質體外接 CaENG1 上 游至下游約4.4 kb 之片段，經定 序確認包含CaENG1 open reading frame 正確之序列。 本實驗 2.3 引子 (primer) 引子 序列 5’～ 3’ 位置 ENG1A-F CGGGGTACCGTCATTAACAATTGAGAT KpnⅠ ENG1 gene： -703～-686 ENG1A-R CCGCTCGAGATTGAATAGACATGAGAA XhoⅠ ENG1 gene： -102～-119 ENG1B-F CCTTGCGGCCGCTGCATCAAATAACT NotⅠ ENG1 gene： ＋3345～＋3359 ENG1B-R GCCCGCGGGACATGAGTACCCAAA SacⅡ ENG1 gene： ＋3706～＋3691

pENG1A-F GCAATAGAAGCCTGCAAACTCATAAA ENG1 gene：

-863～-838

ENG1-3656-F GGCTCTGCATATTATAACGACCACGATTT ENG1 gene：

＋2656～＋2684

SAT1-860-R GCTACAACTCAGAGCACGCTAGACAAATT pSFS2 plasmid： ＋267～＋239

resA-F GGGGTACCGTCATTAACAATTGAGATGAAAAG KpnⅠ

ENG1 gene：

resB-R CCCTCGAGGACATGAGTACCCAAAAGATAC XhoⅠ

ENG1 gene：

＋3706～＋3685

DSR1 GCTTCCTTTGTAATTGTAACTGCATCTG ENG1 gene：

＋747～＋719

DSR2 CCGTTGTTGTCGACACCAGCAGGAATTG ENG1 gene：

＋1375～＋1346

DS3 CCAATGGGTCTATTTCCTTTATATCG ENG1 gene：

＋785～＋810

DS4 CCAGTTCAAGTTCAGAAAGTGTTG ENG1 gene：

＋1214～＋1238

DS5 GCTGAATTGTCTGCCTTGGTTAC ENG1 gene：

＋1651～＋1674

DS6 GCCACTGTTCTGGGAAGTGTATC ENG1 gene：

＋2060～＋2081

DS7 GGTTAGTGAAATCATACAGGATGAA ENG1 gene：

＋2484～＋2508

ENG1OB-R GGTGTGCAGTAGAATGAGGAATGACATTC ENG1 gene：

＋3990～＋3962

HJL00134-F TTGAAGCGTGAGAGGCTAGGAG MTLa1 gene：

＋109～＋129

HJL00135-R ATCAATTCCCTTTCTCTTCGATTAGG MTLa1 gene：

＋595～＋570

HJL00136-F TTCGAGTACATTCTGGTCGCG MTL α1 gene：

HJL00137-R TGTAAACATCCTCAATTGTACCCGA MTLα1 gene：

＋571～＋547

ACT1-F GGATTCTGGTGATGGTGTTACTC ACT1 gene：

＋1120～＋1142

ACT1-R ACCATGTTCCCAGGTATTGC ACT1 gene：

＋1590～＋1571

FN-F GGCAACTGGTTTGTTCGTCACTT ENG1 gene：

＋2871～＋2893

FN-R CCAGTCCAGCCACTATCAACATT ENG1 gene：

＋3291～＋3268

註：灰色部分為限制酶酵素切位，底線部分為外加之核苷酸

2.4 化學藥品

z Difco laboratories

Bacto agar (Cat. No. 143175)，YPD broth (Cat. No. 235141XB)，Nutrient broth (Cat. No. 149018)，D-mannitol(Cat. No.217020，Yeast nitrogen base w/o amino acid (Cat. No. 145368)

z J.T Baker

Tris base (Cat. No. 4109-01)，Triton X-100 (Cat. No. X198-07)， Formaldehyde (Cat. No. 15512)，3-N-Morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) (Cat. No. 1132612)

z Amersco：

Glycerol (Cat. No. 0854-1L-PTM)，Phenol (Cat. No. 0945-400ML) z Roche：

DIG DNA labeling mix (Cat. No. 1277065)，Anti-DIC-AP (Cat. No.

1093274)，CSPD (Cat. No. 1655884)，DIG Easy Hyb (Cat. No. 11603558 001)，Blocking reagent (Cat. No. 1096176)

z Sigma Chemical Co.

Dithiothreitol (DTT) (Cat. No. D9779)，Glassbeads (425~600 μm) (Cat. No. G9268-500G)，Lithium acetate (CH3COOLi) (Cat. No. L-6883)

Congo red (Cat. No. C6767) z Merck

Chloroform (Cat. No. 1.0244511000)，Dodecyl sulfate sodium (SDS) (Cat. No. 113760.0100)，Ethanol (Cat. No. K33534874)，Potassium chloride (KCl) (Cat. No. K24252236)，Sodium acetate (Cat. No. 1.06268.0250)，Sodium hydroxide (NaOH) (Cat. No. B886298)，Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrogen chloride (Tris-Cl) (Cat. No. 8382T006)，Sodium chloride (NaCl) (Cat. No. K29779304)，Maleic acid (Cat. No. S27857)，Tween 20 (Cat. No. P-1379)，Triton X-100 (Cat. No. K23841503)

z Scharlau

LB agar (Cat. No. 01-385)，LB broth (Cat. No. 02-385) z AppliChem

Ampicillin (Cat. No. A0839) z Invitrogen

Goat serum (Cat. No. 01-6201)，SuperScriptTM One-Step RT-PCR with Platinum Taq (Cat. No. 10928-034)

z Fluka

Calcofluor white stain (Cat. No. F3397) z Werner Bioagents

Nourseothricin (Cat. No. 5.1000) z Kodak

X-film (Cat. No.1651454) z Subenzyme：

1kb DNA ladder (Cat. No. SEM11C001)

2.5 酵素

z NEB

BamHⅠ (Cat. No. R0136S)，BspEⅠ (Cat. No. R0540S)，BsrGⅠ (Cat. No. R0575S)，EcoRⅠ (Cat. No. R0101S)，HpaⅠ (Cat. No. R0105S)，KpnⅠ (Cat. No. R0142S)，NotⅠ (Cat. No. R0189S)，SacⅡ (Cat. No. R0157S)， XbaⅠ (Cat. No. R0145S)，XhoⅠ (Cat. No. R0146S)

2.6 藥品配製

2.6.1 培養基及培養液配製

z LB (Luria-Bertni) 培養液

1％ tryptone，0.5％ yeast extract，1％ NaCl z LB/Ampicillin 培養基

1％ tryptone，0.5％ yeast extract，1％ NaCl，1.5% agar，50 µg/ml Ampicillin

z YPD 培養液

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose z YP/Maltose 培養液

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ maltose z YPD/10％ goat serum 培養液

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose，10％ goat serum z YPD 培養基

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose，2％ Bacto-agar z YPD/nourseothricin 培養基

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose, 2％ Bacto-agar，200 μg/ml Nourseothricin

z YPD/4％ goat serum 培養基

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose，2％ Bacto-agar， 4％ goat serum

z YPD/Uridine/4％ goat serum 培養基

1％ yeast extract，2％ Bacto-peptone，2％ dextrose，2％ Bacto-agar， 4％ goat serum，80 mg/L uridine

z Bacto agar/4％ goat serum 培養基 2％ Bacto-agar，4％ goat serum z Solid spider 培養基

1％ nutrient broth，1％ mannitol，0.2％ K2HPO4，1.35％ Bacto-agar

z YEPS 培養基

1％ yeast extract，2％ peptone，2％ sorbose，2％ Bacto-agar

2.6.2 緩衝溶液及試劑 z 20 mM MaCl2 0.406 g MaCl2 dissolved in dd H2O to 100 ml z Freezer solution 50 mM CaCl2，15％ glycerol z 10 X Tris-EDTA (10 X TE) 100 mM Tris-Cl，10 mM EDTA (pH 7.5)

z 3 M Sodium acetate (NaOAC)

40.83 g NaOAC dissolved in dd H2O to 100 ml (pH 7.0)

z 1 M Dithiothreitol (DTT)

3.09 g DTT dissolved in 0.01 M NaOAC 20 ml，store at -20℃ z 1 M Lithium acetate (LiOAC)

20.4 g LiOAC dissolved in dd H2O to 200 ml (pH 7.5) z 1 M Sorbitol 33.4 g sorbitol in dd H2O to 200 ml z Breaking buffer 2％ Triton X-100，1％ SDS，0.1 M NaCl，1 X TE z Denaturation solution 0.5 M NaOH，1.5 M NaCl z Neutralization solution 0.5 M Tris-Cl，1.5 M NaCl (pH 7.5) z 20 X SSC

3 M NaCl，0.3 M Sodium citrate (pH 7.0) z Dectection buffer 0.1 M Tris-Cl，0.1 M NaCl (pH 9.5) z 2 X Washing buffer 10 × SSC，0.1％ (w/v) SDS z 0.5 X Washing buffer 5 X SSC，0.1％ (w/v) SDS z Washing buffer

0.1 M Maleic acid，0.15 M NaCl (pH 7.5) ，0.3％ Tween 20 z Maleic acid buffer

0.1 M Maleic acid，0.15 M NaCl (pH 7.5) z 10 X Blocking buffer

1％ (w/v) blocking reagent (Roche) dissolved in maleic acid buffer z 10％ (w/v) SDS

10 g SDS dissolved in dd H2O to 100 ml (pH 7.2)

z 10％ (w/v) Potassium hydroxide

10 g potassium hydroxide dissolved in dd H2O to 100 ml

z RNA isolation buffer (RIB)

2.5 M NaCl，0.5 M Tris-Cl，0.25 M EDTA，1％ (w/v) SDS，0.1％ DEPC (diethyl pyrocarbonate)

z 10 X MOPS (3-N-Morpholinopropanesulfonic acid)

0.2 M MOPS (pH 7.0)，20 mM sodium acetate，10 mM EDTA (pH 8.0) in DEPC-treated H2O

2.7 儀器設備

微電腦多功能冷凍高速離心機 Cebtrifuge 5804R (eppendorf) 離心機 KUBOTA 5100 (KUBOTA CORPORATION)

微量高速冷凍離心機 Centrifuge 5415R (eppendorf) 雜交連結器 (UVITEC)

電子防潮箱DX106 (台灣防潮科技) 超純水製造機 Simplicity (MILLIPORE)

震盪器 VORTEX-GENIE2 G560 ( SCIENTIFIC INDUSTRICS ) 平面式震盪器 S-101 (FIRSTEK SCIENTIFIC)

加熱攪拌器 S101（FIRSTEK SCIENTIFIC） 乾燥加熱板 DB102（Violet BioSciences, Inc.）

酸鹼值檢測計 Φ360（BECKMAN）

電子天秤 PB153-S ( METTLER TOLEDO ) 往復式恆溫水槽 B206（FIRSTEK SCIENTIFIC） 水浴槽 B-100 (FIRSTEK SCIENTIFIC)

迴轉式震盪培養箱 721SR (WISDOM APPARATUS MFG COMPANY) 恆溫式震盪培養箱 B206（FIRSTEK SCIENTIFIC）

梯度核酸增殖儀 labcycler (SENSQUEST) 脈衝器 MicroPulserTM (BIO-RAD)

核酸計算儀 GeneQuant pro (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) 電磁式奈米級偵測儀 ND-100 (NanoDrop)

無菌操作台 Legrand (CHERNG HUEI)

電泳影像處理系統 GEL DOC 2000（BIO-RAD） 4 ℃三門冰藏櫃 KS-101-MS ( MINI KINGKON ) -20 ℃冷凍櫃 ( WHITE-WESTINGHOUSE ) -86 ℃冷凍櫃 925/926（Forma Scientific） 倒立顯微鏡CK40 (OLYMPUS) 數位相機C-5050ZOOM (OLYMPUS) 實體顯微鏡 數位相機 K200D (PENTAX)

雷 射 掃 瞄 式 共 軛 焦 顯 微 鏡 (Laser Scanning Confocal Microscope) (Olympus)

三、方法與步驟

3.1 質體 DNA (plasmid DNA) 的萃取

取單一菌落培養約12～16小時後，離心1,125×g、12分鐘，去上清液。 以DNA isolation kit (Premier PM250) 萃取質體DNA。加入200 μl solution 1，混合均勻，將菌體移置新的1.5 ml 離心管，溫和反轉5次。加入200 μl solution 2，混合均勻，溫和反轉5次，等待2分鐘。再加入200 μl solution 3， 混合均勻，溫和反轉5次。迅速離心15,700×g、5分鐘，小心取上清液至spin column。離心15,700×g、1分鐘，倒掉過濾液。加入700 μl washing buffer， 離心15,700×g、1分鐘，倒掉過濾液。再加入700 μl washing buffer，離心 15,700×g、1分鐘，倒掉過濾液。Spin column 15,700×g空轉5分鐘。將spin column移置新的1.5 ml 離心管，於乾燥加熱板上65 ℃、5分鐘。以50 μl 二次無菌水或1 X TE buffer加入spincolumn中，靜置2分鐘。15,700×g、3 分鐘收下質體DNA，儲存於-20 ℃。

3.2 聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction)

以設計好之一對 primer，配合 DNA template 及 taq polymerase，可將 欲得到之DNA 片段合成出來。將下列材料混合於 200 μl 微量離心管內：

3.2.1 一般 PCR 反應

1 unit (U) 的 Taq Polymerase (5 U/μl) (NEB M0267S)、10 X PCR buffer 5 μl、50 μM 的引子各 1 μl、2.5 mM dNTPs mixture 4 μl、0.1 μg 的 template DNA，補二次無菌水至總體積 50 μl，置於 PCR 溫度控制儀進行聚合酶 連鎖反應。以此方法反應預計得到CaENG1 上游 A region 及下游 B region。

3.2.2 Rescued CaENG1 PCR 反應

B region 之片段約為 4.4 kb。使用 Phusion™High-Fidelity PCR Kit (NEB F -553S) 進行 PCR 反應，其聚合酶不會在 DNA 產物後加上 dATP，且有 proof reading 之功能。故選用此酵素進行反應。以傳統法萃取的 Candida albicans 之 gDNA 為 template (～1 μg)、5 X Phusion HF buffer 10 μl、1 mM dNTPs 1 μl、50 μM 的引子各 1 μl、Phusion™ DNA polymerase 0.5 μl (2 U/μl)，補二次無菌水至總體積 50 μl，再置於 PCR 溫度控制儀進行 反應。 PCR 溫度控制儀的設定如下︰ 一般PCR Rescued ENG1 PCR 95 ℃ 5 分鐘 95 ℃ 30 秒 95 ℃ 1 分鐘 52~55 ℃ 1 分鐘 72 ℃ 1 分鐘 (重複 30 個循環) 95 ℃ 10 秒 52 ℃ 30 秒 72 ℃ 2.5 分鐘(重複 30 個循環) 72 ℃ 5 分鐘 72 ℃ 10 分鐘 4 ℃ 停止反應 4 ℃ 停止反應 反應完成後，利用0.8％ 洋菜膠電泳確認 PCR 產物片段大小是否正確， 再利用PCR Clean-up Kit (Premier CU250) 來純化 DNA 去除酵素及鹽類。

3.3 大腸桿菌勝任細胞(competent cell)的製備 (Dagert and Ehrlich, 1979)

單一菌落 (DH5α) 培養至37 ℃、250 rpm 隔夜培養12～16小時。取2 ml 菌液轉養至100 ml LB培養液(含5％ glucose及10 mM MgCl2)中。37 ℃、

250 rpm，培養至OD600約0.4～0.7。將培養之細胞置於冰上20分鐘，將菌

液分裝至50 ml離心管，4 ℃離心1,620×g、10分鐘，去上清液。將離心管 倒置於紙巾上3分鐘，加入25 ml預冷之0.1 M CaCl2，以手搖晃懸浮菌體。

將離心管置於冰上30分鐘，4 ℃離心720×g、10分鐘，去上清液。加入2.5 ml預冷之0.1 M CaCl2，置冰上1小時後可直接進行轉形。或置4 ℃ 12～16 小時後，低溫離心720×g、5分鐘，去上清液。加入2.5 ml預冷之freezer solution，混合均勻後，分裝至1.5 ml離心管，迅速儲存於 -80 ℃。（以上 均為無菌操作）。 3.4 限制酶反應 (enzyme digestion) 3.4.1 確定質體 DNA 片段大小之限制酶反應

取 DNA 1 μg、1 U/kb 限制酶、10 X buffer 1 μl、10 X BSA 1 μl，補充無 菌二次水至總體積10 μl，37 ℃水浴培養 1 小時，再以 0.8％洋菜膠電泳 進行片段大小之分析。

3.4.2 為 clone 所需之限制酶反應

取 DNA 10μg、10 X buffer 5 μl、10 X BSA 5μl、限制酶 1 μl、補二次無 菌水至總體積為50 μl，37 ℃反應 3 小時至 18 小時（依酵素特性）。反 應完成後，以clean up kit (Premier CU250) 去除限制酶、buffer 及鹽類等， 所得到之DNA 片段用以進行下一步接合反應。

3.5 接合反應 (ligation)

將載體 DNA (vector DNA) 及欲插入之 DNA 片段 (insert DNA) 連結之 反應條件為︰vector DNA 50～400 ng、insert DNA 和 vector DNA 莫耳濃 度比為3︰1、10 X ligase buffer 1 μl、T4 DNA ligase (5 U/μl) (Fermentas EP0402) 0.4 μl，補無菌二次水至總體積 10 μl。4 ℃培養 12～16 小時，或 22 ℃培養 1 小時。

將 competent cell 冰上解凍，分裝至 50 μl，加入 pDNA （0.1～1 μg）， 其中一管不加入pDNA 以做為控制組。冰浴 30 分鐘，42 ℃熱休克（heat shock）60 秒（＜90 秒）。加入 300 μl LB broth，37 ℃、150 rpm 培養 1 小時。再取80～100 μl 菌液塗抹至含有 ampicillin 之 LB 的培養基上 （AMP：50 μg/ml），37 ℃培養 12～16 小時。（以上均為無菌操作）

3.7 洋菜膠內之 DNA 萃取 (gel extraction) 3.7.1 結晶紫洋菜膠之製備

將 0.4 g agarose 粉末加入 50 ml 1 X TAE buffer 中，微波爐加熱溶解 agarose，稍冷後加入 40 μl 結晶紫溶液 (2.5 mg/ml)，混合均勻，倒入製 膠台中，冷卻凝固即可使用。

3.7.2 洋菜膠內之 DNA 片段萃取

將欲萃取之洋菜膠上的 DNA 片段以電泳方式分離，以刀片切下欲得到 之DNA 片段。將洋菜膠片段放置微量離心管中，以 Gel extraction kit (Premier DE250)，加入與片段等量之 binding buffer，60 ℃加熱板上加熱 10 分鐘，確定洋菜膠片段完全融化後，冷卻至室溫。將混合液移至 spin column，15,700×g、1 分鐘、去收集管內液體。加入 700 μl washing buffer， 15,700×g、1 分鐘、去收集管內液體。重覆加入 700 μl washing buffer， 15,700×g、1 分鐘、去收集管內液體之後，空轉 15,700×g、2 分鐘。將 spin column 移至新的微量離心管，60 ℃加熱 5 分鐘，30 μl 無菌二次水加入 spin column 正中央，等待 2 分鐘，15,700×g、1 分鐘離心後，即得欲萃取 之DNA，將之儲存於 -20 ℃。 3.8 白色念珠菌轉形反應 3.8.1 白色念珠菌勝任細胞之製備

接種單一菌落至 5 ml YPD 培養液中、30 ℃ 培養 18～24 小時、150 rpm。取 5 μl 已培養之菌液轉養至 50 ml YPD 培養液 30 ℃ 16～24 小時、 150 rpm 至 OD600約1.6～2.2。菌液分裝至 50 ml 離心管中，離心 1,620×g、 5 分鐘，去上清液。加入 1 ml 1 M lithium acetate 及 1 ml 10 X TE 和 8 ml 無 菌二次水。30 ℃ 培養 1 小時、150 rpm。再加入 250 μl 1 M DTT，30 ℃ 培養半小時、150 rpm。之後加入 40 ml 無菌二次水，離心 1,620×g、5 分 鐘。以下開始冰上操作：加入25 ml 預冷過之無菌二次水懸浮菌體，4 ℃ 低溫離心1,620×g、5 分鐘，去上清液。再加入 5 ml 預冷過之 1 M sorbitol， 4 ℃低溫離心 1,620×g、5 分鐘，去上清液。重複加入 5 ml 1 M sorbitol， 4 ℃低溫離心 1,620×g、5 分鐘，去上清液。最後加入 50 μl 1 M sorbitol， 靜置於冰上，即為白色念珠菌之勝任細胞。此勝任細胞無法儲存，故操 作完後直接進行白色念珠菌之轉形反應。 3.8.2 電穿孔（electroporation）(Köhler et al., 1997) 取欲轉形之線狀 DNA 片段 (～1 μg) 和 40 μl 勝任細胞於 1.5 ml 微量離 心管中，混合均勻置於冰上培養5 分鐘。之後將反應物移至 0.2 cm cuvette 中，進行電穿孔反應 (1.8 kV，6.1 ms) ，反應後迅速將 cuvette 置於冰上， 並加入1 ml 預冷過之 1 M sorbitol，混合均勻後移至新的 1.5 ml 微量離心 管。4 ℃低溫離心 800×g、5 分鐘，以 pipette 去上清液。加入 1 ml YPD 培養液後，30 ℃培養 1 小時、150 rpm。之後取 80～100 μl 菌液塗抹至篩 選培養基上 (nourseothricin：200 μg/ ml) (Werner Bioagents, Jena, Germany )，30℃培養兩天。

3.9 SAT1 flipper 之剔除（pop-out）

將篩選後之較大顆的菌落於 YPD 培養基上再劃出單一菌落。接種單一 菌落至YP＋Maltose 培養液中，30 ℃培養 3～7 天、150 rpm，即可剔除

SAT1 flipper。之後將一半菌液儲存於 4 ℃，以便於五日內劃出 replica plating 所需之 master plate；另一半菌液用以萃取 genomic DNA (gDNA)， 進行PCR 確認。

3.10 複製平皿培養法（replica plating）

將 master plate (YPD 培養基) 覆蓋於固定好之絨布上，輕壓培養基，將 絨布沾上菌落之後，再以不含篩選之培養基 (YPD 培養基) 及含篩選之 培養基 (Nou＋_{：200 μg/ ml) 依序覆蓋於絨布上。將 replica 後之培養基置} 於30 ℃培養一天，再比對含篩選及不含篩選之培養基上的菌落。如在不 含篩選之培養基上 (YPD 培養基) 有菌落生長，而在含篩選之培養基上 對應同一位置沒有生長菌落，應為SAT1 flipper 被剔除出基因體中。 3.11 白色念珠菌染色體 DNA 之萃取 本實驗中使用了兩種方法萃取白色念珠菌之 gDNA，方法一為製備一 般PCR 所需之 template；方法二為製備南方點墨法中所使用之 gDNA 和 rescued ENG1 PCR 中所需之 template，操作方法如下：

3.11.1方法一： 接種單一菌落至 5 ml YPD 培養液中，30 ℃培養 18～24 小時、150 rpm。 離心1,125×g、12 分鐘，去上清液。加入 200 μl breaking buffer，混合均 勻並移至1.5 ml 微量離心管中。將離心管置於 -80 ℃、2 分鐘，95 ℃、 1 分鐘；並重複 -80 ℃、2 分鐘，95 ℃、1 分鐘，vortex 震盪 30 秒，再 加入200 μl chloroform，vortex 震盪 2 分鐘至溶液變乳白色。將其離心 15,700×g、10 分鐘，取 200 μl 上清液至新的 1.5 ml 微量離心管中，加入 400 μl 99.9％酒精及 25 μl 3 M NaOAC，手搖均勻。將其置於 -20 ℃沉降 10 分鐘到 2 小時。4 ℃低溫離心 15,700×g、5 分鐘，去上清液。再加入

500 μl 70％酒精沖洗管壁沉澱物，4 ℃低溫離心 15,700×g、5 分鐘，以 pipette 去上清液。將微量離心管斜放靜置室溫下 20 分鐘，乾燥 pellet， 再以30 μl 無菌二次水溶解 DNA，置於 4 ℃回溶 12～18 小時。DNA 儲 存於 -20 ℃。 3.11.2 方法二： 接種單一菌落至 5 ml YPD 培養液中，30 ℃培養 18～24 小時、150 rpm。 離心1,125×g、12 分鐘，去上清液。加入 1 ml 無菌二次水懸浮菌體並移 至1.5 ml 微量離心管中。離心 15,700×g、10 分鐘，去上清液。加入 300 μl breaking buffer，vortex 震盪 5 分鐘。再加入 1/3 倍體積的玻璃珠，vortex 震盪5 分鐘。加入 3 μl (20 mg/ml) proteinase K、3 μl (10 mg/ml) RNase A， 置於37 ℃水浴槽中 1 小時反應。之後再加入 300 μl phenol，vortex 震盪 5 分鐘。加入 300 μl 1 X TE，vortex 震盪 5 分鐘。離心 15,700×g、10 分 鐘，小心取上清液至新的1.5 ml 微量離心管中，加入等量之 phenol，4 ℃ 低溫離心15,700×g、5 分鐘；取上清液至新的 1.5 ml 微量離心管中，加 入等量之phenol，4 ℃低溫離心 15,700×g、5 分鐘；取上清液至新的 1.5 ml 微量離心管中，加入2 倍體積之 99.9％酒精和 1/8 倍體積的 NaOAC，置 於 -20 ℃沉降 5～20 分鐘。4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，去上清液。 加入1 ml 75％酒精沖洗管壁沉澱物，4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘， 以pipette 去上清液。將微量離心管斜放靜置室溫下 20 分鐘，乾燥 pellet， 再以50 μl 無菌二次水溶解 DNA，置於 4 ℃回溶 12～18 小時。DNA 儲 存於 -20 ℃。 3.12 南方點墨法（Southern blot）

3.12.1 製備 DNA 探針 (DNA probe labeling)

Polymerase (5 U/μl) (NEB M0267S)、template DNA (約 10～100 ng)、10 X PCR buffer 5μl、50 μM 的引子各 1 μl、2.5 mM dNTPs mixture 2 μl、DIG (Roche 1277065) 2.5 μl，補二次無菌水至總體積 50 μl，置於 PCR 溫度控制儀進行聚合酶連鎖反應。以 DIG 標記欲合成之 DNA 片段，即 為DNA 探針，儲存於 -20 ℃。探針於進行雜交反應前，先置於 95 ℃加 熱10 分鐘後，迅速放置冰上 5 分鐘，即可進行雜交反應。

3.12.2 轉漬 DNA (DNA transfer)

將 Candida albicans 之 gDNA (10 μg～15μg) 以酵素 BsrGⅠ於 37 ℃反 應3 小時後，進行 50 伏特、0.7％ 洋菜膠電泳。將洋菜膠於現配之 EtBr (1 μg/ml) 中染色 20 分鐘，即可於電泳影像處理系統中照相。將洋菜膠置 於 50 ml Denaturation solution 中，平面震盪 50 rpm、15 分鐘。再以滅菌 過之二次水沖洗洋菜膠，平面震盪 50 rpm、5 分鐘。以上兩步驟重複一 次。再將洋菜膠置於 50 ml Neutralization solution 中，平面震盪 50 rpm、 15 分鐘。再以滅菌過之二次水沖洗洋菜膠，平面震盪 50 rpm、5 分鐘。 以上兩步驟重複一次。最後置於 10 X SSC 中，平面震盪 50 rpm、10 分 鐘。將以下材料依序架起來：長型 Whatman 3MM 濾紙 (可吸附到 10 X SSC)、3 張與膠體同大之 Whatman 3MM 濾紙、洋菜膠、中空投影片、與 膠體同大之耐龍膜 ( nylon membrane)、3 張 Whatman 3MM 濾紙、5 公分 平版衛生紙 (濾紙和耐龍膜先以 10 X SSC 完全浸泡過，時間勿太久) ， 以保鮮膜將裝置包覆起來以避免外物掉落，再於裝置最上層放置重物， 利用毛細現象將膠體中之DNA 轉漬到帶正電之耐龍膜上。經過 14 至 16 小時後，將耐龍膜取出，於雜交連結器中，利用UV 光 (254nm) 做 cross-link，將 DNA 固定於耐龍膜上，固定步驟重複兩次。將耐龍膜靜置 於室溫下至完全乾燥。 3.12.3 雜交反應 (hybridization)

將乾燥之耐龍膜置於 12 ml prehybridizaton buffer (Roche 11603558 001) 中，42 ℃、平面震盪 50 rpm、3 小時。再將耐龍膜移置 12 ml 含有標記 探針hybridization buffer 中 (探針濃度：50 ng/ml)，42 ℃、平面震盪 50 rpm、12～24 小時。 3.12.4 免疫偵測 (detection) 將耐龍膜移置 50 ml 的 2 X washing buffer 中，室溫下平面震盪 50 rpm、 20 分鐘。此步驟重複一次。再將耐龍膜於 50 ml 0.5 X washing buffer 中， 60 ℃下平面震盪 50 rpm、20 分鐘。之後移置新的 50 ml 0.5 X washing buffer 中，室溫下平面震盪 50 rpm、20 分鐘。此步驟重複一次。耐龍膜 移置於25 ml 的 1 X blocking buffer 室溫下平面震盪 50 rpm、30 分鐘。再 加入2.5 μl Anti-DIG-AP (Roche 1093274) 形成 antibody buffer，平面震盪 50 rpm、30 分鐘。之後再以 30 ml washing buffer 清洗耐龍膜，平面震盪 50 rpm、15 分鐘。此步驟重複一次。再以 30 ml detection buffer 平面震盪 耐龍膜5 分鐘，將耐龍膜置於投影片夾層中，以含有 10 μl CSPD (Roche 1655884) 之 1 ml detection buffer 均勻潤濕耐龍膜，於 37 ℃避光靜置 20 分鐘。之後於暗房中以X 光底片進行壓片，1 小時後進行底片沖洗動作 (develop buffer 中搖晃至底片有顯影，再將底片置於 fixer 中完全浸潤， 之後以清水沖洗一下即可)。

3.13 RNA 萃取 (RNA extraction)

接種單一菌落至 5 ml YPD 中，30 ℃培養 18～24 小時、150 rpm。隔日 取1.5 ml 菌液轉養至 36 ml 新鮮之 YPD 中，30 ℃培養至指數生長期 (mid-log phase)。將培養好之菌液分裝至 50 ml 離心管中，4 ℃低溫離心 1,620×g、5 分鐘，去上清液。加入 2 ml DEPC-treated H2O 懸浮菌體。將

入300 μl RIB (RNA isolation buffer) 懸浮菌體、加入 1/3 倍體積的玻璃珠 (Sigma G9268-500G)，低溫震盪 5 分鐘、再加入 300 μl phenol，低溫震盪 5 分鐘、重複加入 1/3 倍體積的玻璃珠，低溫震盪 5 分鐘、加入 500 μl RIB， 低溫震盪5 分鐘。4 ℃低溫離心 1,620×g、10 分鐘，取上清液至新的 1.5 ml 離心管 (DEPC-treated)，再 4 ℃低溫離心 15,700×g、5 分鐘，取上清液至 新的1.5 ml 離心管。加入等量之 phenol，震盪 30 秒。4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，取上清液至新的 1.5 ml 離心管。加入等量之 phenol， 震盪30 秒。4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，取上清液至新的 1.5 ml 離心管。加入1/8 倍體積之 2.5 M NaOAC 及 2.5 倍體積之 99.9％ 冰乙醇， 置於冰上30 分鐘 (或置 -20 ℃沉降 30～90 分鐘)。4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，以 pipet 去上清液。加入 1 ml 75％ 冰乙醇清洗沉澱 物，4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，以 pipet 去上清液。將 1.5 ml 微量 離心管斜放於室溫下至微乾狀態，再以50 μl DEPC-treated H2O 回溶 RNA。RNA 儲存於 -80 ℃。 3.14 RNA 電泳 3.14.1 RNA 電泳前處理

將 8～12 μg RNA、3.5 μl 10 X MOPS、5 μl 37％ formaldehyde、10 μl formamide、3 μl RNA dye 以及 1 μl 10 mg/liter EtBr 置於 1.5 ml 微量離心 管中，混合均勻。於65 ℃加熱 10 分鐘後迅速置於冰上 5 分鐘。 3.14.2 RNA 電泳 首先配製 1％洋菜膠：0.5 g agarose 於 36 ml DEPC-treated H2O 中微波 加熱溶解，稍冷後加入5 ml 10 X MOPS、9 ml 36.5％ formaldehyde 混合 均勻倒入製膠台中。將處理過之RNA 樣品注入至膠體之孔洞中，以 1 X MOPS 為電泳緩衝液，50 伏特電壓進行 RNA 電泳。電泳結束後，於電

泳影像處理系統照相。

3.15 反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR)

使用 SuperScriptTM One-Step RT-PCR with Platimun Taq (invitrogen 10928-042) 來進行 RT-PCR：25 μl 2 X Reaction Mix、1 μg RNA、10 μM sense primer (FN-F) 1 μl、10 μM anti-sense primer (FN-R) 1 μl、RT/

Platunum Taq Mix 0.75 μl，補二次無菌水至 50μl，再置於 PCR 溫度控制 儀進行反應。預計得到CaENG1 片段大小為 421 bp。 PCR 溫度控制儀的設定如下︰ RT-PCR 42～55 ℃ 15～30 分鐘 94 ℃ 2 分鐘 94 ℃ 15 秒 55~60 ℃ 30 秒 72 ℃ 1 分鐘/kb (重複 26 個循環) 72 ℃ 5～10 分鐘 4 ℃ 停止反應

Internal control 為 CaACT1，以 primer ACT1-F 及 ACT1-R 合成出 471bp 之片段。

RT-PCR 反應完成後以 0.8％洋菜膠電泳確認 RT-PCR 產物片段。

3.16 突變株之性狀分析 (characterization)

3.16.1 生長曲線之測定 (growth curve)

養至新鮮5 ml YPD 中，混合均勻使菌液此時 OD600吸光值為0.2。而後

將菌液置於30 ℃培養箱震盪培養 (150 rpm)。每隔兩小時取出 100 μl 之菌液稀釋十倍，測量其 OD600吸光值，連續紀錄觀察至24 小時。

3.16.2 芽管試驗 (germ tube assay)

將單一菌落接種至含 10％山羊血清之 YPD 培養液中，於 37 ℃培養五 小時後，於倒立式顯微鏡下觀察是否有芽管生成。

3.16.3 誘發菌絲生長觀察型態變化

將單一菌落接種至含適量山羊血清之培養基中，於 37 ℃下培養誘發其 菌絲生長，觀察突變株之型態變化及其和野生株型態之比較：

含有4％山羊血清之Bacto agar培養基 (Staab et al., 2003)

將單一菌落接種至含有4％山羊血清之Bacto agar培養基，於37 ℃中培養

七天後，置於倒立式顯微鏡下觀察其菌絲誘發之情形。 含有 4％山羊血清之YPD培養基

將單一菌落接種至含有 4％山羊血清之 YPD 培養基，於 37 ℃中培養三 天後，觀察菌落之型態變化。

3.16.4 侵犯力試驗 (invasion assay) (Navarro-Garcia et al., 1998)

將單一菌落接種至 solid Spider 培養基，於 37 ℃中培養七天後，以固 定水流量沖洗培養基，觀察是否有菌絲侵入培養基中，進而有菌落殘留 之現象。 3.17 細胞分裂之觀察 接種單一菌落至 5 ml YPD 中，30 ℃培養一天。取過夜培養細胞 400 μl 轉養至新鮮10 ml YPD 中，30 ℃震盪培養 (150 rpm) 三小時至 mid-log phase (OD600 吸光值為 0.4～0.6)。取 315 μl 菌液至 1.5 ml 微量離心管， 加入50 μl 之 36.5％ formaldehyde。離心 9,300×g、10 分鐘，去上清液。

以100 μl 1 X PBS 沖洗沉澱物，離心 9,300×g、10 分鐘，去上清液。1 X PBS 沖洗沉澱物重覆一次後，離心後去上清液，再以500 μl 1 X PBS 回溶細 胞。取5 μl 回溶之細胞於覆蓋 poly-lysine 之載玻片上，靜置 20 分鐘後， 以100 μl 1 X PBS 清洗兩次，於 50 ℃烘箱烘乾玻片。之後以 20 μl 之 1 mg/ml Calcofluor white (Fluka F3397) (355～433 nm) 染色五分鐘後，以 100 μl 1 X PBS 清洗五次，於 50 ℃烘箱烘乾玻片。再加入 20 μl 之 10％ potassium hydroxide，靜置一分鐘後，以 100 μl 1 X PBS 清洗，於 50 ℃烘 箱烘乾玻片。加入15 μl 甘油後，以蓋玻片封片。避光靜置一天即可以雷 射掃描式共軛焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscope) 觀察細胞 分裂之情形。 3.18 化學藥品感受性測試 接種單一菌落至 5 ml YPD 中，30 ℃培養一天。隔日取適量菌液至 10 ml YPD 中，使之 OD600吸光值為0.2 (OD600吸光值0.2 之細胞數約 2 × 106 /ml)。將 10 ml 菌液以 1,620×g 離心 10 分鐘，去上清液。以無菌二次水清 洗菌體後，離心後去上清液。加1 ml 1 X PBS 回溶菌體，並以此依序稀 釋十倍、百倍及千倍。將此四種不同濃度菌液各取5 μl 至 YPD 培養基， 30 ℃培養一天。將培養好之 master plate 經複製平皿培養法複製至含不同 化學藥品之YPD 培養基上，30 ℃培養一至兩天，觀察菌落生長之情形： 42 ℃(Nakagawa et al., 2003b)、1 M sorbitol (Heinisch et al., 1999)；pH 10； 2 mM hydroxyurea (Srikantha et al., 2006)；1 M、1.5 M NaCl (Chauhan et al., 2003)；2 M、2.5 M、3 M sorbitol (Nikolaou et al., 2009)；5 mM H2O2

(Chauhan et al., 2003)；50 mM、100 mM DTT (dithiothreitol) (Islam et al., 1999)；0.02％、0.1％ SDS (sodium dodecyl sulfate) (Nakagawa et al., 2003b)；0.15％ Triton X-100 (Thimmaraju et al., 2003; Nakagawa et al.,