3.2 聚合酶連鎖反應)
3.2.1 一般 PCR 反應
1 unit (U) 的 Taq Polymerase (5 U/μl) (NEB M0267S)、10 X PCR buffer 5 μl、50 μM 的引子各 1 μl、2.5 mM dNTPs mixture 4 μl、0.1 μg 的 template DNA，補二次無菌水至總體積 50 μl，置於 PCR 溫度控制儀進行聚合酶 連鎖反應。以此方法反應預計得到
CaENG1 上游 A region 及下游 B region。
3.2.2 Rescued CaENG1 PCR 反應
欲合成 CaENG1 上游之 A region 及 CaENG1 open reading frame 至下游
B region 之片段約為 4.4 kb。使用 Phusion™High-Fidelity PCR Kit (NEB F
將離心管置於冰上30分鐘，4 ℃離心720×g、10分鐘，去上清液。加入2.5 ml預冷之0.1 M CaCl2，置冰上1小時後可直接進行轉形。或置4 ℃ 12～16 小時後，低溫離心720×g、5分鐘，去上清液。加入2.5 ml預冷之freezer solution，混合均勻後，分裝至1.5 ml離心管，迅速儲存於 -80 ℃。（以上 均為無菌操作）。
3.4 限制酶反應 (enzyme digestion)
3.4.1 確定質體 DNA 片段大小之限制酶反應
取 DNA 1 μg、1 U/kb 限制酶、10 X buffer 1 μl、10 X BSA 1 μl，補充無 菌二次水至總體積10 μl，37 ℃水浴培養 1 小時，再以 0.8％洋菜膠電泳 進行片段大小之分析。
3.4.2 為 clone 所需之限制酶反應
取 DNA 10μg、10 X buffer 5 μl、10 X BSA 5μl、限制酶 1 μl、補二次無 菌水至總體積為50 μl，37 ℃反應 3 小時至 18 小時（依酵素特性）。反 應完成後，以clean up kit (Premier CU250) 去除限制酶、buffer 及鹽類等，
所得到之DNA 片段用以進行下一步接合反應。
3.5 接合反應 (ligation)
將載體 DNA (vector DNA) 及欲插入之 DNA 片段 (insert DNA) 連結之 反應條件為︰vector DNA 50～400 ng、insert DNA 和 vector DNA 莫耳濃 度比為3︰1、10 X ligase buffer 1 μl、T4 DNA ligase (5 U/μl) (Fermentas EP0402) 0.4 μl，補無菌二次水至總體積 10 μl。4 ℃培養 12～16 小時，或 22 ℃培養 1 小時。
3.6 轉形反應 (transformation) (Dagert and Ehrlich, 1979)
將 competent cell 冰上解凍，分裝至 50 μl，加入 pDNA （0.1～1 μg），
其中一管不加入pDNA 以做為控制組。冰浴 30 分鐘，42 ℃熱休克（heat shock）60 秒（＜90 秒）。加入 300 μl LB broth，37 ℃、150 rpm 培養 1 小時。再取80～100 μl 菌液塗抹至含有 ampicillin 之 LB 的培養基上
（AMP：50 μg/ml），37 ℃培養 12～16 小時。（以上均為無菌操作）
3.7 洋菜膠內之 DNA 萃取 (gel extraction) 3.7.1 結晶紫洋菜膠之製備
將 0.4 g agarose 粉末加入 50 ml 1 X TAE buffer 中，微波爐加熱溶解 agarose，稍冷後加入 40 μl 結晶紫溶液 (2.5 mg/ml)，混合均勻，倒入製 膠台中，冷卻凝固即可使用。
3.7.2 洋菜膠內之 DNA 片段萃取
將欲萃取之洋菜膠上的 DNA 片段以電泳方式分離，以刀片切下欲得到 之DNA 片段。將洋菜膠片段放置微量離心管中，以 Gel extraction kit (Premier DE250)，加入與片段等量之 binding buffer，60 ℃加熱板上加熱 10 分鐘，確定洋菜膠片段完全融化後，冷卻至室溫。將混合液移至 spin column，15,700×g、1 分鐘、去收集管內液體。加入 700 μl washing buffer，
15,700×g、1 分鐘、去收集管內液體。重覆加入 700 μl washing buffer，
15,700×g、1 分鐘、去收集管內液體之後，空轉 15,700×g、2 分鐘。將 spin column 移至新的微量離心管，60 ℃加熱 5 分鐘，30 μl 無菌二次水加入 spin column 正中央，等待 2 分鐘，15,700×g、1 分鐘離心後，即得欲萃取 之DNA，將之儲存於 -20 ℃。
3.8 白色念珠菌轉形反應
3.8.1 白色念珠菌勝任細胞之製備
接種單一菌落至 5 ml YPD 培養液中、30 ℃ 培養 18～24 小時、150 rpm。取 5 μl 已培養之菌液轉養至 50 ml YPD 培養液 30 ℃ 16～24 小時、
150 rpm 至 OD600約1.6～2.2。菌液分裝至 50 ml 離心管中，離心 1,620×g、
5 分鐘，去上清液。加入 1 ml 1 M lithium acetate 及 1 ml 10 X TE 和 8 ml 無 菌二次水。30 ℃ 培養 1 小時、150 rpm。再加入 250 μl 1 M DTT，30 ℃ 培養半小時、150 rpm。之後加入 40 ml 無菌二次水，離心 1,620×g、5 分 鐘。以下開始冰上操作：加入25 ml 預冷過之無菌二次水懸浮菌體，4 ℃ 低溫離心1,620×g、5 分鐘，去上清液。再加入 5 ml 預冷過之 1 M sorbitol，
4 ℃低溫離心 1,620×g、5 分鐘，去上清液。重複加入 5 ml 1 M sorbitol，
4 ℃低溫離心 1,620×g、5 分鐘，去上清液。最後加入 50 μl 1 M sorbitol，
靜置於冰上，即為白色念珠菌之勝任細胞。此勝任細胞無法儲存，故操 作完後直接進行白色念珠菌之轉形反應。
3.8.2 電穿孔（electroporation）(Köhler et al., 1997)
取欲轉形之線狀 DNA 片段 (～1 μg) 和 40 μl 勝任細胞於 1.5 ml 微量離 心管中，混合均勻置於冰上培養5 分鐘。之後將反應物移至 0.2 cm cuvette 中，進行電穿孔反應 (1.8 kV，6.1 ms) ，反應後迅速將 cuvette 置於冰上，
並加入1 ml 預冷過之 1 M sorbitol，混合均勻後移至新的 1.5 ml 微量離心 管。4 ℃低溫離心 800×g、5 分鐘，以 pipette 去上清液。加入 1 ml YPD 培養液後，30 ℃培養 1 小時、150 rpm。之後取 80～100 μl 菌液塗抹至篩 選培養基上 (nourseothricin：200 μg/ ml) (Werner Bioagents, Jena, Germany )，30℃培養兩天。
3.9 SAT1 flipper 之剔除（pop-out）
將篩選後之較大顆的菌落於 YPD 培養基上再劃出單一菌落。接種單一 菌落至YP＋Maltose 培養液中，30 ℃培養 3～7 天、150 rpm，即可剔除
SAT1 flipper。之後將一半菌液儲存於 4 ℃，以便於五日內劃出 replica
plating 所需之 master plate；另一半菌液用以萃取 genomic DNA (gDNA)，進行PCR 確認。
3.10 複製平皿培養法（replica plating）
將 master plate (YPD 培養基) 覆蓋於固定好之絨布上，輕壓培養基，將 絨布沾上菌落之後，再以不含篩選之培養基 (YPD 培養基) 及含篩選之 培養基 (Nou＋：200 μg/ ml) 依序覆蓋於絨布上。將 replica 後之培養基置 於30 ℃培養一天，再比對含篩選及不含篩選之培養基上的菌落。如在不 含篩選之培養基上 (YPD 培養基) 有菌落生長，而在含篩選之培養基上 對應同一位置沒有生長菌落，應為
SAT1 flipper 被剔除出基因體中。
3.11 白色念珠菌染色體 DNA 之萃取
本實驗中使用了兩種方法萃取白色念珠菌之 gDNA，方法一為製備一 般PCR 所需之 template；方法二為製備南方點墨法中所使用之 gDNA 和 rescued ENG1 PCR 中所需之 template，操作方法如下：
3.11.1方法一：
接種單一菌落至 5 ml YPD 培養液中，30 ℃培養 18～24 小時、150 rpm。
離心1,125×g、12 分鐘，去上清液。加入 200 μl breaking buffer，混合均 勻並移至1.5 ml 微量離心管中。將離心管置於 -80 ℃、2 分鐘，95 ℃、
1 分鐘；並重複 -80 ℃、2 分鐘，95 ℃、1 分鐘，vortex 震盪 30 秒，再 加入200 μl chloroform，vortex 震盪 2 分鐘至溶液變乳白色。將其離心 15,700×g、10 分鐘，取 200 μl 上清液至新的 1.5 ml 微量離心管中，加入 400 μl 99.9％酒精及 25 μl 3 M NaOAC，手搖均勻。將其置於 -20 ℃沉降 10 分鐘到 2 小時。4 ℃低溫離心 15,700×g、5 分鐘，去上清液。再加入
500 μl 70％酒精沖洗管壁沉澱物，4 ℃低溫離心 15,700×g、5 分鐘，以 pipette 去上清液。將微量離心管斜放靜置室溫下 20 分鐘，乾燥 pellet，
再以30 μl 無菌二次水溶解 DNA，置於 4 ℃回溶 12～18 小時。DNA 儲 存於 -20 ℃。
3.11.2 方法二：
接種單一菌落至 5 ml YPD 培養液中，30 ℃培養 18～24 小時、150 rpm。
離心1,125×g、12 分鐘，去上清液。加入 1 ml 無菌二次水懸浮菌體並移 至1.5 ml 微量離心管中。離心 15,700×g、10 分鐘，去上清液。加入 300 μl breaking buffer，vortex 震盪 5 分鐘。再加入 1/3 倍體積的玻璃珠，vortex 震盪5 分鐘。加入 3 μl (20 mg/ml) proteinase K、3 μl (10 mg/ml) RNase A，
置於37 ℃水浴槽中 1 小時反應。之後再加入 300 μl phenol，vortex 震盪 5 分鐘。加入 300 μl 1 X TE，vortex 震盪 5 分鐘。離心 15,700×g、10 分 鐘，小心取上清液至新的1.5 ml 微量離心管中，加入等量之 phenol，4 ℃ 低溫離心15,700×g、5 分鐘；取上清液至新的 1.5 ml 微量離心管中，加 入等量之phenol，4 ℃低溫離心 15,700×g、5 分鐘；取上清液至新的 1.5 ml 微量離心管中，加入2 倍體積之 99.9％酒精和 1/8 倍體積的 NaOAC，置 於 -20 ℃沉降 5～20 分鐘。4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，去上清液。
加入1 ml 75％酒精沖洗管壁沉澱物，4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，
以pipette 去上清液。將微量離心管斜放靜置室溫下 20 分鐘，乾燥 pellet，
再以50 μl 無菌二次水溶解 DNA，置於 4 ℃回溶 12～18 小時。DNA 儲 存於 -20 ℃。
3.12 南方點墨法（Southern blot）
3.12.1 製備 DNA 探針 (DNA probe labeling)
以 PCR 方式合成 DNA 探針：於微量離心管中，加入 1 unit (U) 的 Taq
Polymerase (5 U/μl) (NEB M0267S)、template DNA (約 10～100 ng)、10 X 於 50 ml Denaturation solution 中，平面震盪 50 rpm、15 分鐘。再以滅菌 過之二次水沖洗洋菜膠，平面震盪 50 rpm、5 分鐘。以上兩步驟重複一 次。再將洋菜膠置於 50 ml Neutralization solution 中，平面震盪 50 rpm、
15 分鐘。再以滅菌過之二次水沖洗洋菜膠，平面震盪 50 rpm、5 分鐘。
將乾燥之耐龍膜置於 12 ml prehybridizaton buffer (Roche 11603558 001) 中，42 ℃、平面震盪 50 rpm、3 小時。再將耐龍膜移置 12 ml 含有標記 探針hybridization buffer 中 (探針濃度：50 ng/ml)，42 ℃、平面震盪 50 rpm、12～24 小時。
3.12.4 免疫偵測 (detection)
將耐龍膜移置 50 ml 的 2 X washing buffer 中，室溫下平面震盪 50 rpm、
20 分鐘。此步驟重複一次。再將耐龍膜於 50 ml 0.5 X washing buffer 中，
60 ℃下平面震盪 50 rpm、20 分鐘。之後移置新的 50 ml 0.5 X washing buffer 中，室溫下平面震盪 50 rpm、20 分鐘。此步驟重複一次。耐龍膜 移置於25 ml 的 1 X blocking buffer 室溫下平面震盪 50 rpm、30 分鐘。再 加入2.5 μl Anti-DIG-AP (Roche 1093274) 形成 antibody buffer，平面震盪 50 rpm、30 分鐘。之後再以 30 ml washing buffer 清洗耐龍膜，平面震盪 50 rpm、15 分鐘。此步驟重複一次。再以 30 ml detection buffer 平面震盪 耐龍膜5 分鐘，將耐龍膜置於投影片夾層中，以含有 10 μl CSPD (Roche 1655884) 之 1 ml detection buffer 均勻潤濕耐龍膜，於 37 ℃避光靜置 20 分鐘。之後於暗房中以X 光底片進行壓片，1 小時後進行底片沖洗動作 (develop buffer 中搖晃至底片有顯影，再將底片置於 fixer 中完全浸潤，
之後以清水沖洗一下即可)。
3.13 RNA 萃取 (RNA extraction)
接種單一菌落至 5 ml YPD 中，30 ℃培養 18～24 小時、150 rpm。隔日 取1.5 ml 菌液轉養至 36 ml 新鮮之 YPD 中，30 ℃培養至指數生長期 (mid-log phase)。將培養好之菌液分裝至 50 ml 離心管中，4 ℃低溫離心 1,620×g、5 分鐘，去上清液。加入 2 ml DEPC-treated H2O 懸浮菌體。將 之移至15 ml 離心管中，4 ℃低溫離心 1,620×g、10 分鐘，去上清液。加
入300 μl RIB (RNA isolation buffer) 懸浮菌體、加入 1/3 倍體積的玻璃珠 (Sigma G9268-500G)，低溫震盪 5 分鐘、再加入 300 μl phenol，低溫震盪 5 分鐘、重複加入 1/3 倍體積的玻璃珠，低溫震盪 5 分鐘、加入 500 μl RIB，
低溫震盪5 分鐘。4 ℃低溫離心 1,620×g、10 分鐘，取上清液至新的 1.5 ml 離心管 (DEPC-treated)，再 4 ℃低溫離心 15,700×g、5 分鐘，取上清液至 新的1.5 ml 離心管。加入等量之 phenol，震盪 30 秒。4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，取上清液至新的 1.5 ml 離心管。加入等量之 phenol，
震盪30 秒。4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，取上清液至新的 1.5 ml 離心管。加入1/8 倍體積之 2.5 M NaOAC 及 2.5 倍體積之 99.9％ 冰乙醇，
置於冰上30 分鐘 (或置 -20 ℃沉降 30～90 分鐘)。4 ℃低溫離心
15,700×g、10 分鐘，以 pipet 去上清液。加入 1 ml 75％ 冰乙醇清洗沉澱 物，4 ℃低溫離心 15,700×g、10 分鐘，以 pipet 去上清液。將 1.5 ml 微量 離心管斜放於室溫下至微乾狀態，再以50 μl DEPC-treated H2O 回溶 RNA。RNA 儲存於 -80 ℃。
3.14 RNA 電泳
3.14.1 RNA 電泳前處理
將 8～12 μg RNA、3.5 μl 10 X MOPS、5 μl 37％ formaldehyde、10 μl formamide、3 μl RNA dye 以及 1 μl 10 mg/liter EtBr 置於 1.5 ml 微量離心 管中，混合均勻。於65 ℃加熱 10 分鐘後迅速置於冰上 5 分鐘。
3.14.2 RNA 電泳
首先配製 1％洋菜膠：0.5 g agarose 於 36 ml DEPC-treated H2O 中微波 加熱溶解，稍冷後加入5 ml 10 X MOPS、9 ml 36.5％ formaldehyde 混合 均勻倒入製膠台中。將處理過之RNA 樣品注入至膠體之孔洞中，以 1 X MOPS 為電泳緩衝液，50 伏特電壓進行 RNA 電泳。電泳結束後，於電
泳影像處理系統照相。
3.15 反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR)
使用 SuperScriptTM One-Step RT-PCR with Platimun Taq (invitrogen 10928-042) 來進行 RT-PCR：25 μl 2 X Reaction Mix、1 μg RNA、10 μM sense primer (FN-F) 1 μl、10 μM anti-sense primer (FN-R) 1 μl、RT/
Platunum Taq Mix 0.75 μl，補二次無菌水至 50μl，再置於 PCR 溫度控制 儀進行反應。預計得到
CaENG1 片段大小為 421 bp。
PCR 溫度控制儀的設定如下︰
RT-PCR
42～55 ℃ 15～30 分鐘 94 ℃ 2 分鐘
94 ℃ 15 秒 55~60 ℃ 30 秒
72 ℃ 1 分鐘/kb (重複 26 個循環) 72 ℃ 5～10 分鐘
4 ℃ 停止反應
Internal control 為 CaACT1，以 primer ACT1-F 及 ACT1-R 合成出 471bp 之片段。
RT-PCR 反應完成後以 0.8％洋菜膠電泳確認 RT-PCR 產物片段。
3.16 突變株之性狀分析 (characterization) 3.16.1 生長曲線之測定 (growth curve)
接種單一菌落至 5 ml YPD 中，30 ℃培養一天。取適量過夜培養細胞轉
養至新鮮5 ml YPD 中，混合均勻使菌液此時 OD600吸光值為0.2。而後 將菌液置於30 ℃培養箱震盪培養 (150 rpm)。每隔兩小時取出 100 μl 之菌液稀釋十倍，測量其 OD600吸光值，連續紀錄觀察至24 小時。
3.16.2 芽管試驗 (germ tube assay)
將單一菌落接種至含 10％山羊血清之 YPD 培養液中，於 37 ℃培養五 小時後，於倒立式顯微鏡下觀察是否有芽管生成。
將單一菌落接種至含 10％山羊血清之 YPD 培養液中，於 37 ℃培養五 小時後，於倒立式顯微鏡下觀察是否有芽管生成。