5.2 以南方點墨法及分析 RNA 表現量檢驗 Caeng1 突變株
將初步符合 PCR 結果之 CaENG1 突變株進一步以南方點墨法
(Southern blot) 檢驗，如圖十，wild-type CaENG1 allele 可偵測到約 7.6 kb 片段大小；
Caeng1 knock-out 且 SAT1 flipper 已 pop-out 之 allele 可偵測到
約4.2 kb 大小的片段；而為避免無法區分 CaENG1 rescued allele 和wild-type allele，則將 CaENG1 片段以 PCR 方式合成出來後，建構至帶 有
CaENG1 下游相似序列的 SAT1 flipper，故 rescued construct 送入白色
念珠菌並進行SAT1 flipper pop-out 後，rescued allele 會比 wild-type allele
多CaENG1 下游相似序列之片段長，如此可得約 8.0 kb 片段，而與
wild-type allele 的 7.6 kb 作區隔。將符合南方點墨法檢驗之 CaENG1 各突 變株分別命名為EHK1 (CaENG1/Caeng1::FRT)、EKG7 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)、EKP2 (Caeng1::FRT/Caeng1::FRT)、EGR (Caeng1::FRT/
CaENG1::FRT)。
此後進行各突變株 RNA 表現量之分析，萃取各菌株的 RNA，以反轉 錄酶聚合鏈反應 (RT-PCR) 檢驗各突變株 CaENG1 基因表現的情形。如 圖十一，在EHK1 及 EGR 突變株均可觀察到 RT-PCR 預期的產物大小，
即表示EGR 此突變株之 rescued allele 可順利轉錄出 CaENG1 之 RNA；
而在雙套
Caeng1 knock-out 之突變株 EKG7 及 EKP2 皆無法偵測到 RNA
的表現量，與預期中 Caeng1 突變株建構一致。5.3 CaENG1 各突變株性狀分析之探討
5.3.1 生長曲線之探討
此實驗為比較 CaENG1 各突變株於相同環境條件培養下和對照組之生 長速率的差異。對照組為野生株SC5314、JKC19 (cph1/cph1)、HLC52 (efg1/efg1) 及 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1)。由圖十二<A>可得知，在 YPD 培養液、30 ℃培養下，CaENG1 各突變株與野生株 SC5314 和 cph1 突變
及HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 呈現菌落外圍平整之酵母菌型態，無菌絲 (cph1/cph1) 生成表面皺摺之單一菌落；對照組 HLC52 (efg1/efg1) 及 HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1) 呈現菌落表面圓滑、外圍平整之酵母菌型 態；而
CaENG1 各突變株在相同環境培養下，也皆出現表面皺摺、外圍
型態不規則之單一菌落，此結果與前述實驗結果相符，剔除CaENG1，
不影響白色念珠菌形成菌絲生長的能力。但與先前發表之論文的結果有 些許落差，文中提到在含4％山羊血清之 YPD 培養基中不額外添加營養 素的情形下，Caeng1 突變株 BAU2 (Caeng1::ARG4/Caeng1::URA3) 會生 成表面皺摺之單一菌落；而
Caeng1 突變株 BAH1-1 (Caeng1::ARG4/
Caeng1::HIS1) 則出現光滑平整之單一菌落，如額外添加 uridine 的情形
下，BAH1-1 之單一菌落分別出現兩種不同情形：一為菌落表面皺摺，一 為光滑平整 (交大碩士論文 謝志豪, 2006)。至此以營養篩選標記剔除CaENG1 和以抗藥性篩選標記 SAT1 flipper 剔除 CaENG1 出現不同的性狀
結果，其建構突變株過程之差異除篩選標記可能會對白色念珠菌造成不 同的影響以外 (Lay et al., 1998)，所建構之菌株也不同，抗藥性篩選標記SAT1 flipper 是以野生株 SC5314 進行基因置換；而營養篩選標記需使用
於營養基因缺陷之菌株BWP17 (arg4/arg4 his1/his1 ura3/ura3) (Wilson etal., 1999)，又有研究指出 uridine 營養缺陷會致使白色念珠菌無毒性 (Cole
et al., 1995)，因此之後會以實驗先釐清是否為 BWP17 菌株本身為 uridine
補給所影響型態變化。5.3.4 侵犯力試驗之探討
將菌株培養至 solid Spider 培養基、37 ℃培養七天誘發白色念珠菌生長 菌絲侵入培養基，再以固定水流沖洗培養基，觀察菌落殘留之情形。如 圖十六，