行政院國家科學委員會專題研究計畫成果報告
肩部旋轉肌腱隨年齡大分子結構之改變：
一種在老鼠分子生物學之研究
Age-related Quantitative Changes in Macromolecular Composition of Rotator Cuff Tendon: A Molecular Level Study in Rat
計畫編號：NSC-89-2320-B-039-011
執行期限：88 年 8 月 1 日至 89 年 6 月 30 日
主持人：許弘昌 中國醫藥學院 物理治療學系
共同主持人：許朝添 中國醫藥學院 醫學系
沈立言 中國醫藥學院 營養學系
一、 中文摘要:
肩部旋轉肌之葡萄糖胺聚合醣之 Chondroitin sulfate 隨著年齡增加而增加， 在 36 週時達到最高量，而至 48 週時又呈 現下降之趨勢；而 Hyaluronic acid 在第 3 週即呈現高值，爾後隨年齡增加而漸減。 膠原蛋白之不可還原之交叉聯結體，則隨 年齡增加而增加，至 24 週達最高值，爾後 漸減。 關鍵詞：葡萄糖胺聚合醣，膠原蛋白之不 可還原之交叉聯結體，年齡，大白鼠，肩 部旋轉肌腱 Abstr act:Chondroitin sulfate in rotator cuff tendon increased with age. It reached the highest value in 36 week-old and then declined. The amount of Hyaluronic acid decreased with age. Hydroxyproline increased with age. It reached the highest value at the age of 24 weeks and then declined.
Keywords:
Glycosamionglycan, Hydroxyproline, age, SD Rat, Cuff tendon
二、緣由與目的
肩部旋轉肌腱處於壓迫及牽拉之環 境，也因此常造成肌腱炎斷裂，而隨著年 齡之增長，情況加劇。研究學者經解剖及 動作分析顯示大白鼠為其最佳動物模型， 因此研究其旋轉肌腱內代表對抗壓迫力量 的葡萄糖胺聚合醣，及代表對抗牽拉力量 之膠原蛋白之不可還原之交叉聯結體，來 瞭解其隨年齡變化之情形，而進一步瞭解 其病因。三、材料與方法：
本 研 究 即 對 葡 萄 糖 胺 聚 合 醣 (Glycosamioglycans)和膠原蛋 白 之不可 還 原之交叉聯結體(Non-reducible crosslinks of collagen)作定量分析。分析方法是取不同 週齡的大白鼠(3, 12, 24, 36, 48weeks SD Rat)肌腱作適當前處理，收集酵素分解液、 水解液，純化後的濾液，利用高壓液態層 析儀(HPLC)來偵測葡萄糖胺聚合醣和膠原 蛋白之不可還原之交叉聯結體，所得層析 圖再與標準曲線作對照，定其量。每組檢 品作三重覆，所得數據經 SAS 統計套裝軟 體 之 變 異 數 分 析 (analysis of variance, ANOVA) 配 合 Duncan's test 進 行 統 計 分 析。( 一 ) 葡 萄 糖 胺 聚 合 醣 ： Chondroitin sulfate and Hyaluronic acid
本測定方法參考(Matthew C. Berenson, Field T. Blevins, Anna H. K. Plass, and Kathryn G. Vogel: Proteoglycans of human rotator cuff tendons. J Orthop Res 1996; 14:518-525)
取肌腱，秤重，扣除 55 ％含水量，加 入分解液（0.05 M Sodium acetate, 5 mM Cysteine, 10 mM EDTA, 50μg/ml papain, pH5.5）以 50 mg tendon/1ml 分解液之比例
來混合。在組織研磨器中(2 ml, Sigma)研成 細粉狀懸浮液，在 65℃反應 18 小時，得分 解液。在離心機(3000 *g, 10 min, Sigma)離 心，取上清液，加入等體積的 1/15 M phosphate buffer pH7.4 和 0.15 M NaCl 來 稀釋。
自行充填 0.3 ml Diethylaminoethyl cellulose (DE-52, pre-swollen; Whatman)管 柱，以 20 ml 0.02 M HCl 完全溼潤管柱， 再加入分解液，以 2 ml 1 M HCl 沖出 Chondroitin sulfate 和 Hyaluronic acid，收集 濾液後，注入 HPLC 中偵測得層析圖，如 圖(一)，再與標準曲線(Chondroitin sulfate ─9, 18, 27μg; Hyaluronic acid─3.2, 6.4, 9.6μg)作對照，求出檢品之含量，將各組 數據經 SAS 統計套裝軟體之變異數分析 (analysis of variance, ANOVA) 配 合 Duncan's test 進行統計分析，得表一之結 果。
HPLC 偵測條件如下，流動相：1/15 M phosphate buffer (pH7.4) ，0.15 M NaCl， 過濾脫氣。管柱: Shodex Af pak ARC─894 加溫至 35 ℃，流速: 0.5 ml/min，偵測器: UV detector J-7400，280 nm (Hitachi) ， 積分儀：D-2500 Chromato-Integrator (Hitachi) (二)膠原蛋白之不可還原之交叉聯結 體: Hydroxyproline 本測定方法參考(Douglas J. Horgan, Neville L. King, Lyndon B. Kurth, and Ronald Kuypers: Collagen crosslinks and their relationship to the thermal properties of calf tendons. Arch Biochem1990; 281(1): 21-26.) 取肌腱秤重，扣除 55 ％含水量，浸在 適量的 0.5 M NaCl ，4 ℃ 24 小時後，用 4 ℃二次水沖洗肌腱，加入水解液 6 N HCl(320μl/mg tendon)，至於密封分解管 中，抽成真空，於 110 ℃反應 24 小時，待 水解液溫度降至室溫後，以 0.45 μm 無菌 濾膜（Lida No.9003-10）過濾，所得濾液， 注入 HPLC 中偵測得層析圖，如圖(二)，再 與標準曲線(Hydroxyproline─1, 2, 5nmole) 行統計分析，得表二之結果。 HPLC 偵測條件如下，流動相：A Solvent 是 20 mM NH4Cl，5 mM l-octane sulfonic acid，pH3.5，配製而成在過濾脫 氣。Ｂsolvent 是 75 % Acetonitrile 加 25 % A solvent 配製而成。管柱: Purospher RP-18 endcapped (5μm)。流速:1 ml/min。偵測器: UV detector J-7400，250 nm (Hitachi)。積分 儀：D-2500 Chromato-Integrator (Hitachi)
四、結果與討論:
( 一 ) 葡 萄 糖 胺 聚 合 醣 ： Chondroitin sulfate and Hyaluronic acid.分析 結果，如表一 發現 Chondroitin sulfate 在 3 週大白鼠含量最少，12 週之含 量多於 3 週，24 週之含量多於 12 週，但都 不具統計學上之顯著性差異 (p<0.05)。而 24 週之含量多於 3 週，則具統計學上之顯 著性差異 (p<0.05)。到 36 週時量最多，到 48 週時，則有減少之現象。而 Hyaluronic acid 在 3 週時量最大，24, 36, 48 週則漸減 與 3 週之含量比較則具統計學上之顯著性 差異 (p<0.05)。比較 Chondroitin sulfate 和 Hyaluronic acid 在各組不同年齡的大白鼠 肌腱中的含量，前者又比後者量多。 在 檢 測 Hyaluronic acid 時 ， 發 現 Hyaluronic acid 易裂解，放置太長的時間， 所檢測的量即劇減(數據未顯示)。所以， 在樣品處理時，當注意時間之控制。 (二)膠原蛋白之不可還原之交叉聯結 體: Hydroxyproline 由表二之結果顯示，Hydroxyproline 在 3 週與 12 週大白鼠中之含量，不具統計學 上之顯著性差異 (p<0.05)，但由平均數值 來看，則有含量略增之情形。而 12 週至 24 週，Hydroxyproline 的量，有極明顯增加的 現象且達到統計上顯著性差異(p<0.05)。 Hydroxyproline 在 24 週大白鼠達最高含 量。 36 週大白鼠中 Hydroxyproline 量，大 於 3 週、12 週之量，但少於 24 週大白鼠之
年齡的增長而增加，到 24 週是達到顛峰。
五、計劃成果自評:
本年度的實驗參考不同的相關文獻， 結果與上年度定性及半定量之結果類似， 顯示肌腱內大分子成分隨年齡改變之情形 相同。而在操作儀器方法成熟度、準確度 還需不斷練習；在分析檢品條件、儀器偵 測條件設定上，並不斷嚐試，確定可行性、 穩定性及再現性上花費許多時間，力求數 據的準確性，而飼養的老鼠隻數不足，檢 品量不夠，只定量兩類成分。由經驗得知， 可在未來的計劃中，可改進此缺失，作更 完整的定量分析。六、參考文獻:
Brown AH: Determination of pentose in the presence of large quantities of glucose. Arch Biochem 1946;11:269-78.
Midura RJ, salustri A, Calabro A, Yanagishita M, Hascall VC: High-resolution separation of disaccharide and oligosaccharide alditols from chondroitin sulphate, dermatan sulphate and hyaluronan using CarboPac Pal chromatography. Glycobiology 1994; 4: 333-42.
Deutsch AJ, Midura RJ, Plaas AHK: Structure of chondroitin sulfate on aggrecan isolated from bovine tibial and costochondral growth plate. J Orthop Res 1995; 13: 230-39.
Kivirikko K, Laitinen O, Prockop DJ: Modification of a specific assay for hydroxyproline in urine. A nal Biochem 1967; 19: 249-55.
Robins SP: Analysis of the crosslinking components in collagen and elastin. Methods Biochem. Anal 1982; 28: 329-79.
Matthew C. Berenson, Field T. Blevins, Anna H. K. Plass, and Kathryn G. Vogel: Proteoglycans of human rotator cuff tendons. J Orthop Res 1996; 14:518-525.
