以 SAT1 flipper 作為剔除 CaENG1 之篩選標記，觀察於 C. albicans 中，
缺少
CaENG1 此基因所造成之影響。
如圖一<A>所示，將CaENG1 上游 602 bp片段 (以下稱之A region) 及 下游362 bp片段 (以下稱之B region) 分別以限制酶KpnⅠ、XhoⅠ和Not Ι、SacⅡ作用後建構至帶有SAT1 flipper之質體pSFS2 上 (Reuss et al., 2004)，形成質體pSAT1-BA。將pSAT1-BA以限制酶KpnⅠ及SacⅡ作用 後，經白色念珠菌轉形反應 (C. albicans transformation) 送入白色念珠 菌，進行同源重組置換 (homologous recombination)，剔除單套之
CaENG1，並以藥物nourseothricin (200 μg/ml) 於YPD培養基篩選，形成 CaENG1 突變株 (CaENG1/Caeng1::SAT1)，如圖一<B>所示。
以 PCR 做初步確認之突變株經由 2％ maltose 培養液進行 SAT1 flipper 之pop-out，之後再由複製平皿培養法 (reaplica plating) 篩選 SAT1 flipper 被pop-out 之菌株，最後以 PCR 做重複檢驗。所得單套 CaENG1 剔除之 突變株 (heterozygous knock-out strain) (CaENG1/Caeng1::FRT)，命名為 EHK1，為圖一<C>所示。重複將質體 pSAT1-BA 經限制酶 KpnⅠ及 SacⅡ 作用後送入
CaENG1 heterozygous strain，剔除另一單套 CaENG1 並重複
上述檢驗流程後，得到雙套Caeng1 剔除之突變株 (homozygous knock-out
strain) (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)，命名為 EKG7、EKP2，如圖一<D>所示。圖一<E>為建構 CaENG1 補償 (rescue) 之突變株。以 PCR 方式合 成
CaENG1 上游 A region 至下游 B region 之 DNA 片段 (約 4.4 kb)。將此
DNA 片段以限制酶 KpnⅠ、XhoⅠ作用後接合至質體 pSAT1-B 上，經定 序確認ENG1 序列而得質體 pRes 20。以 KpnⅠ及 Sac Ⅱ作用 pRes 20 後，
送入
Caeng1 homozygous knock-out 突變株，經同源重組置換得到 CaENG1 rescued 突變株，命名為 EGR (Caeng1::FRT/CaENG1::FRT)。
4.2 建構 CaENG1 單套、雙套基因剔除之突變株 (heterozygous knock-out strain、homozygous knock-out strain)
4.2.1 建構含篩選標記及 CaENG1 上下游同源區域之質體
利用PCR方式，依方法 3.2.1，以引子ENG1B-F及ENG1B-R得到CaENG1 下游約362 bp DNA片段，稱之B region，引子兩端各帶有限制酶NotΙ、
SacⅡ之切位。以限制酶NotΙ、SacⅡ分別作用PCR產物B region及帶有 SAT1 flipper之質體pSFS2 (Reuss et al., 2004) 後，進行接合反應
(ligation)，所得之產物以方法 3.6 進行轉形選殖，經由限制酶確認後而得 質體pSAT1-B。同樣再以PCR方式、引子 ENG1A-F及ENG1A-R得到
CaENG1 上游約 602 bp之DNA片段，稱之A region，引子兩端各帶有限制
酶KpnⅠ、XhoⅠ之切位。將PCR產物A region和質體pSAT1-B分別以限制 酶KpnⅠ、XhoⅠ作用後，進行接合反應，經過轉形選殖後得到帶有A、B region之質體。如圖二<A>所示，以限制酶BsrGΙ、BstXΙ作用，所得片 段大小預計約為7.2 kb及 815 bp，Lane 1、3、5 符合預期。將初步符合預 期之選殖株再以限制酶BspEΙ、NotΙ做雙重確認，預計所得片段大小約 為4.3 及 3.7 kb，如圖二<B>。符合雙重確認之質體即命名為pSAT1-BA。質體SAT1-BA以限制酶KpnⅠ、SacⅡ作用後，經clean-up純化DNA並去除 酵素及鹽類，則可將DNA片段進行白色念珠菌轉形作用 (C. albicans transformation)。
4.2.2 確認 CaENG1 單套基因之剔除 (heterozygous knock-out) 將上述處理過pSAT1-BA之片段經由電穿孔於野生株SC5314 進行白色 念珠菌轉形 (Köhler et al., 1997)，初步以藥物nourseothricin篩選帶有SAT1
flipper之菌株，約可得到 400 顆以上之菌落。再挑選其中較大顆菌落，給 予maltose培養，使其進行SAT1 flipper pop-out，並萃取gDNA以PCR確認。
如圖三<A>，設計引子 pENG1A-F和ENG1B-R以確認Ca
ENG1 剔除之 allele，設計 forward primer 於 CaENG1 上游是為確保同源
重組置換發生於白色念珠菌之genome 正確的位置上。此外以引子 ENG1 -3650-F 和 ENG1B-R 確認 CaENG1 wild type 之 allele；而 non-popout 之 菌株以引子 pENG1A-F 和 SAT1-860-R 確認。圖三<B>為 CaENG1 單套 基因剔除之PCR 結果，預計 PCR 產物片段大小約為 1.1 kb。Lane 1、2、5、6、10 符合預期，上述初步確認之菌株再進行 replica plating。圖三<C>
為另一條
CaENG1 wild type allele 之 PCR 結果，預計片段大小約為 1 kb。
而圖三<D>為 SAT1 flipper 之 PCR 結果，除了表示圖三<B>中無 PCR 產 物之菌株 (Lane 4、7) 為 SAT1 flipper non-popout 外，也可證明 SAT1 flipper 曾經進入白色念珠菌之genome 中，進而被 pop-out 出 genome。圖四<A>
表將PCR 初步確認之 heterozygous knock-out strain，再以 replica plating 驗證，挑選replica 後於 YPD 培養基上有生長，相對位置之 YPD/Nou+培 養基上無生長之菌落，再次以PCR 做雙重確認，如圖四<B>所示。
4.2.3 確認 Caeng1 雙套基因之剔除 (homozygous knock-out)
將前述處理過 pSAT1-BA 之片段經由電穿孔送入 CaENG1 heterozygous knock-out strain 進行白色念珠菌轉形。初步以藥物 nourseothricin 篩選帶 有
SAT1 flipper 之菌株，依然約可得到 400 顆以上之菌落。挑選其中較大
顆菌落，給予maltose 培養，使其進行 SAT1 flipper pop-out，並萃取 gDNA 以PCR 確認。因第二次送入 pSAT1-BA 之 DNA 片段進行同源重組置換，其正確置換於第二條
CaENG1 wild type allele 的機率較低，故先以引子
ENG1-3650-F 和 ENG1B-R 確認 CaENG1，如有得到約 1 kb 片段大小，則表示無剔除
CaENG1 雙套基因，如圖五<B>所示。將 PCR 確認沒有
CaENG1 之菌株再以引子 pENG1A-F 和 ENG1B-R 檢驗，得到預期片段
大小1.1 kb，證明剔除 CaENG1，如圖五<C>所示。此後再進行 replica plating，如圖六<A>，挑選 replica 後於 YPD 培養基上有生長，相對位置 之YPD/Nou+培養基上無生長之菌落，再次以引子pENG1A-F 和 ENG1B-R 做PCR 雙重確認，如圖六<B>所示。4.3 建構 CaENG1 補償之突變株 (CaENG1 rescued strain) 4.3.1 建構含 CaENG1 open reading frame (ORF) 之質體
如圖七<A>，利用 PCR 方式，依方法 3.2.2，以引子 ResA-F 及 ResB-R 進行PCR 合成出包含 CaENG1 上游 A region、CaENG1 ORF 至下游 B region 約 4.4 kb 大小的 DNA 片段，以 0.8％洋菜膠電泳確認 PCR 產物大 小。引子兩端各帶有限制酶
KpnⅠ、XhoⅠ之切位，將此 PCR 產物和質
體pSAT1-B 分別以限制酶 KpnⅠ、XhoⅠ作用後，進行接合反應 (此設計 為rescued allele 將比 wild type allele 多一 362 bp 的 B region 片段，可以 用來區隔彼此間之差異)，經過轉形選殖後，萃取其質體 DNA 做進一步 限制酶確認。圖七<B>，以限制酶 BsrGⅠ、BstXⅠ作用於上述之質體 DNA，所得預期片段大小約為 7.2 kb、2.5 kb、2.2 kb。如圖七<C>，將初 步符合限制酶檢驗結果之質體再以限制酶HindⅢ作用，預期片段大小約
為 6.8 kb、3.2 kb、1.9 kb。確認無誤之質體再進行 CaENG1 序列分析。4.3.2 CaENG1 open reading frame (ORF) 序列分析
以 PCR 合成 CaENG1 之 ORF 作補償之功能，故需以定序方式確認合 成之
CaENG1 的序列無誤。如圖八<A>，設計引子 DSR1、DSR2、DS3
～7 以進行定序分析。圖八<B>為定序結果，以 Candida Genome Database (CGD) 上之序列 ENG1 (orf19.3066) 作為比對之樣本。比對結果至核苷 酸2796 (nucleotide, nt) 皆無誤，而在 nt 2797 位置有 C→T 之突變，nt 2863
位置有T→C 之突變 (C，cytosin 胞嘧啶、T，thymine 胸嘧啶)，而其轉 譯出之胺基酸仍不變，分別為麩胺酸 (Asp) 及甘胺酸 (Gly)。合成的
CaENG1 序列轉譯出之胺基酸不改變，故其存在正常蛋白質功能。將此
以限制酶檢驗、定序確認之質體命名為pRes 20。4.3.3 確認 CaENG1 補償之突變株 (rescued strain)
將質體 pRes 20 以限制酶 KpnⅠ、SacⅡ作用後，經 clean-up 去除酵素 及鹽類，將片段DNA 進行白色念珠菌轉形作用送入 Caeng1 雙套剔除之 突變株。初步以藥物nourseothricin 篩選帶有 SAT1 flipper 之菌株，再挑 選其中較大顆菌落，給予maltose 培養，使其進行 SAT1 flipper pop-out，
並萃取gDNA 以 PCR 確認。如圖九<A>，以引子 ENG1-3650-F 及
ENG1OB-R 進行 PCR，得到預期片段大小約為 1.7 kb。如果是 CaENG1 wild type 之 allele，將會得到片段約 1.3 kb (因 rescued allele 多一 B region)、Caeng1 剔除之 allele 則不會得到 PCR 產物，將圖九<A>之 DNA 電泳圖中符合預期 PCR 結果之 strain 再進行 replica plating。圖九<B>，
挑選 replica 後於 YPD 培養基上有生長，相對位置之 YPD/Nou+培養基上 無生長之菌落，再次以引子ENG1-3650-F 及 ENG1OB-R 做 PCR 雙重檢 驗，如圖九<C>所示。
4.4 南方點墨法檢驗 CaENG1 各突變株 (Southern blot)
依方法 3.11.2 萃取各突變株之 gDNA，再依 3.12 進行南方點墨法分析。
以A region 作為 probe，限制酶 BsrGⅠ作用於 gDNA，經雜交、免疫偵測 後，如圖十，預計
CaENG1 wild type allele 片段偵測到約 7.6 kb、CaENG1
rescued allele 片段約 8 kb、Caeng1 knock-out allele 片段約 4.2 kb。結果顯 示SC5314 (wild type) 有符合預期片段大小 7.6 kb；EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT) 則有符合片段 7.6 kb 及 4.2 kb；EKG7 和 EKP2 均為 Caeng1
homozygous knock-out strain (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)，符合預期片段 4.2 kb；EGR 為 CaENG1 rescued strain (Caeng1::FRT/
CaENG1::FRT)，符合預期片段 8 kb 和 4.2 kb。
4.5 反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) 檢驗 CaENG1 各突變株
依方法 3.13、3.14 萃取各突變株之 RNA 並以 0.8％洋菜膠電泳確認 RNA 品質。再依方法3.15 進行反轉錄聚合酶連鎖反應，檢驗各突變株之
CaENG1 基因有無表現。
CaENG1 的 mRNA 大小約為 3438 bp，如圖十一，設計引子 FN-F、
FN-R，合成出約 421 bp 之片段；internal control 為 CaACT1，以引子 ACT1-F、ACT1-R 得到約 471 bp 之 RT-PCR 產物。如圖所示，SC5314 (wild type) 為對照組，有預期 421 bp 之片段大小；EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT) 也有
CaENG1 基因表現之結果；而 Caeng1 雙套突變株 EKG7 及 EKP2
(Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 之 mRNA 則無 CaENG1 基因之表現；而 EGR (Caeng1::FRT/CaENG1::FRT) 也有得到預期片段大小 421 bp。此結果與 預期CaENG1 剔除 (knock-out) 及補償 (rescue) 之突變株的建構相符
合。4.6 CaENG1 各突變株之性狀分析
4.6.1 CaENG1 各突變株之生長曲線 (growth curve)
將 CaENG1 各突變株與對照組野生株 SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、
HLC52 (efg1/efg1) 及 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 比較其生長曲線之差 異。圖十二為比較各菌株於YPD 培養液中轉養 0～24 小時之生長曲線 圖，圖十二<A>為各菌株之生長曲線，其中突變株 HLC54 (cph1/cph1
efg1/efg1) 及 HLC52 (efg1/efg1) 之生長較野生株 SC5314 緩慢，而結果顯
示
CaENG1 各突變株與野生株 SC5314 之生長成同趨勢，但 EKG7 和
EKP2 於培養 16 小時後細胞數和野生株 SC5314 及 cph1 突變株 JKC19 相 比有較少的現象 (OD600為0.55、0.532、0.603、0.627 )，不過於培養 18 小時後，Caeng1 突變株 EKG7 細胞數趨向野生株 SC5314，而 Caeng1 突 變株EKP2 至培養 24 小時後細胞數仍少於野生株 SC5314 (OD600為 0.628、0.68 )，但是彼此間的差異性不大。圖十二<B>為取各菌株 OD600 吸光值之對數而成的生長曲線，各菌株於生長八小時後開始趨緩，而長 時間培養後也可達到相似之對數值。以培養4 小時至 6 小時之吸光值計 算對照組與CaENG1 各突變株的細胞倍增時間 (doubling time)：野生株
SC5314 的倍增時間為 1.98 小時，突變株 HLC54 的倍增時間為 2.32 小時，而
CaENG1 heterozygous knock-out 突變株 EHK1 的倍增時間為 2.37 小
時，Caeng1 homozygous knock-out 突變株 EKG7 和 EKP2 的倍增時間各 為1.98 小時和 2.24 小時，CaENG1 rescued 突變株 EGR 之倍增時間為 2.18 小時，各菌株之倍增時間差異皆小於0.4 小時。4.6.2 芽管試驗之結果 (germ tube assay)
以野生株 SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、HLC52 (efg1/efg1) 和 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 作為正負對照組，比較 CaENG1 各突變株於 YPD 培養液加10％山羊血清、37 ℃培養五小時下芽管生成之情形。以倒立式 顯微鏡放大四百倍觀察，如圖十三，野生株SC5314 於誘發培養條件下，
有芽管生成之情形，cph1 突變株 JKC19 與 SC5314 一樣有芽管生成，而
efg1 突變株 HLC52 和雙突變株 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 則無芽管生
成；結果顯示CaENG1 各突變株 EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、EKG7
(Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/CaENG1::FRT) 有生成芽管之能力，由此可知剔除 CaENG1 並不影響白色念珠菌芽管生成之能力。4.6.3 菌落型態變化之結果 圖十四，野生株SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、HLC52 (efg1/efg1) 和 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 作為正負對照組，以血清和 37 ℃培養誘發菌絲的生 長，在營養缺乏之Bacto agar 培養下，SC5314 和 JKC19 有菌絲生長的情 形，菌絲呈不規則放射狀；而HLC52 和雙突變株 HLC54 則無菌絲生長，
呈酵母菌型態。而
CaENG1 各突變株 EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、
EKG7 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/CaENG1::FRT) 也觀察到菌絲生長的情形，型態變化 和對照組野生株SC5314 和 JKC19 相似。
4.6.3.2 含 4％山羊血清之 YPD 培養基上之生長
將單一菌落培養至含 4％山羊血清之 YPD 培養基、37 ℃培養三天後觀 察菌落型態的變化。如圖十五所示，野生株SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、
HLC52 (efg1/efg1) 和 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 作為正負對照組，以 血清和37 ℃培養誘發菌絲的生長，在營養充足之 YPD 培養下，野生株 SC5314 單一菌落表面呈現不規則皺摺，菌落外圍亦不平整，而 cph1 突 變株JKC19 也有菌落表面皺摺之情形；而 efg1 突變株 HLC52 和雙突變 株HLC54 之菌落表面則無皺摺，呈現光滑的酵母菌型態。而 CaENG1 各 突變株EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、EKG7 (Caeng1::FRT/
Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/
CaENG1::FRT) 單一菌落之型態和野生株 SC5314 相似，皆為菌落表面有
明顯不規則皺摺之情形。
4.6.4 侵犯力試驗之結果 (invasion assay)
將單一菌落培養至 solid Spider 培養基、37 ℃培養七天，誘發菌絲之生 長，進而增加菌落於培養基的附著力，再以固定水流沖洗培養基，觀察 菌落殘留之情形。如圖十六，野生株SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、HLC52 (efg1/efg1) 和 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 為對照組，以無菌絲生長能力 之雙突變株HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 被固定水流完全沖洗掉之時間 作為基準，野生株SC5314 於固定水流、固定時間下並無沖洗掉之情形；
cph1 突變株 JKC19 被沖洗後，則有部分菌落表面可被沖刷掉，但菌落不
會被沖洗掉；efg1 突變株 HLC52 之菌落則幾乎完全被沖刷掉。而比較CaENG1 各突變株 EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、EKG7 (Caeng1::FRT/
Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/
CaENG1::FRT)，其菌落皆無被沖洗掉，菌落表面也不會被沖刷掉，生成
菌絲之能力和野生株SC5314 相似。4.7 營養素 uridine 影響營養基因缺陷野生株 BWP17 之結果
使用抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 所建構的 Caeng1 (Caeng1::FRT/
Caeng1::FRT) 突變株在目前所測試的性狀試驗中，和野生株 SC5314 並
無明顯不同。此結果和前人 (交大碩士論文 謝志豪, 2006) 以營養篩選標 記建構之Caeng1 突變株有些許出入。由於在含 4％山羊血清的 YPD 培
養基中，以SAT1 flipper 在野生株 SC5314 剔除 CaENG1 之突變株
(Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 會被血清及 37 ℃誘發生長菌絲，故於單一 菌落表面有皺摺產生；而以營養篩選標記於營養基因缺陷之野生株 BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3) 中剔除 CaENG1 的突變株，如圖 十七<A>所示，不額外給予其它營養素之情況下，突變株 BAU2