依方法 3.17 將細胞培養至 mid-log phase，以 5％ formaldehyde 固定細 胞後，1 mg/ml Calcofluor white stain (Fluka F339) 染色細胞壁中之
chitin，以雷射掃描式共軛焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscope) 放大一千倍觀察細胞分裂之情形。如圖十八所示，白色箭頭標示為septum 之位置，septum 是細胞分裂中，母細胞 (mother cell) 和子細胞 (daughter cell) 之間的間隔構造，其富含細胞壁成分 chitin，故可清楚地以染劑 Calcofluor white stain 辨識。野生株 SC5314 之細胞呈橢圓形，其細胞分 裂之septum 可明顯辨別，以單顆細胞或分裂中之 2～3 顆細胞為主要細
胞分布情形；JKC19 (cph1/cph1) 和 HLC52 (efg1/efg1) 細胞型態和野生 株SC5314 相似，為橢圓形，且同樣為單顆細胞或分裂中之 2～3 顆細胞 分布。HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 細胞則為細長型，呈現單顆或兩顆細 胞分裂的型態。EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/
CaENG1::FRT) 細胞和野生株 SC5315 細胞型態相似，細胞分布為單顆及
2～3 顆細胞。EKG7 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 則有觀察到少數 4～5 顆細胞分裂不完全的現象，但此一現
象僅觀察到極少數，大部分細胞型態為單顆細胞或分裂中2～3 顆細胞的 分布，因此需對是否可以代表性狀上的差異存疑。4.9 CaENG1 各突變株於化學藥品感受性試驗之結果 (chemical susceptibility test)
依方法 3.18 將各菌株培養至細胞總數 2 × 107，再將菌體離心後以1 X PBS 回溶，依序十倍、百倍、千倍稀釋，各取 0.5 μl 至 YPD 培養基，30
℃培養一天，如此培養基上各菌株之細胞數依序為104、103、102及 10。
將培養好之master plate 經複製平皿培養法複製至含不同化學藥品之 YPD 培養基上，30 ℃培養一至兩天，觀察菌落生長之情形。培養於各種不同 化學品配製成的培養基，
CaENG1 各突變株之細胞和野生株 SC5314 之細
胞生長情形並沒有太大的差別。如圖十九，在熱感受實驗中，將細胞培 養於42 ℃一天，野生株 SC5314 之細胞和 CaENG1 各突變株之細胞生長 完好，並無顯著差異；強鹼環境培養下 (pH 10)，EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/CaENG1::FRT) 分別在細胞數 10 有
生長較少之趨勢，但與野生株SC5314 之細胞相比並無太大區別；於 1.5 M NaCl 之 YPD 培養基，各菌株在細胞數 102、10 之生長明顯趨緩，推測和 鹽濃度造成滲透壓改變相關；於0.1％ SDS 培養基上，各菌株有生長較少之趨勢，但相比則無明顯差別；在含200 μg/ml 細胞壁染劑 Congo red 之培養基上，各菌株之細胞數也成相同生長趨勢，細胞壁染劑並無對缺 少細胞壁相關基因
CaENG1 之突變株造成影響。而以其他化學藥品製成
之培養基，如Tween 20、sortibtol、DTT、hydroxyurea、H2O2、Calcofluor white stain (CFW)，也無造成 CaENG1 各突變株和野生株 SC5314 生長之 不同。4.10 確認 Caeng1 類接合型 (mating type like) 突變株 依照方法 3.19 培養野生株SC5314 及Caeng1 突變株EKP2
(Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 於YEPS培養基，由於培養基中山梨糖 (sorbose) 成分有一定的機率會使C. albicans在生長過程中缺失一條五號 染色體 (chromosome 5) (Janbon et al., 1998)，兩條五號染色體各含mating type like (MTL) 相關基因MTLa1、MTLa2 以及MTLα1、MTLα2 (Hull et al., 1999)。而移除sorbose後，C. albicans其中剩餘的一條五號染色體會進行 複製，形成homozygous a/a或α/α之突變株 (Janbon et al., 1998；Janbon et
al., 1999)，如附錄一所示。之後將YEPS培養基培養後之菌株，轉養至YPD
(a/α, CaENG1/CaENG1) 為對照組，可得a-type mating strains皆有偵測到 約6.5 kb大小之DNA，而α-type mating strains則無被偵測到MTLa1；如圖以
二十<B>，SC5314 (a/α, CaENG1/CaENG1) 為對照組，可得α-type mating strains皆有偵測到約 4.8 kb大小之DNA，而a-type mating strains則無被偵 測到MTLα1。符合南方點墨法檢驗結果之菌株，野生株SC5314 之類接合 型突變株命名為WT-1a、WT-2a、WT-3a (a/a, CaENG1/CaENG1)，WT-4α、
WT-5α、WT-6α (α/α, CaENG1/CaENG1)；而EKP2 之類接合型突變株則命 名為EKP2-1a、EKP2-3a、EKP2-4a、EKP2-5a、EKP2-6a (a/a,
Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 及EKP2-2α (α/α, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT
)。.11 Caeng1 類接合型 (mating type like) 突變株菌落型態之變化
之 YPD 培養基、37 ℃培
-5α、
B>，對照組 WT-4α、WT-5α、WT-6α (α/α, CaENG1/CaENG1) 4
4.11.1 於含有 4％ 山羊血清之 YPD 培養基 將各突變株之單一菌落培養至含 4％山羊血清
養三天，並觀察菌落型態之變化。以WT-1a、WT-2a、WT-3a (a/a,
CaENG1/CaENG1) 為 a-type mating strain 之對照組，而 WT-4α、WT
WT-6α (α/α, CaENG1/CaENG1) 為 α-type mating strain 之對照組。如圖二 十一<A>所示，對照組 WT-1a、WT-2a、WT-3a (a/a, CaENG1/CaENG1) 之 單一菌落的表面皆有皺摺產生，菌落外圍也不規則；而實驗組EKP2-1a、有皺摺之現象。 mating strain 之對照組，WT-4α (α/α, CaENG1/CaENG1) 為 α-type mating strain 之對照組。如圖二十二<A>所示，對照組 WT-1a 與實驗組 EKP2-1a、
EKP2-3a、EKP2-4a、EKP2-5a、EKP2-6a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) EKP2-2α (α/α, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 在 YPD 培養基上之單一菌落 也皆為光滑平整的表面；而在solid Spider 培養基上，WT-4α 和 EKP2-2α 之單一菌落也都呈現皺摺的狀態。
4
之結果 (chemical susceptibility test) 依方法3.18 將各菌株依序十倍稀釋之細胞
培養基上，30 ℃培養一至兩天，觀察菌落生長之情形。如圖二十三所示，
以WT-1a (a/a, CaENG1/CaENG1) 和 WT-4α (α/α, CaENG1/CaENG1) 各 為a-type mating strain 及 α-type mating strain 之對照組。於熱感受實驗中，
將細胞培養至42 ℃一天，EKP2-3a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 較 WT-1a (a/a, CaENG1/CaENG1) 在細胞數 104即有較少量的趨勢，而
EKP2-4a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 則和對照組沒有明顯差異；在 α-type mating strain 方面，EKP2-2α (α/α, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和對 照組WT-4α (α/α, CaENG1/CaENG1) 生長結果也相似。在鹼性環境培養 下 (pH 10)，各實驗組和其對照組相比，並無明顯生長之差異。而於 1.5 M NaCl 培養下，EKP2-3a 之生長可能較 WT-1a 少，EKP2-4a 則較對照組無 明顯區別。在0.1％ SDS 培養下，各菌株生長情況較差，且 α-type mating strain 生長情形較 a-type mating strain 差，而 EKP2-3a 在細胞數 104開始 則無生長趨勢，明顯和WT-1a 有落差；而在 0.02％ SDS 培養下和對照 組相比並無顯著差異，顯示EKP2-3a 對較高濃度之 SDS 有敏感性。在其 它化學藥品如Triton X-100、Tween 20、H2O2、DTT (dithiothreitol) 等之 反應上，各突變株與對照組相比無顯著差異。而在含細胞壁染劑CFW (Calcofluor white stain) 之培養基上，EKP2-3a 可能生長較對照組 WT-1a 少。
五、討論
承襲實驗室先前發表之論文指出 CaENG1 和 CaURA3 會影響白色念珠 菌菌絲的生成，剔除
CaENG1 降低同環境下細胞菌絲的生長；而營養性
篩選標記URA3 則會增加同環境下細胞菌絲的生長，此二者對菌絲生長
出現相反的誘因，故於結果判斷上顯得困難 (交大碩士論文 謝志豪, 2006)。而重新檢驗先前建構之 Caeng1 突變株、驗證營養性篩選標記影 響菌絲生長之程度，以及確認實驗流程之設計需耗費大量時間，故選擇 以非營養性篩選標記來重新剔除CaENG1，再觀察剔除後的結果是否與
先前之研究相符合，以求更進一步確認CaENG1 對白色念珠菌菌絲生成
之影響。本實驗選用抗藥性篩選標記 SAT1 flipper (Reuss et al., 2004)，排 除營養性篩選標記可能對白色念珠菌造成的影響，以探討剔除CaENG1
後，對白色念珠菌影響的結果。5.1 以抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 剔除 CaENG1 結果之探討
因白色念珠菌為雙倍體 (Edwards, 1990)，利用抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 可 pop-out 出基因體的特性，可重複使用此篩選標記做第二次白色 念珠菌轉形。相較於先前研究常使用之營養性篩選標記 (ARG4, HIS1,
URA3 marker) (Dennison et al., 2005)，需要在三種不同的篩選標記上建構
標的基因上下游相似序列，使用SAT1 flipper 剔除基因所花費之時間和精
力較少；其次以藥物nourseothricin 篩選帶有 SAT1 flipper 之菌株，會較 傳統以營養素篩選菌株的篩選能力更具敏感性；再者，由於白色念珠菌 轉形困難、沒有已知質體 (De Backer et al., 1999)，相較於使用一般傳統 白色念珠菌轉形方法得到少數轉形株 (transformants)，本實驗將結果 4.2.1 建構好之質體pSAT1-BA，以酵素切下帶有 SAT1 序列的片段後，以clean-up 取代膠上純化方式 (gel extraction)，依電穿孔方法送入白色念珠 菌，可得到多於四百顆轉形菌株數，推測因clean-up 會帶有多餘 DNA 片 段，其可能作用似carrier DNA，故可得到較高之轉形效率。
5.2 以南方點墨法及分析 RNA 表現量檢驗 Caeng1 突變株
將初步符合 PCR 結果之 CaENG1 突變株進一步以南方點墨法
(Southern blot) 檢驗，如圖十，wild-type CaENG1 allele 可偵測到約 7.6 kb 片段大小；
Caeng1 knock-out 且 SAT1 flipper 已 pop-out 之 allele 可偵測到
約4.2 kb 大小的片段；而為避免無法區分 CaENG1 rescued allele 和wild-type allele，則將 CaENG1 片段以 PCR 方式合成出來後，建構至帶 有
CaENG1 下游相似序列的 SAT1 flipper，故 rescued construct 送入白色
念珠菌並進行SAT1 flipper pop-out 後，rescued allele 會比 wild-type allele
多CaENG1 下游相似序列之片段長，如此可得約 8.0 kb 片段，而與
wild-type allele 的 7.6 kb 作區隔。將符合南方點墨法檢驗之 CaENG1 各突 變株分別命名為EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、EKG7 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)、EGR (Caeng1::FRT/
CaENG1::FRT)。
此後進行各突變株 RNA 表現量之分析，萃取各菌株的 RNA，以反轉 錄酶聚合鏈反應 (RT-PCR) 檢驗各突變株 CaENG1 基因表現的情形。如 圖十一，在EHK1 及 EGR 突變株均可觀察到 RT-PCR 預期的產物大小，
即表示EGR 此突變株之 rescued allele 可順利轉錄出 CaENG1 之 RNA；
而在雙套
Caeng1 knock-out 之突變株 EKG7 及 EKP2 皆無法偵測到 RNA
的表現量，與預期中 Caeng1 突變株建構一致。5.3 CaENG1 各突變株性狀分析之探討
5.3.1 生長曲線之探討
此實驗為比較 CaENG1 各突變株於相同環境條件培養下和對照組之生 長速率的差異。對照組為野生株SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、HLC52 (efg1/efg1) 及 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1)。由圖十二<A>可得知，在 YPD 培養液、30 ℃培養下，CaENG1 各突變株與野生株 SC5314 和 cph1 突變
及HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 呈現菌落外圍平整之酵母菌型態，無菌絲 (cph1/cph1) 生成表面皺摺之單一菌落；對照組 HLC52 (efg1/efg1) 及 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 呈現菌落表面圓滑、外圍平整之酵母菌型 態；而
CaENG1 各突變株在相同環境培養下，也皆出現表面皺摺、外圍
型態不規則之單一菌落，此結果與前述實驗結果相符，剔除CaENG1，
不影響白色念珠菌形成菌絲生長的能力。但與先前發表之論文的結果有 些許落差，文中提到在含4％山羊血清之 YPD 培養基中不額外添加營養 素的情形下，Caeng1 突變株 BAU2 (Caeng1::ARG4/Caeng1::URA3) 會生 成表面皺摺之單一菌落；而
Caeng1 突變株 BAH1-1 (Caeng1::ARG4/
Caeng1::HIS1) 則出現光滑平整之單一菌落，如額外添加 uridine 的情形
下，BAH1-1 之單一菌落分別出現兩種不同情形：一為菌落表面皺摺，一 為光滑平整 (交大碩士論文 謝志豪, 2006)。至此以營養篩選標記剔除CaENG1 和以抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 剔除 CaENG1 出現不同的性狀
結果，其建構突變株過程之差異除篩選標記可能會對白色念珠菌造成不 同的影響以外 (Lay et al., 1998)，所建構之菌株也不同，抗藥性篩選標記SAT1 flipper 是以野生株 SC5314 進行基因置換；而營養篩選標記需使用
於營養基因缺陷之菌株BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3) (Wilson etal., 1999)，又有研究指出 uridine 營養缺陷會致使白色念珠菌無毒性 (Cole
et al., 1995)，因此之後會以實驗先釐清是否為 BWP17 菌株本身為 uridine
補給所影響型態變化。5.3.4 侵犯力試驗之探討
將菌株培養至 solid Spider 培養基、37 ℃培養七天誘發白色念珠菌生長 菌絲侵入培養基，再以固定水流沖洗培養基，觀察菌落殘留之情形。如 圖十六，
CaENG1 各突變株與對照組野生株 SC5314 及 cph1 突變株 JKC19
均有菌絲生成並侵入培養基中；而對照組efg1 突變株 HLC52 及 HLC54
(cph1/cph1 efg1/efg1) 則無生長菌絲侵入培養基之能力。此結果也與前述 實驗結果相符，CaENG1 並沒有直接參與菌絲型態變化之過程。而在本 實驗室於2006 年發表之論文則記載將 Caeng1 突變株培養至 solid Spider 培養基中，不額外添加其它營養素的情形下，BAH1-1 (Caeng1::ARG4/Caeng1::HIS1) 菌落可被沖刷掉，BAU2 (Caeng1::ARG4/Caeng1::URA3)
情形則與野生株SC5314 相同，菌落無法被水流沖刷掉 (交大碩士論文 謝志豪, 2006)。此部分結果也與 2006 年發表之論文有出入，但由於 2006 年發表之論文於性狀分析實驗中所採用的對照組為野生株SC5314，而非 BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3)，故應重現對照組 BWP17 於相同 實驗條件下給予營養素uridine 與否之型態變化，再予以討論。5.4 營養素 uridine 影響營養基因缺陷野生株 BWP17 之結果探討
由圖十七<B>可見，於含 4％山羊血清之 YPD 培養基中，給予 uridine，
培養37 ℃三天誘發菌絲生長，BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3) 之 單一菌落有三種型態出現，分別為光滑之酵母菌型、菌落中間凹陷，有 初步皺摺情形以及菌落表面呈皺摺狀，菌落外圍不平整；而同樣生長條 件下，不給予uridine，BWP17 之單一菌落均為光滑表面。由此結果可得 知，與2006 發表之論文間的出入在於 BWP17 之型態變化受 uracil 生合
成影響，而當菌株無法自行合成uracil，且外界無補充營養素時，白色念 珠菌則失去毒性 (Cole et al., 1995)。故 2006 年論文發表之菌落型態變化 於含4％山羊血清的 YPD 培養基以及侵犯力試驗的結果中，以營養篩選 標記
ARG4 和 HIS1 剔除 CaENG1 之突變株會有菌絲生成能力下降的原
因，應為營養基因缺陷菌株BWP17 受 uracil 缺乏的影響，而非剔除成影響，而當菌株無法自行合成uracil，且外界無補充營養素時，白色念 珠菌則失去毒性 (Cole et al., 1995)。故 2006 年論文發表之菌落型態變化 於含4％山羊血清的 YPD 培養基以及侵犯力試驗的結果中，以營養篩選 標記