前言 - 探討剔除白色念珠菌ENG1之影響

白色念珠菌 (Candida albicans) 是雙倍體的真菌 (diploid fungus)，屬於 酵母菌 (yeast)，為人體中常見之共生菌，同時也是一種盛行率高的伺機性病原菌 (opportunistic pathogen) (Odds, 1988; Edmond et al., 1999;

Edwards, 2000)。在健康的人體中，白色念珠菌會伺機造成表面黏膜的感染，但在免疫功能不全之患者 (如化療患者、器官移植患者及愛滋病患者) 或接受侵入性治療之患者，白色念珠菌可造成嚴重的感染，如全身性念珠菌血症，致死率約高達三至五成 (Odds, 1988; Fisher-Hoch and Hutwagner, 1995; Vincent et al., 1998; Edmond et al., 1999; Kullberg and Filler, 2002)。

目前普遍使用之抗真菌藥物 (polyenes，如 amphotericin B; triazoles，如 itraconazole、fluconazole; imidazoles，如 miconazole) 因受限於其活性範圍、毒性或副作用等而效用下降 (Groll et al., 1998b; Jack, 1998)。而隨著目前增加抗真菌藥物之使用，抗藥性菌株的發生率也隨之增加 (Pfaller et

al., 2000; Vanden Bossche et al., 1994)。近年來由於抗藥性菌株產生，azoles

類等抗真菌藥物的治療效果已大幅下降 (De Backer et al., 2001)。感染白色念珠菌盛行率增加，但目前現有藥物的效用卻下降，如何克服白色念珠菌抗藥性及找到適合藥物標的以開發新穎抗真菌藥物，是目前重要的課題。

1.2 白色念珠菌型態變化 (morphogenesis) 與致病機轉 (pathogenesis) 之關聯

白色念珠菌是一種多形態的真菌 (polymorphic fungus)，可生成酵母菌

型 (yeast form)、假菌絲型 (pseudohyphae form) 和菌絲型 (hypae form)。

酵母菌型和菌絲型皆有在感染的組織中發現，因此推測這兩種型態可能在致病機轉 (pathogenesis) 中扮演重要的角色：型態上菌絲型跟假菌絲型具侵入性，在實驗環境培養下皆可侵入洋菜膠中，此特性則是促進白色念珠菌在感染宿主初期可以滲透組織；而酵母菌型則適合散播在血液中 (Sudbery et al., 2004)。白色念珠菌由單一酵母菌細胞形成假菌絲狀或菌絲狀，其病原性 (pathogenicity) 可被血清或巨噬細胞 (macrophage) 誘發 (Shepherd et al., 1980; Dabrowa and Howard, 1981)。而在實驗環境培養

下，例如額外添加血清以及培養在37℃，也可誘發菌絲的生長，由酵母較簡單之white-opaque 型態轉變 (Miller and Johnson, 2002)；white 細胞為一般橢圓形平滑之酵母菌形態，opaque 細胞則為兩倍 white 細胞長之橢圓形，且細胞壁表面有不規則小突出，而opaque 細胞較容易進行接合 (mating) (Miller and Johnson, 2002)。White-opaque 型態轉換對白色念珠菌於哺乳類宿主中的致病機轉相關 (Gow, 2002; Johnson, 2003; Magee and Magee, 2004; Soll, 2004)。

研究指出降低白色念珠菌

EFG1 之表現可抑制菌絲的形成，但血清仍

可誘發其生成假菌絲 (Stoldt et al., 1997)；而突變 EFG1 影響菌絲生成並降低白色念珠菌對小鼠之毒性 (virulence) (Lo et al., 1997)。此外，白色

念珠菌雙突變株HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 則失去了在血清誘發下形 成菌絲的能力，且以此雙突變株感染小鼠，小鼠死亡率大幅降低，證明雙突變株HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 不會造成毒性 (avirulent) (Lo et

al., 1997)。因此，白色念珠菌雙型態現象 (dimorphism) 至少有兩種途徑

調控：一為MAPK (mitogen-activated protein kinase) 途徑調控的轉錄因子 Cph1p；二為 cylic AMP protein kinase A 途徑調控的轉錄因子 Efg1p (Lengeler et al., 2000)。受此二轉錄因子調控之下游基因，有哪些具有影 響型態變化的能力且如何影響，都為可進行研究之方向。

而另一方面，主要負向調控白色念珠菌型態變化為Tup1p，此蛋白質可抑制菌絲的生長 (Braun and Johnson, 1997)，而研究指出其它基因產物，如Nrg1p、Rfg1p 或 Mig1p，可與 Tup1p 形成 DNA-binding protein 以抑制基因的表現 (Kaneko et al., 2006; Sprague et al., 2000)。剔除 TUP1 使得白色念珠菌無法形成酵母菌型，而固定在菌絲型態 (Braun and Johnson, 1997)，此負向調控型態變化的基因剔除後，更影響了白色念珠菌近三分之ㄧ的基因表現 (Murad et al., 2001a; Murad et al., 2001b)，也降低突變株對老鼠的毒性。其它研究也指出，白色念珠菌

spt3 雙套突變株為高度菌

絲狀的表現型，即使在不誘發菌絲生長的環境下，spt3 雙套突變株依然生長菌絲；以此突變株感染小鼠亦無造成毒性 (Laprade et al., 2002)。白色念珠菌

SPT3 在大多數酵母菌及其它真核類生物，如人類皆有保存相似

DNA 序列 (Madison and Winston 1998; Ogryzko et al., 1998; Yu et al., 1998)，故也非為理想藥物標的之基因。

影響白色念珠菌型態變化的基因，部分研究發現同時也影響其毒性，

如剔除

CPH1 和 EFG1 之菌株，無法表現菌絲型，此菌株對小鼠不會造

成毒性 (Lo et al., 1997)；而剔除 TUP1 或 SPT3 之菌株則大量表現菌絲型態，失去形成酵母菌型之能力，這些突變株也不會對小鼠造成毒性 (Braun

and Johnson, 1997; Laprade et al., 2002)。因此研究認為白色念珠菌雙型態 的變化和其致病力相關 (Saville et al., 2003)；而型態轉換之能力被認為對於白色念珠菌之毒性是重要的 (Cutler, 1991)。

1.3 白色念珠菌之細胞壁相關研究

白色念珠菌細胞壁為細胞最外層之結構，和細胞生長及分裂有密切相關，並具在不同滲透壓下使細胞維持完整、黏附宿主等功能 (Cid et al., 1995)，同時細胞壁也是病原菌和宿主細胞最初的接觸點 (Groll et al., 1998a)。此外，哺乳類動物的細胞缺少細胞壁，因此這層結構也許適合作為研發抗真菌藥物 (antifungal drugs) 之標的位置 (Odds, 2003; Gimeno

et al., 1992; Liu et al., 1994)。而研究細胞壁的結構、組成和一些未知的細

胞壁蛋白質之功能，可促成更進一步了解細胞壁在型態變化和致病機轉上參與的過程，以及開發新穎的抗真菌治療法 (Martinez-Lopez et al., 2004)。

1.3.1 細胞壁之組成

白色念珠菌細胞壁主要包含碳水化合物、蛋白質 (6～25％) 及脂質 (1

～7％)。其中主要多醣體為三種結構：1,3-β-glucan 和 1,6-β-glucan (50～

60％)、mannoproteins (15～22％)，以及 chitin (0.6～9％) (Calderone and Braun , 1991; Chaffin et al., 1998)。而白色念珠菌細胞壁的組成和啤酒酵 母菌 (Saccharomyces cerevisiae) 的組成很相似，1,3-β-glucans 則是真菌細胞壁中主要的成分之一 (Klis et al., 2001; Cid et al., 1995;Mouyna et al., 2002 )。而已有文獻認為，細胞壁中的 β-glucans 經由內生性的 β-glucanases 水解，可能是發生於一些型態變化的過程中，例如出芽 (budding)、細胞壁生長、接合作用 (conjugation) 等 (Cid et al., 1995; Nombela et al., 1988)。

1.3.2 β-glucan 與型態變化及引發宿主免疫機轉之研究

在型態的變化上，芽管 (germ tube) 為白色念珠菌由酵母菌型態轉為菌絲的初期過渡型態 (Odds, 1988)，當芽管生成時，β-glucans 中 1,3-β 鍵結的含量由30～39％提升至 67％，1,6-β 鍵結的含量由 43～53％降低至 14

％ (Ruiz-Herrera et al., 2006)。而細胞分裂時 (cell separation)，母細胞 (mother cell) 與子細胞 (daughter cell) 之間有一中隔 (septum)，此組織由三層構造組成：中心的初級中隔 (primary septum)，主要包含線性 1,3-β- glucan 以及中心外圍兩層次級中隔 (secondary septa)，為 1,3-β-glucan、

1,6-β-glucan 構成 (Humbel et al., 2001)。細胞分裂需要分解初級中隔，子 細胞才能變成兩個獨立之個體 (Martín-Cuadrado et al., 2003)。

而在引發宿主免疫機轉方面相關研究指出，當白色念珠菌被巨噬細胞吞噬後，野生株可被誘發生成菌絲，最終殺死巨噬細胞，而菌絲型態也可躲避宿主免疫細胞之作用;酵母菌型態則為在宿主組織內增生的形式 (Gow, 1997; Mitchell, 1998)。因此菌絲型態被認為提供了白色念珠菌對於哺乳類免疫系統相互作用的好處 (Lo et al., 1997; Calderone and Fonzi, 2001; Saville et al., 2003)。而細胞壁成分對於宿主的免疫防禦系統也有免 疫調節的作用，如細胞壁中含量最多的β-glucan 會抑制人類單核球 (monocytes) 釋放細胞激素 (cytokine)，可因而避免引發後續之免疫反應 (Nakagawa et al., 2003a)。

在人體中Dectin-1 為一接受體 (receptor)，廣泛表現於吞噬細胞 (phagocytes)，如巨噬細胞或樹突細胞，此接受體辨別真菌細胞壁上之 β-glucan，進而引起免疫反應 (Brown and Gordon, 2003)。2005 年研究中發現，Dectin-1 能辨別白色念珠菌酵母菌型態中的 β-glucan，而菌絲型態細胞則因在細胞分裂時不會產生bud scars，所以不會暴露出 β-glucan，因此Dectin-1 無法辨識菌絲型態的細胞而引起免疫反應 (Odd, 1988;

Gantner et al., 2005)。近年來已研究出一些單株或融合之抗真菌的抗體 (antifungal antibodies)，可提供對抗真菌感染之預防，當中有一些抗真菌之抗體可藉由阻斷病原菌致病因子而提供保護作用 (De Bernardis et al., 2007; Vilanova et al., 2004; De Bernardis et al., 2002 )。研究指出藉由抗 β-glucan 抗體的保護，可抑制白色念珠菌之生長及附著力 (Torosantucci et

al., 2009)。

起院內感染 (Andes et al., 2004)。已生長成熟之生物膜 (mature biofilm) 與剛開始形成的浮游狀細胞 (planktonic cells) 相比，抗藥性可高達一千倍 (Lewis et al., 2002; Mukherjee et al., 2003)。

白色念珠菌之生物膜也具有抗藥性，如抗amphotericin B 和 triazoles (Ramage et al., 2001; Ramage et al., 2002)。研究證實生物膜中細胞壁主要 成分為1,3-β-glucan，成熟的生物膜細胞較浮游狀細胞含較高 1,3-β- glucan 的含量；而加入 1,3-β-glucanase，則提高抗真菌藥物 fluconazole 和amphotericin B 對生物膜的效用。推測可能因 1,3-β-glucan 和抗真菌藥物相互作用，而抑制藥物穿透，而經由1,3-β-glucanase 降解後則減少抑制藥物穿透的現象；另一推測為細胞壁成份含量改變，以致無法保護生物膜細胞抵抗外在的抗真菌藥物 (Nett et al., 2007)。

1.3.4 白色念珠菌中與 1,3-β-glucanase 相關之基因

細胞壁成分 1,3-β-glucan 是由 1,3-β-glucan synthase 所合成，而由

1,3-β-glucanases 所降解 (Adams, 2004; Chaffin et al., 1998)。CaGsl1p 為 1,3-β-glucan synthase，此基因為白色念珠菌生存所必需，故無法剔除

CaGSL1 以進行研究 (Mio et al., 1997)。而與 1,3-β-glucanase 相關基因有

轉譯出酵素exo-1,3-β-glucanases 的 CaEXG1、CaEXG2、CaSPR1，和轉 譯出endo-1,3-β-glucanase 的 CaENG1 (又稱 DSE4)、CaENG2 (在 S.

cerevisiae 中的 homolog 為 ACF2)，如表一所示，比對白色念珠菌中與 CaENG1 轉譯出之胺基酸序列相似度較高的基因則為 CaENG2。

白色念珠菌有關exo-1,3-β-glucanases 之研究可追溯至 1984 年，近年來多篇研究此蛋白質之發表，對於相關基因已有深入的了解；CaEXG1 為主要轉譯exo-1,3-β-glucanases 的基因，CaExg1p 並不為白色念珠菌生長所必需，剔除

CaEXG1 不會對白色念珠菌造成型態變化上的差異，然而 Caexg1 突變株會增加對 chitin 和 glucan 合成抑制劑的感受性 (Ram et al.,

1984; González et al., 1997)。

而關於白色念珠菌 endo-1,3-β-glucanase 之研究相對較少，僅有 2005 年對於

CaENG1 之研究，提到 CaEng1p 功能和啤酒酵母菌 Eng1p 功能相似，

並與細胞分裂相關 (Esteban et al., 2005)；以及文獻提到 CaENG2 基因表現對於生物膜生成並無影響 (Murillo et al., 2005)。

1.4 ENG1 之相關研究

1.4.1 CaENG1 之相關研究

白色念珠菌 CaENG1 蛋白質產物為 endo-1,3-β-glucanase，此對偶基因 分別位於Contig19-10163 的 orf19.3066 (3438 bp, 1145 amino acids) 和 Contig19-20163 的 orf19.10584 (3441 bp, 1146 amino acids) (Candida Genome Database; Esteban et al., 2005)。CaEng1p 可在啤酒酵母菌中表 現，並補償啤酒酵母菌

eng1 突變株分裂缺陷的情況 (Esteban et al.,

2005)。CaEng1p 有一段大約 700 個胺基酸之區域，和 ScEng1p 相似 (P437 至A1136)，為高度保留，此區域特徵屬於 GH81 (glycosyl hydrolases family 81) 家族，此家族之蛋白質皆擁有大約 650 個胺基酸之區域，其中包含可能具催化能力的部份 (Martín-Cuadrado et al, 2008)；GHF81 當中有些酵素高度專一於1,3-β 鍵結，具有以內部水解模式降解 glucans 之特色 (Esteban et al., 2005; Baladrón et al., 2002; Martín-Cuadrado et al., 2003;

Mouyna et al., 2002; Coutinho et al., 1999)。

而文獻發表

CaENG1 與 CaCHT2 (轉譯出 chitinase) 之轉錄皆和細胞分

裂過程有關，並在酵母菌型態至菌絲型態轉變期間，二者表現量皆下降，

說明二者之酵素活性在型態轉變過程中是被抑制的 (Esteban et al., 2005;

McCreath et al., 1995)。而白色念珠菌 CDC14 可轉譯出蛋白質磷酸酯酶 (protein phosphatase)，可負向調控 B 型細胞週期蛋白 (B-type cyclcins)，

而細胞週期蛋白則可能影響菌絲型態；剔除

CDC14 導致嚴重細胞分裂的

缺陷，而

cdc14 突變株中，和細胞壁相關基因 CHT3 (轉譯出 chitinase)、

CaENG1、DSE1 (預測其基因產物為細胞壁蛋白質) 表現量皆顯著下降

(Clemente-Blanco et al., 2006)。文獻也指出 Sep7p 為 septin，野生株侵入 性生長所必須，當剔除

SEP7 後，抑制了誘發白色念珠菌菌絲生長時的細

胞分裂，而其

sep7 突變株中，CaENG1、DSE1 及轉錄因子 ACE2 之表現

量皆上升 (González-Novo et al., 2008)。

1.4.2 高同源性物種之 ENG1 相關研究

不同物種中

ENG1 之研究，在啤酒酵母菌 (S. cerevisiae) 和裂殖酵母

(Schizosaccharomyces pombe) 的 endo-1,3-β-glucanases 屬於醣基水解酶 (glycosyl hydrolases) 家族 81 (family 81, GH81)，皆發表與細胞分裂有關，剔除

ENG1 會造成細胞分裂的缺陷 (Baladrón et al., 2002; Martín-

Cuadrado et al., 2003; Coutinho et al., 1999)。

在啤酒酵母菌 (S. cerevisiae) 中，比對出其 Eng1p 和 CaEng1p 在保留 區 (conserved region) 有高達 54％同源性 (identity)，而啤酒酵母菌 ENG1 的轉錄只表現在營養性細胞中 (vegetative cells)，在孢子繁殖 (sporulation) 過程中表現量則顯著下降以致無法被偵測 (Baladrón et al., 2002)。而啤酒酵母菌有一轉錄因子

ACE2 也可活化及轉譯出和 endo-1,3-

β-glucanases 相同功能之蛋白質，研究發現 ace2 突變株中，偵測不到 ENG1 和

CTS1 (轉譯出 chitinase) 基因之表現，故認為 ENG1 轉錄需要 Ace2p，

且此現象與

CTS1 相似 (Baladrón et al., 2002; Doolin et al., 2001)。

在裂殖酵母 (S. pombe)中，Eng1p 則參與了初級中隔 (primary septum) 裂解的過程 (Martín-Cuadrado et al., 2003)。而在煙麴菌 (Aspergillus

fumigatus) 中，缺少 ENG1 轉譯之蛋白質並無造成明顯不同的表現型

(phenotype) (Mouyna et al., 2002)。

1.5 CaENG1 與 MTL 基因 (mating type like) 之研究

白色念珠菌目前尚未發現有性生殖，雖然近來研究發現白色念珠菌可進行接合作用 (mating) 以及無性生殖周期 (parasexual cycle)，但並不能進行減數分裂 (meiosis) (Hull et al., 2000; Tzung et al., 2001; Bennett and Johnson, 2003; Forche et al., 2008)。白色念珠菌雖然可經由增加 mating type locus 之變異而誘發其進行接合 (Magee and Magee, 2000; Hull et al., 2000)，但在正常生長下，極少機率進行 mating，故其基因雜交 (genetic crosses) 極具困難 (De Backer et al., 2001)。

誘發白色念珠菌進行接合作用，首先需將白色念珠菌由a/α 型態細胞

在文檔中探討剔除白色念珠菌ENG1之影響 (頁 16-0)