於 YPD、solid Spider 及含 10％山羊血清之 YPD 培養基 - Caeng1 類接合型突變株菌落型態之變化

4.11 Caeng1 類接合型突變株菌落型態之變化

4.11.2 於 YPD、solid Spider 及含 10％山羊血清之 YPD 培養基

之結果 (chemical susceptibility test) 依方法3.18 將各菌株依序十倍稀釋之細胞

培養基上，30 ℃培養一至兩天，觀察菌落生長之情形。如圖二十三所示，

以WT-1a (a/a, CaENG1/CaENG1) 和 WT-4α (α/α, CaENG1/CaENG1) 各 為a-type mating strain 及 α-type mating strain 之對照組。於熱感受實驗中，

將細胞培養至42 ℃一天，EKP2-3a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 較 WT-1a (a/a, CaENG1/CaENG1) 在細胞數 10⁴即有較少量的趨勢，而

EKP2-4a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 則和對照組沒有明顯差異；在 α-type mating strain 方面，EKP2-2α (α/α, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和對 照組WT-4α (α/α, CaENG1/CaENG1) 生長結果也相似。在鹼性環境培養 下 (pH 10)，各實驗組和其對照組相比，並無明顯生長之差異。而於 1.5 M NaCl 培養下，EKP2-3a 之生長可能較 WT-1a 少，EKP2-4a 則較對照組無明顯區別。在0.1％ SDS 培養下，各菌株生長情況較差，且 α-type mating strain 生長情形較 a-type mating strain 差，而 EKP2-3a 在細胞數 10⁴開始則無生長趨勢，明顯和WT-1a 有落差；而在 0.02％ SDS 培養下和對照組相比並無顯著差異，顯示EKP2-3a 對較高濃度之 SDS 有敏感性。在其它化學藥品如Triton X-100、Tween 20、H₂O₂、DTT (dithiothreitol) 等之反應上，各突變株與對照組相比無顯著差異。而在含細胞壁染劑CFW (Calcofluor white stain) 之培養基上，EKP2-3a 可能生長較對照組 WT-1a 少。

五、討論

承襲實驗室先前發表之論文指出 CaENG1 和 CaURA3 會影響白色念珠菌菌絲的生成，剔除

CaENG1 降低同環境下細胞菌絲的生長；而營養性

篩選標記

URA3 則會增加同環境下細胞菌絲的生長，此二者對菌絲生長

出現相反的誘因，故於結果判斷上顯得困難 (交大碩士論文謝志豪, 2006)。而重新檢驗先前建構之 Caeng1 突變株、驗證營養性篩選標記影 響菌絲生長之程度，以及確認實驗流程之設計需耗費大量時間，故選擇以非營養性篩選標記來重新剔除

CaENG1，再觀察剔除後的結果是否與

先前之研究相符合，以求更進一步確認

CaENG1 對白色念珠菌菌絲生成

之影響。本實驗選用抗藥性篩選標記 SAT1 flipper (Reuss et al., 2004)，排除營養性篩選標記可能對白色念珠菌造成的影響，以探討剔除

CaENG1

後，對白色念珠菌影響的結果。

5.1 以抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 剔除 CaENG1 結果之探討

因白色念珠菌為雙倍體 (Edwards, 1990)，利用抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 可 pop-out 出基因體的特性，可重複使用此篩選標記做第二次白色念珠菌轉形。相較於先前研究常使用之營養性篩選標記 (ARG4, HIS1,

URA3 marker) (Dennison et al., 2005)，需要在三種不同的篩選標記上建構

標的基因上下游相似序列，使用

SAT1 flipper 剔除基因所花費之時間和精

力較少；其次以藥物nourseothricin 篩選帶有 SAT1 flipper 之菌株，會較 傳統以營養素篩選菌株的篩選能力更具敏感性；再者，由於白色念珠菌轉形困難、沒有已知質體 (De Backer et al., 1999)，相較於使用一般傳統白色念珠菌轉形方法得到少數轉形株 (transformants)，本實驗將結果 4.2.1 建構好之質體pSAT1-BA，以酵素切下帶有 SAT1 序列的片段後，以

clean-up 取代膠上純化方式 (gel extraction)，依電穿孔方法送入白色念珠菌，可得到多於四百顆轉形菌株數，推測因clean-up 會帶有多餘 DNA 片段，其可能作用似carrier DNA，故可得到較高之轉形效率。

5.2 以南方點墨法及分析 RNA 表現量檢驗 Caeng1 突變株

將初步符合 PCR 結果之 CaENG1 突變株進一步以南方點墨法

(Southern blot) 檢驗，如圖十，wild-type CaENG1 allele 可偵測到約 7.6 kb 片段大小；

Caeng1 knock-out 且 SAT1 flipper 已 pop-out 之 allele 可偵測到

約4.2 kb 大小的片段；而為避免無法區分 CaENG1 rescued allele 和

wild-type allele，則將 CaENG1 片段以 PCR 方式合成出來後，建構至帶 有

CaENG1 下游相似序列的 SAT1 flipper，故 rescued construct 送入白色

念珠菌並進行

SAT1 flipper pop-out 後，rescued allele 會比 wild-type allele

多

CaENG1 下游相似序列之片段長，如此可得約 8.0 kb 片段，而與

wild-type allele 的 7.6 kb 作區隔。將符合南方點墨法檢驗之 CaENG1 各突 變株分別命名為EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、EKG7 (Caeng1::FRT/

Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)、EGR (Caeng1::FRT/

CaENG1::FRT)。

此後進行各突變株 RNA 表現量之分析，萃取各菌株的 RNA，以反轉錄酶聚合鏈反應 (RT-PCR) 檢驗各突變株 CaENG1 基因表現的情形。如圖十一，在EHK1 及 EGR 突變株均可觀察到 RT-PCR 預期的產物大小，

即表示EGR 此突變株之 rescued allele 可順利轉錄出 CaENG1 之 RNA；

而在雙套

Caeng1 knock-out 之突變株 EKG7 及 EKP2 皆無法偵測到 RNA

的表現量，與預期中 Caeng1 突變株建構一致。

5.3 CaENG1 各突變株性狀分析之探討

5.3.1 生長曲線之探討

此實驗為比較 CaENG1 各突變株於相同環境條件培養下和對照組之生 長速率的差異。對照組為野生株SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、HLC52 (efg1/efg1) 及 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1)。由圖十二<A>可得知，在 YPD 培養液、30 ℃培養下，CaENG1 各突變株與野生株 SC5314 和 cph1 突變

及HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 呈現菌落外圍平整之酵母菌型態，無菌絲 (cph1/cph1) 生成表面皺摺之單一菌落；對照組 HLC52 (efg1/efg1) 及 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 呈現菌落表面圓滑、外圍平整之酵母菌型 態；而

CaENG1 各突變株在相同環境培養下，也皆出現表面皺摺、外圍

型態不規則之單一菌落，此結果與前述實驗結果相符，剔除

CaENG1，

不影響白色念珠菌形成菌絲生長的能力。但與先前發表之論文的結果有些許落差，文中提到在含4％山羊血清之 YPD 培養基中不額外添加營養素的情形下，Caeng1 突變株 BAU2 (Caeng1::ARG4/Caeng1::URA3) 會生成表面皺摺之單一菌落；而

Caeng1 突變株 BAH1-1 (Caeng1::ARG4/

Caeng1::HIS1) 則出現光滑平整之單一菌落，如額外添加 uridine 的情形

下，BAH1-1 之單一菌落分別出現兩種不同情形：一為菌落表面皺摺，一為光滑平整 (交大碩士論文謝志豪, 2006)。至此以營養篩選標記剔除

CaENG1 和以抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 剔除 CaENG1 出現不同的性狀

結果，其建構突變株過程之差異除篩選標記可能會對白色念珠菌造成不同的影響以外 (Lay et al., 1998)，所建構之菌株也不同，抗藥性篩選標記

SAT1 flipper 是以野生株 SC5314 進行基因置換；而營養篩選標記需使用

於營養基因缺陷之菌株BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3) (Wilson et

al., 1999)，又有研究指出 uridine 營養缺陷會致使白色念珠菌無毒性 (Cole

et al., 1995)，因此之後會以實驗先釐清是否為 BWP17 菌株本身為 uridine

補給所影響型態變化。

5.3.4 侵犯力試驗之探討

將菌株培養至 solid Spider 培養基、37 ℃培養七天誘發白色念珠菌生長菌絲侵入培養基，再以固定水流沖洗培養基，觀察菌落殘留之情形。如圖十六，

CaENG1 各突變株與對照組野生株 SC5314 及 cph1 突變株 JKC19

均有菌絲生成並侵入培養基中；而對照組

efg1 突變株 HLC52 及 HLC54

(cph1/cph1 efg1/efg1) 則無生長菌絲侵入培養基之能力。此結果也與前述 實驗結果相符，CaENG1 並沒有直接參與菌絲型態變化之過程。而在本實驗室於2006 年發表之論文則記載將 Caeng1 突變株培養至 solid Spider 培養基中，不額外添加其它營養素的情形下，BAH1-1 (Caeng1::ARG4/

Caeng1::HIS1) 菌落可被沖刷掉，BAU2 (Caeng1::ARG4/Caeng1::URA3)

情形則與野生株SC5314 相同，菌落無法被水流沖刷掉 (交大碩士論文謝志豪, 2006)。此部分結果也與 2006 年發表之論文有出入，但由於 2006 年發表之論文於性狀分析實驗中所採用的對照組為野生株SC5314，而非 BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3)，故應重現對照組 BWP17 於相同 實驗條件下給予營養素uridine 與否之型態變化，再予以討論。

5.4 營養素 uridine 影響營養基因缺陷野生株 BWP17 之結果探討

由圖十七<B>可見，於含 4％山羊血清之 YPD 培養基中，給予 uridine，

培養37 ℃三天誘發菌絲生長，BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3) 之 單一菌落有三種型態出現，分別為光滑之酵母菌型、菌落中間凹陷，有初步皺摺情形以及菌落表面呈皺摺狀，菌落外圍不平整；而同樣生長條件下，不給予uridine，BWP17 之單一菌落均為光滑表面。由此結果可得知，與2006 發表之論文間的出入在於 BWP17 之型態變化受 uracil 生合

成影響，而當菌株無法自行合成uracil，且外界無補充營養素時，白色念珠菌則失去毒性 (Cole et al., 1995)。故 2006 年論文發表之菌落型態變化於含4％山羊血清的 YPD 培養基以及侵犯力試驗的結果中，以營養篩選標記

ARG4 和 HIS1 剔除 CaENG1 之突變株會有菌絲生成能力下降的原

因，應為營養基因缺陷菌株BWP17 受 uracil 缺乏的影響，而非剔除

CaENG1 所造成的影響。

5.5 細胞分裂之結果探討

先前國外相關研究發表，在不同的真菌中 Eng1p 之功能為 endo-1,3-β- glucanase，剔除 ENG1 則會造成細胞分裂不完全之現象 (Baladrón et al., 2002；Martín-Cuadrado et al., 2003；Esteban et al., 2005)。將細胞培養至 mid-log phase，以細胞壁染劑 Calcofluor white stain 進行染色，再以雷射掃描式共軛焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscope) 放大一千倍觀察細胞分裂之情形。如圖十八所示，在對照組野生株SC5314、cph1 突 變株JKC19、efg1 突變株 HLC52 及 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1)，呈現單 顆或兩三顆細胞分裂的型態；而在

Caeng1 突變株 EKG7 及 EKP2 偶有發

現四至六顆細胞分裂不完全的現象，但並不是一種普遍的現象，大多數細胞為二至三顆分裂的狀態。顯示缺少

CaENG1 此基因對細胞壁的裂解

還是有造成些許程度之影響，而CaEng1p 非細胞分裂不完全主要關鍵的原因推測為其上游還有主要控制的基因

CaRHO4，於 2007 年發表剔除

CaRHO4 可造成七成以上觀察之細胞均為分裂不完全的現象 (11 顆以上

細胞裂解不完全)，而在 Carho4 突變株中過量表現 CaENG1 則可以補償分裂不完全的現象 (Dünkler et al., 2007)。因此推論可能 CaRHO4 可以在

CaENG1 缺損之下，提高其他類似功能的基因來補償，所以剔除 CaENG1

後並沒有看到普遍細胞分裂不全的現象。

5.6 化學藥品感受性試驗之結果探討

由於CaENG1 為細胞壁裂解相關之基因，而文獻指出和白色念珠菌同 源性高之啤酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)，如剔除與細胞壁建構或重組相關基因，則對於細胞壁染劑等化學試劑有高度敏感性 (Ram et al., 1994；Popolo et al., 1997；Rodríguez-Peña et al., 2000)。因此以細胞壁染 劑等化學藥品做感受性試驗。如圖十九之結果，CaENG1 各突變株於含不同化學藥品之YPD培養基，和野生株SC5314 相比，生長情形並無顯著差異。此結果顯示在目前所測試過之化學藥品中，白色念珠菌缺少 endo-1,3-β-glucanases並無對細胞壁組成造成明顯缺陷，進而對化學藥品產生敏感性。

5.7 以南方點墨法檢驗 Caeng1 接合型突變株 (a/a or α/α) 之探討 誘發 Caeng1 突變株 EKP2 之五號染色體缺失後 (交大柯惠菁未發 表)，進一步以南方點墨法檢驗其接合型 (mating type)。如圖二十<A>為檢驗

MTLa1 之存在，圖二十<B>為檢驗 MTLα1 之存在。只存在 MTLa1

則為a-type mating strain，分別命名為 WT-1a、WT-2a、WT-3a (a/a, CaENG1 /CaENG1) 及 EKP2-1a、EKP2-3a、EKP2-4a、EKP2-5a、EKP2-6a (a/a,

Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)；而只存在 MTLα1 之菌株則為 α-type mating

strain，分別命名為 WT-4α、WT-5α、WT-6α (α/α, CaENG1/CaENG1) 及 EKP2-2α (α/α, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)。

5.8 以血清誘發 Caeng1 接合型突變株菌絲生長之型態探討 5.8.1 於含 4％山羊血清之 YPD 培養基上的菌落型態

將菌株培養至富含營養源之 YPD 培養基，給予 4％山羊血清，培養於 37 ℃三天誘發白色念珠菌生成菌絲，並觀察 Caeng1 接合型突變株與對

照組間單一菌落型態的變化。圖二十一，對照組分別為WT-1a、WT-2a、

WT-3a (a/a, CaENG1/CaENG1) 及 WT-4α、WT-5α、WT-6α (α/α,

CaENG1/CaENG1)，如結果所示，α-type mating strains 均受血清誘發，單

一菌落表面生成皺摺；而a-type mating strains 方面，對照組菌落表面皆為皺摺，而五株實驗組突變株中，EKP2-4a 及 EKP2-6a (a/a, Caeng1::FRT/

Caeng1::FRT) 結果與對照組相同，均受血清誘發形成菌落表面皺摺，而

EKP2-1a、EKP2-3a 及 EKP2-5a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 菌落表面 則為光滑的現象。在a-type 實驗株方面，將近一半之比例有不同表現型 (phenotype)，分別為菌落表面皺摺狀及光滑狀兩種型態，但其來源皆為

Caeng1 突變株 EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 誘發成 a-type mating

strain，會有不同實驗結果，推測應如 2009 年發表之文獻所提到，白色念珠菌在基因變異的情況時，如染色體缺失 (chromosome loss) 或基因重組置換 (mitotic recombination)，在其它染色體中常會伴隨基因變異的情形 (Diogo et al., 2009)。故在五個 a-type 實驗株會出現不同表現型的結果，

應為在誘導突變株缺失第五號染色體時，也伴隨其它基因的變異，因此生長菌絲，在a-type mating strains 方面，對照組 WT-1a (a/a, CaENG1/

CaENG1) 菌落表面生成皺摺，且有菌絲深入培養基，實驗組 EKP2-4a

及EKP2-6a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 與對照組 WT-1a 相同，而 EKP2-1a、EKP2-3a、EKP2-5a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 則是單一 菌落表面光滑，但菌落周圍有菌絲生成。而提高YPD 培養基中山羊血清的含量至10％，可得與圖二十一<A>培養於 4％山羊血清之 YPD 培養基一致的結果，實驗組EKP2-4a 及 EKP2-6a 與對照組 WT-1a 相同，菌落生成皺摺之表面，而EKP2-1a、EKP2-3a、EKP2-5a 則是單一菌落表面光滑。

文獻指出菌絲狀細胞與酵母菌狀細胞之比例為決定菌落型態 (colony

在文檔中探討剔除白色念珠菌ENG1之影響 (頁 67-0)