南方點墨法檢驗 CaENG1 各突變株 - 探討剔除白色念珠菌ENG1之影響

依方法 3.11.2 萃取各突變株之 gDNA，再依 3.12 進行南方點墨法分析。

以A region 作為 probe，限制酶 BsrGⅠ作用於 gDNA，經雜交、免疫偵測 後，如圖十，預計

CaENG1 wild type allele 片段偵測到約 7.6 kb、CaENG1

rescued allele 片段約 8 kb、Caeng1 knock-out allele 片段約 4.2 kb。結果顯 示SC5314 (wild type) 有符合預期片段大小 7.6 kb；EHK1 (CaENG1/

Caeng1::FRT) 則有符合片段 7.6 kb 及 4.2 kb；EKG7 和 EKP2 均為 Caeng1

homozygous knock-out strain (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)，符合預期片段 4.2 kb；EGR 為 CaENG1 rescued strain (Caeng1::FRT/

CaENG1::FRT)，符合預期片段 8 kb 和 4.2 kb。

4.5 反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) 檢驗 CaENG1 各突變株

依方法 3.13、3.14 萃取各突變株之 RNA 並以 0.8％洋菜膠電泳確認 RNA 品質。再依方法3.15 進行反轉錄聚合酶連鎖反應，檢驗各突變株之

CaENG1 基因有無表現。

CaENG1 的 mRNA 大小約為 3438 bp，如圖十一，設計引子 FN-F、

FN-R，合成出約 421 bp 之片段；internal control 為 CaACT1，以引子 ACT1-F、ACT1-R 得到約 471 bp 之 RT-PCR 產物。如圖所示，SC5314 (wild type) 為對照組，有預期 421 bp 之片段大小；EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT) 也有

CaENG1 基因表現之結果；而 Caeng1 雙套突變株 EKG7 及 EKP2

(Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 之 mRNA 則無 CaENG1 基因之表現；而 EGR (Caeng1::FRT/CaENG1::FRT) 也有得到預期片段大小 421 bp。此結果與 預期

CaENG1 剔除 (knock-out) 及補償 (rescue) 之突變株的建構相符

合。

4.6 CaENG1 各突變株之性狀分析

4.6.1 CaENG1 各突變株之生長曲線 (growth curve)

將 CaENG1 各突變株與對照組野生株 SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、

HLC52 (efg1/efg1) 及 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 比較其生長曲線之差 異。圖十二為比較各菌株於YPD 培養液中轉養 0～24 小時之生長曲線圖，圖十二<A>為各菌株之生長曲線，其中突變株 HLC54 (cph1/cph1

efg1/efg1) 及 HLC52 (efg1/efg1) 之生長較野生株 SC5314 緩慢，而結果顯

示

CaENG1 各突變株與野生株 SC5314 之生長成同趨勢，但 EKG7 和

EKP2 於培養 16 小時後細胞數和野生株 SC5314 及 cph1 突變株 JKC19 相 比有較少的現象 (OD₆₀₀為0.55、0.532、0.603、0.627 )，不過於培養 18 小時後，Caeng1 突變株 EKG7 細胞數趨向野生株 SC5314，而 Caeng1 突變株EKP2 至培養 24 小時後細胞數仍少於野生株 SC5314 (OD₆₀₀為 0.628、0.68 )，但是彼此間的差異性不大。圖十二<B>為取各菌株 OD₆₀₀ 吸光值之對數而成的生長曲線，各菌株於生長八小時後開始趨緩，而長時間培養後也可達到相似之對數值。以培養4 小時至 6 小時之吸光值計算對照組與

CaENG1 各突變株的細胞倍增時間 (doubling time)：野生株

SC5314 的倍增時間為 1.98 小時，突變株 HLC54 的倍增時間為 2.32 小時，

而

CaENG1 heterozygous knock-out 突變株 EHK1 的倍增時間為 2.37 小

時，Caeng1 homozygous knock-out 突變株 EKG7 和 EKP2 的倍增時間各為1.98 小時和 2.24 小時，CaENG1 rescued 突變株 EGR 之倍增時間為 2.18 小時，各菌株之倍增時間差異皆小於0.4 小時。

4.6.2 芽管試驗之結果 (germ tube assay)

以野生株 SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、HLC52 (efg1/efg1) 和 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 作為正負對照組，比較 CaENG1 各突變株於 YPD 培養液加10％山羊血清、37 ℃培養五小時下芽管生成之情形。以倒立式顯微鏡放大四百倍觀察，如圖十三，野生株SC5314 於誘發培養條件下，

有芽管生成之情形，cph1 突變株 JKC19 與 SC5314 一樣有芽管生成，而

efg1 突變株 HLC52 和雙突變株 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 則無芽管生

成；結果顯示

CaENG1 各突變株 EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、EKG7

(Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/CaENG1::FRT) 有生成芽管之能力，由此可知剔除 CaENG1 並不影響白色念珠菌芽管生成之能力。

4.6.3 菌落型態變化之結果 圖十四，野生株SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、HLC52 (efg1/efg1) 和 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 作為正負對照組，以血清和 37 ℃培養誘發菌絲的生 長，在營養缺乏之Bacto agar 培養下，SC5314 和 JKC19 有菌絲生長的情形，菌絲呈不規則放射狀；而HLC52 和雙突變株 HLC54 則無菌絲生長，

呈酵母菌型態。而

CaENG1 各突變株 EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、

EKG7 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/CaENG1::FRT) 也觀察到菌絲生長的情形，型態變化 和對照組野生株SC5314 和 JKC19 相似。

4.6.3.2 含 4％山羊血清之 YPD 培養基上之生長

將單一菌落培養至含 4％山羊血清之 YPD 培養基、37 ℃培養三天後觀察菌落型態的變化。如圖十五所示，野生株SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、

HLC52 (efg1/efg1) 和 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 作為正負對照組，以 血清和37 ℃培養誘發菌絲的生長，在營養充足之 YPD 培養下，野生株 SC5314 單一菌落表面呈現不規則皺摺，菌落外圍亦不平整，而 cph1 突 變株JKC19 也有菌落表面皺摺之情形；而 efg1 突變株 HLC52 和雙突變 株HLC54 之菌落表面則無皺摺，呈現光滑的酵母菌型態。而 CaENG1 各 突變株EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、EKG7 (Caeng1::FRT/

Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/

CaENG1::FRT) 單一菌落之型態和野生株 SC5314 相似，皆為菌落表面有

明顯不規則皺摺之情形。

4.6.4 侵犯力試驗之結果 (invasion assay)

將單一菌落培養至 solid Spider 培養基、37 ℃培養七天，誘發菌絲之生長，進而增加菌落於培養基的附著力，再以固定水流沖洗培養基，觀察菌落殘留之情形。如圖十六，野生株SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、HLC52 (efg1/efg1) 和 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 為對照組，以無菌絲生長能力 之雙突變株HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 被固定水流完全沖洗掉之時間 作為基準，野生株SC5314 於固定水流、固定時間下並無沖洗掉之情形；

cph1 突變株 JKC19 被沖洗後，則有部分菌落表面可被沖刷掉，但菌落不

會被沖洗掉；efg1 突變株 HLC52 之菌落則幾乎完全被沖刷掉。而比較

CaENG1 各突變株 EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、EKG7 (Caeng1::FRT/

Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/

CaENG1::FRT)，其菌落皆無被沖洗掉，菌落表面也不會被沖刷掉，生成

菌絲之能力和野生株SC5314 相似。

4.7 營養素 uridine 影響營養基因缺陷野生株 BWP17 之結果

使用抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 所建構的 Caeng1 (Caeng1::FRT/

Caeng1::FRT) 突變株在目前所測試的性狀試驗中，和野生株 SC5314 並

無明顯不同。此結果和前人 (交大碩士論文謝志豪, 2006) 以營養篩選標記建構之

Caeng1 突變株有些許出入。由於在含 4％山羊血清的 YPD 培

養基中，以

SAT1 flipper 在野生株 SC5314 剔除 CaENG1 之突變株

(Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 會被血清及 37 ℃誘發生長菌絲，故於單一 菌落表面有皺摺產生；而以營養篩選標記於營養基因缺陷之野生株 BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3) 中剔除 CaENG1 的突變株，如圖 十七<A>所示，不額外給予其它營養素之情況下，突變株 BAU2

(Caeng1::ARG4/Caeng1::URA3) 在含 4％山羊血清的 YPD 培養基中，生 長之單一菌落表面也有皺摺產生，但突變株BAH1-1 (Caeng1::ARG4/

Caeng1::HIS1) 在給予營養素 uridine 後，生長的單一菌落表面有皺摺及

光滑兩種情形，而不給予uridine 培養下，單一菌落表面則皆為光滑。由於圖十七<A>中，比較 uridine 給予與否對各突變株之影響的實驗中所選用的野生株為SC5314，而不是營養基因缺陷之野生株 BWP17，故先由補全uridine 對 BWP17 之影響的實驗著手。

如圖十七<B>，接種野生株 BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3) 於含 4％山羊血清的 YPD 培養基，分別添加 uridine 及不添加 uridine，37 ℃培養三天後，在添加uridine 所生長之單一菌落表面有光滑、皺摺及介於中間型，而不添加uridine 所生長的單一菌落表面則皆為光滑。此結果可解釋前人所建構之突變株BAH1-1 (Caeng1::ARG4/Caeng1::HIS1) 於給予 uridine 與否而造成生長型態不同之單一菌落。因此造成 BAH1-1 在含 4

％山羊血清的YPD 培養基中形成皺摺和光滑表面兩種不同型態的單一菌落，極有可能為野生株BWP17 之影響，而非 CaENG1 缺陷所造成。

4.8 細胞分裂觀察之結果

依方法 3.17 將細胞培養至 mid-log phase，以 5％ formaldehyde 固定細胞後，1 mg/ml Calcofluor white stain (Fluka F339) 染色細胞壁中之

chitin，以雷射掃描式共軛焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscope) 放大一千倍觀察細胞分裂之情形。如圖十八所示，白色箭頭標示為septum 之位置，septum 是細胞分裂中，母細胞 (mother cell) 和子細胞 (daughter cell) 之間的間隔構造，其富含細胞壁成分 chitin，故可清楚地以染劑 Calcofluor white stain 辨識。野生株 SC5314 之細胞呈橢圓形，其細胞分裂之septum 可明顯辨別，以單顆細胞或分裂中之 2～3 顆細胞為主要細

胞分布情形；JKC19 (cph1/cph1) 和 HLC52 (efg1/efg1) 細胞型態和野生株SC5314 相似，為橢圓形，且同樣為單顆細胞或分裂中之 2～3 顆細胞分布。HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 細胞則為細長型，呈現單顆或兩顆細 胞分裂的型態。EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/

CaENG1::FRT) 細胞和野生株 SC5315 細胞型態相似，細胞分布為單顆及

2～3 顆細胞。EKG7 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和 EKP2 (Caeng1::FRT/

Caeng1::FRT) 則有觀察到少數 4～5 顆細胞分裂不完全的現象，但此一現

象僅觀察到極少數，大部分細胞型態為單顆細胞或分裂中2～3 顆細胞的分布，因此需對是否可以代表性狀上的差異存疑。

4.9 CaENG1 各突變株於化學藥品感受性試驗之結果 (chemical susceptibility test)

依方法 3.18 將各菌株培養至細胞總數 2 × 10⁷，再將菌體離心後以1 X PBS 回溶，依序十倍、百倍、千倍稀釋，各取 0.5 μl 至 YPD 培養基，30

℃培養一天，如此培養基上各菌株之細胞數依序為10⁴、10³、10²及 10。

將培養好之master plate 經複製平皿培養法複製至含不同化學藥品之 YPD 培養基上，30 ℃培養一至兩天，觀察菌落生長之情形。培養於各種不同化學品配製成的培養基，

CaENG1 各突變株之細胞和野生株 SC5314 之細

胞生長情形並沒有太大的差別。如圖十九，在熱感受實驗中，將細胞培養於42 ℃一天，野生株 SC5314 之細胞和 CaENG1 各突變株之細胞生長 完好，並無顯著差異；強鹼環境培養下 (pH 10)，EKP2 (Caeng1::FRT/

Caeng1::FRT) 和 EGR (Caeng1::FRT/CaENG1::FRT) 分別在細胞數 10 有

生長較少之趨勢，但與野生株SC5314 之細胞相比並無太大區別；於 1.5 M NaCl 之 YPD 培養基，各菌株在細胞數 10²、10 之生長明顯趨緩，推測和鹽濃度造成滲透壓改變相關；於0.1％ SDS 培養基上，各菌株有生長較

少之趨勢，但相比則無明顯差別；在含200 μg/ml 細胞壁染劑 Congo red 之培養基上，各菌株之細胞數也成相同生長趨勢，細胞壁染劑並無對缺少細胞壁相關基因

CaENG1 之突變株造成影響。而以其他化學藥品製成

之培養基，如Tween 20、sortibtol、DTT、hydroxyurea、H₂O₂、Calcofluor white stain (CFW)，也無造成 CaENG1 各突變株和野生株 SC5314 生長之 不同。

4.10 確認 Caeng1 類接合型 (mating type like) 突變株 依照方法 3.19 培養野生株SC5314 及Caeng1 突變株EKP2

(Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 於YEPS培養基，由於培養基中山梨糖 (sorbose) 成分有一定的機率會使C. albicans在生長過程中缺失一條五號 染色體 (chromosome 5) (Janbon et al., 1998)，兩條五號染色體各含mating type like (MTL) 相關基因MTLa1、MTLa2 以及MTLα1、MTLα2 (Hull et al., 1999)。而移除sorbose後，C. albicans其中剩餘的一條五號染色體會進行 複製，形成homozygous a/a或α/α之突變株 (Janbon et al., 1998；Janbon et

al., 1999)，如附錄一所示。之後將YEPS培養基培養後之菌株，轉養至YPD

(a/α, CaENG1/CaENG1) 為對照組，可得a-type mating strains皆有偵測到 約6.5 kb大小之DNA，而α-type mating strains則無被偵測到MTLa1；如圖

以

二十<B>，SC5314 (a/α, CaENG1/CaENG1) 為對照組，可得α-type mating strains皆有偵測到約 4.8 kb大小之DNA，而a-type mating strains則無被偵測到MTLα1。符合南方點墨法檢驗結果之菌株，野生株SC5314 之類接合型突變株命名為WT-1a、WT-2a、WT-3a (a/a, CaENG1/CaENG1)，WT-4α、

WT-5α、WT-6α (α/α, CaENG1/CaENG1)；而EKP2 之類接合型突變株則命 名為EKP2-1a、EKP2-3a、EKP2-4a、EKP2-5a、EKP2-6a (a/a,

Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 及EKP2-2α (α/α, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT

)。

.11 Caeng1 類接合型 (mating type like) 突變株菌落型態之變化

之 YPD 培養基、37 ℃培

-5α、

B>，對照組 WT-4α、WT-5α、WT-6α (α/α, CaENG1/CaENG1) 4

4.11.1 於含有 4％山羊血清之 YPD 培養基 將各突變株之單一菌落培養至含 4％山羊血清

養三天，並觀察菌落型態之變化。以WT-1a、WT-2a、WT-3a (a/a,

CaENG1/CaENG1) 為 a-type mating strain 之對照組，而 WT-4α、WT

WT-6α (α/α, CaENG1/CaENG1) 為 α-type mating strain 之對照組。如圖二 十一<A>所示，對照組 WT-1a、WT-2a、WT-3a (a/a, CaENG1/CaENG1) 之單一菌落的表面皆有皺摺產生，菌落外圍也不規則；而實驗組EKP2-1a、

有皺摺之現象。 mating strain 之對照組，WT-4α (α/α, CaENG1/CaENG1) 為 α-type mating strain 之對照組。如圖二十二<A>所示，對照組 WT-1a 與實驗組 EKP2-1a、

EKP2-3a、EKP2-4a、EKP2-5a、EKP2-6a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) EKP2-2α (α/α, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 在 YPD 培養基上之單一菌落 也皆為光滑平整的表面；而在solid Spider 培養基上，WT-4α 和 EKP2-2α 之單一菌落也都呈現皺摺的狀態。

之結果 (chemical susceptibility test) 依方法3.18 將各菌株依序十倍稀釋之細胞

培養基上，30 ℃培養一至兩天，觀察菌落生長之情形。如圖二十三所示，

以WT-1a (a/a, CaENG1/CaENG1) 和 WT-4α (α/α, CaENG1/CaENG1) 各 為a-type mating strain 及 α-type mating strain 之對照組。於熱感受實驗中，

將細胞培養至42 ℃一天，EKP2-3a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 較 WT-1a (a/a, CaENG1/CaENG1) 在細胞數 10⁴即有較少量的趨勢，而

EKP2-4a (a/a, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 則和對照組沒有明顯差異；在 α-type mating strain 方面，EKP2-2α (α/α, Caeng1::FRT/Caeng1::FRT) 和對 照組WT-4α (α/α, CaENG1/CaENG1) 生長結果也相似。在鹼性環境培養 下 (pH 10)，各實驗組和其對照組相比，並無明顯生長之差異。而於 1.5 M NaCl 培養下，EKP2-3a 之生長可能較 WT-1a 少，EKP2-4a 則較對照組無明顯區別。在0.1％ SDS 培養下，各菌株生長情況較差，且 α-type mating strain 生長情形較 a-type mating strain 差，而 EKP2-3a 在細胞數 10⁴開始則無生長趨勢，明顯和WT-1a 有落差；而在 0.02％ SDS 培養下和對照組相比並無顯著差異，顯示EKP2-3a 對較高濃度之 SDS 有敏感性。在其它化學藥品如Triton X-100、Tween 20、H₂O₂、DTT (dithiothreitol) 等之反應上，各突變株與對照組相比無顯著差異。而在含細胞壁染劑CFW

在文檔中探討剔除白色念珠菌ENG1之影響 (頁 58-0)