棲地零碎化對諸羅樹蛙族群遺傳結構影響之探討

全文

(1)表一、諸羅樹蛙的採集地點與樣本數。流域名稱. 採集地點. 樣本數. 斗六石榴班. 10. 斗六溝霸. 8(1)*. 斗南阿丹里. 10. 斗南將軍崙. 15(1)*. 斗南明昌里. 5. 古坑荷包山合計. 5 53 隻. 大林上林村. 6. 大林中林里. 6. 北港溪南岸支流（葉子寮溪、中林溪、. 大林慈濟醫院. 6. 大林水碓. 6. 三疊溪）. 大林排路里. 3. 民雄葉子寮合計. 8 35 隻. 民雄秀林村. 7(1)*. 竹崎義和村. 8. 嘉義市興華中學合計. 3 18 隻. 麻豆國小. 4. 總爺糖廠合計. 10 14 隻. 總計. 120(3)*隻. 北港溪北岸支流（虎尾溪、大湖口溪）. 朴子溪（牛稠溪）. 曾文溪（麻豆）. ( ) *內為雌蛙的數量. 29.

(2) 表二、諸羅樹蛙 COX1、cyto b 與 D-loop 序列資料。鹼基頻率(百分比). 變異點類型鹼基鹼基替換顛換. 變異位點第二第三位點位點. 基因片段. 長度. T. C. A. G. COX1. 834. 33.4. 25. 24.6. 17. 3. 2. 1. 0. 4. 5. cyto-b. 905. 31.9. 27.1. 26.8. 14.2. D-loop 合計. 798. 28.6. 22.9. 32.1. 16.4. 2537. 31.4. 25.1. 27.7. 15.8. 4 4 11. 0 0 2. 0 2 3. 0 0 0. 4 2 10. 4 4 13. 第一位點. 小計. 表三、諸羅樹蛙 COX1 部分序列，採集地點、樣本數、單基因型、單基因型歧異度與核苷酸歧異度數值。採集地點. Haplotype number. 採集樣本數. Haplotype diversity. Nucleotide diversity. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流朴子溪曾文溪（麻豆）. 53 35 18 9. 1(A1) 2(A1B1) 1(A1) 1(C1). 0 0.19212 0 0. 0 0.00023 0 0. 合計. 120. 3. 0.208. 0.00078. 表四、諸羅樹蛙 cyto b 部分序列，採集地點、樣本數、單基因型、單基因型歧異度與核苷酸歧異度數值。採集地點. Haplotype number. 採集樣本數. Haplotype diversity. Nucleotide diversity. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流朴子溪曾文溪（麻豆）. 53 35 18 9. 4(A2B2C2D2) 4(A2B2C2D2) 2(A2B2) 1(E2). 0.53774 0.48739 0.29412 0. 0.00111 0.00061 0.00033 0. 合計. 120. 5. 0.715. 0.00133. 30.

(3) 表五、諸羅樹蛙 D-loop 部分序列，採集地點、樣本數、單基因型、單基因型歧異度與核苷酸歧異度數值。採集地點. 採集樣本數. Haplotype number. Haplotype diversity. Nucleotide diversity. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流朴子溪曾文溪（麻豆）. 53 35 18 9. 1(A3) 2(A3B3) 2(A3B3) 1(C3). 0 0.21390 0.29412 0. 0 0.00027 0.00037 0. 合計. 120. 3. 0.403. 0.00091. 表六、諸羅樹蛙合併序列後，採集地點、樣本數、單基因型、單基因型歧異度與核苷酸歧異度數值。採集地點. 採集樣本數. Haplotype number. Haplotype diversity. Nucleotide diversity. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流朴子溪曾文溪（麻豆）. 53 35 18 9. 4(ABCD) 5(ABCDF) 2(CE) 1(G). 0.53774 0.51429 0.29412 0. 0.00039 0.00038 0.00023 0. 合計. 120. 7. 0.799. 0.00101. 31.

(4) 表七、諸羅樹蛙不同地區單基因型分佈表。單基因型採集地點. 隻數小計. 單基因型合計. A. B. C. D. E. F. G. 斗六石榴班. 6. 4. 0. 0. 0. 0. 0. 10. 2. 斗六溝霸. 2. 5. 0. 1. 0. 0. 0. 8. 3. 斗南阿丹里. 6. 3. 1. 0. 0. 0. 0. 10. 3. 斗南將軍崙. 6. 9. 0. 0. 0. 0. 0. 15. 2. 斗南明昌里. 1. 4. 0. 0. 0. 0. 0. 5. 2. 古坑荷包山. 1. 4. 0. 0. 0. 0. 0. 5. 2. 北港溪北部支流小計. 22. 29. 1. 1. 0. 0. 0. 53. 4. 大林上林村. 1. 0. 3. 0. 0. 2. 0. 6. 3. 大林中林里. 0. 0. 4. 1. 0. 1. 0. 6. 3. 大林慈濟醫院. 1. 1. 3. 0. 0. 1. 0. 6. 4. 大林水碓. 1. 0. 5. 0. 0. 0. 0. 6. 2. 大林排路里. 0. 0. 3. 0. 0. 0. 0. 3. 1. 民雄葉子寮. 1. 1. 6. 0. 0. 0. 0. 8. 3. 北港溪南部支流小計. 4. 2. 24. 1. 0. 4. 0. 35. 5. 民雄秀林村. 0. 0. 0. 0. 7. 0. 0. 7. 1. 竹崎義和村. 0. 0. 0. 0. 8. 0. 0. 8. 1. 嘉義市興華中學. 0. 0. 3. 0. 0. 0. 0. 3. 1. 朴子溪小計. 0. 0. 3. 0. 15. 0. 0. 18. 2. 麻豆國小. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 4. 4. 1. 總爺糖廠. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 10. 10. 1. 麻豆小計. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 14. 14. 1. 總計. 26. 31. 28. 2. 15. 4. 14. 120. 7. 32.

(5) 表八、利用 COX1 部分序列，估算諸羅樹蛙族群之間FST 值（族群分化指數）。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流. 0.071. 朴子溪. 0.000. 0.071. 曾文溪（麻豆）. 1.000. 0.977. 1.000. 表九、利用 cyto b 部分序列，估算諸羅樹蛙族群之間 FST 值。採集地點. 北港溪北岸北港溪南岸支流支流. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流. 0.239. 朴子溪. 0.416. 0.432. 曾文溪（麻豆）. 0.840. 0.902. 0.932. 表十、利用 D-loop 部分序列，估算諸羅樹蛙族群之間 FST 值。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流. 0.091. 朴子溪. 0.824. 0.664. 曾文溪（麻豆）. 1.000. 0.966. 0.962. 表十一、合併序列後，估算諸羅樹蛙族群之間 FST 值。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 0.212 0.591 0.951. 0.518 0.952. 朴子溪. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流朴子溪曾文溪（麻豆）. 33. 0.971. 曾文溪（麻豆）.

(6) 表十二、利用 COX1 部分序列，估算諸羅樹蛙族群間基因交流值(Nm)。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流. 6.5. 朴子溪. 0. 6.5. 曾文溪（麻豆）. 0. 0.01. 0. 表十三、利用 cyto b 部分序列，估算諸羅樹蛙族群間基因交流數值(Nm)。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流. 1.59. 朴子溪. 0.7. 0.66. 曾文溪（麻豆）. 0.1. 0.05. 0.04. 表十四、利用 D-loop 部分序列，估算諸羅樹蛙族群間基因交流數值(Nm)。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流. 5. 朴子溪. 0.11. 0.00012. 曾文溪（麻豆）. 0. 0.00491. 0.00478. 表十五、合併序列後，估算諸羅樹蛙族群之間基因交流數值(Nm)。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 朴子溪. 北港溪北岸支流北港溪南岸支流. 1.86. 朴子溪. 0.35. 0.46. 曾文溪（麻豆）. 0.03. 0.03. 34. 0.02. 曾文溪（麻豆）.

(7) 表十六、利用 COX1 序列，估算諸羅樹蛙族群間 Dxy 值與族群內π值。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 北港溪北岸支流. 0. 北港溪南岸支流. 0.00012. 0.00023. 朴子溪. 0. 0.00012. 0. 曾文溪（麻豆）. 0.00478. 0.00491. 0.00478. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 0. 表十七、利用 cyto b 序列，估算諸羅樹蛙族群間 Dxy 值與族群內π值。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 北港溪北岸支流. 0.00111. 北港溪南岸支流. 0.00113. 0.00061. 朴子溪. 0.00123. 0.00083. 0.00033. 曾文溪（麻豆）. 0.00346. 0.00313. 0.00239. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 0. 表十八、利用 D-loop 序列，估算諸羅樹蛙族群之間 Dxy 值與族群內π值。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 北港溪北岸支流. 0. 北港溪南岸支流. 0.00015. 0.00027. 朴子溪. 0.00104. 0.00095. 0.00037. 曾文溪（麻豆）. 0.00376. 0.00391. 0.0048. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 0. 表十九、合併序列後，估算諸羅樹蛙族群之間 Dxy 值與族群內π值。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 北港溪北岸支流. 0.00039. 北港溪南岸支流. 0.00049. 0.00038. 朴子溪. 0.00077. 0.00064. 0.00023. 曾文溪（麻豆）. 0.00399. 0.00396. 0.00394. 35. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 0.

(8) 表二十、利用 COX1 部分序列，估算諸羅樹蛙族群內與族群間的遺傳距離。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 北港溪北岸支流. 0. 北港溪南岸支流. 0.0014. 0.00025. 朴子溪. 0. 0.00014. 0. 曾文溪（麻豆）. 0.0048. 0.00494. 0.0048. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 0. 表二十一、利用 cyto b 部分序列，估算諸羅樹蛙族群內與族群間的遺傳距離。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 北港溪北岸支流. 0.00111. 北港溪南岸支流. 0.00113. 0.00061. 朴子溪. 0.00123. 0.00083. 0.00033. 曾文溪（麻豆）. 0.00347. 0.00314. 0.0024. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 0. 表二十二、利用 D-loop 序列，估算諸羅樹蛙族群內與族群間的遺傳距離。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 北港溪北岸支流. 0. 北港溪南岸支流. 0.00015. 0.00027. 朴子溪. 0.00105. 0.00095. 0.00037. 曾文溪（麻豆）. 0.00377. 0.00392. 0.00482. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 0. 表二十三、合併序列後，估算諸羅樹蛙族群內與族群間的遺傳距離。採集地點. 北港溪北岸支流. 北港溪南岸支流. 北港溪北岸支流. 0.0004. 北港溪南岸支流. 0.00049. 0.00038. 朴子溪. 0.00077. 0.00064. 0.00023. 曾文溪（麻豆）. 0.00401. 0.00392. 0.00395. 36. 朴子溪. 曾文溪（麻豆）. 0.

(9) 表二十四、四條流域採樣區諸羅樹蛙遺傳結構(AMOVA)。 Source of variation. d. f.. Sum of squares. Variance. Percentage of variation. Φ. p. Among groups. 3. 20.333. 0.25116. 51.88. 0.519 (ΦCT). 0. Among populations within groups. 13. 5.007. 0.02664. 5.5. 0.114 (ΦSC). <0.2. Within populations. 103. 20.217. 0.20629. 42.61. 0.579 (ΦST). 0. Total. 119. 50.833. 0.48994. 37.

(10) 表二十五、諸羅樹蛙 Nested contingency analysis 的統計結果。 Clade. Permutation Chi-square Statistic. Probability. 1-1. 47.720. 0. 1-2 1-3 2-1 3-1. 1.517 19 72.884 114. 0.321 0 0 0. 表二十六、GEODIS 計算諸羅樹蛙 Dc、Dn 、I-T Dc 和 I-T Dn 數值。 Haplotypes. 1-step Clades. No.. Dc. Dn. BT. 3.99S. 12.19L. CI. 4.55S. 12.67L. I-T. 0.5611. 0.48 L. EI. 0S. 2.91S. FT. 0. 7.27 L. I-T. 0. -4.36 S. 2-step Clades. No.. Dc. Dn. 1-1T. 12.79 S. 12.23 S. 1-2I. 8.40 S. 11.48 S. 1-3 T. 4.16 S. 15.53 L. I-T. -2.29 S. -1.55 S. No.. Dc. Dn. 2-1 T. 14.05 S. 18.53 S. 2-2 T. 0S. 58.6 L. (I)：clade 於樹狀圖位置是 interiors (T)：clade 於樹狀圖位置是 tips (L)：統計上為顯著性大 (S)：統計上為顯著性小. 38.

(11) 表二十七、諸羅樹蛙 NCA 使用 Templeton（1998）key 檢索結果。 Clade. Chain of Inference. Final Inference. Distribution. 1-1. 1-2-3-5-6-too few clade to determine concordance. Insufficient genetic resolution to discriminate between range expansion/colonization and restricted dispersal/gene flow. 北港溪北岸北港溪南岸. 1-3. 1-2-3-4-9-NO. Past Fragmentation. 北港溪南岸朴子溪. Past Fragmentation. 北港溪北岸北港溪南岸朴子溪. Past Fragmentation. 北港溪北岸北港溪南岸朴子溪麻豆. 2-1. Total. 1-2-3-5-15-NO. 1-2-3-5-15-NO. 39.

(12) 表二十八、台灣區已發表兩棲爬蟲生物種內(intra-species)遺傳距離比較。綱名兩棲綱. 基因片段. 最大遺傳距離. 作者. Rhacophorus taipeianus. Cyto b、D-loop. 0.022. 楊，1994. Rhacophorus moltrechti Chirixalus eiffingeri. 12S、16S rRNA. 0.025 0.082. 葉, 1997 黃，2002. 0.004. ＊. 12Sr RNA Cyto b COX1、Cyto b. 0.119 0.165 0.16. Cyto b Cyto b. 0.035 0.019 0.018 0.025. 蔡，1999 蔡，1999 郭，2002 林，2003 林，2003 林，2003 林，2003. 物. 種. D-loop COX1 Cyto b、. Rhacophorus arvalis. D-loop. 爬蟲綱. Gecko hokouensis Gecko hokouensis Sphenomorphus taiwanensis Takydromus stejnegeri Takydromus hsuehshanensis Takydromus hsuehshanensis Ophisaurus harti ＊本研究結果. COX1 Cyto b. 40.

(13) 北港溪北岸支流 N=53. 北港溪南岸支流 N=35 隻. 朴子溪流域 N=18 隻. N. 麻豆 N=14 隻. 圖一、諸羅樹蛙族群取樣地點圖（每個圓圈代表 5~10 隻個體）。. 41.

(14) RH1. ND2. Trp. Ala. Asn. Cys. Try. COX1. RH2. 圖二、粒線體 COX1 引子設計的相關位置圖。 RH1：COX 1（L）. 42. RH2：COX1（H） . COX2.

(15) RH3. ND6. Glu. RH5. Cytochrome b. RH4. Thr. Pro. RH6. 圖三、粒線體 cyto b 引子設計的相關位置圖。 RH3：cyto b（L）. RH4：cyto b（H）. RH5：cyto b（L）. RH6：cyto b（H）. 43. D-loop.

(16) RH7. Cytochrome b. Thr. Pro. D-loop. RH8. 圖四、粒線體 D-loop 引子設計的相關位置圖。 RH7：D-loop（L）. *RH8：D-loop（H）. *楊（1994）所設計的引子。. 44.

(17) 北港溪北岸支流 N＝53. 北港溪南岸支流 N＝35. 朴子溪支流 N＝18. 麻豆 N＝14 N. 圖五、四條流域諸羅樹蛙單基因型出現頻率。 45.

(18) B. C. D. A A. G 北港溪北岸. E. 北港溪南岸朴子溪. F. 麻豆. 圖六、諸羅樹蛙 A-G 七種單基因型的 Minimum spanning network （最小關聯網狀樹狀圖），每個圓點代表一個突變的改變，圓點內的顏色為族群分佈地區。. 46.

(19) 3-1 2-1. 2-2. 1-1 B. C. 1-2 D. A A. 1-4. G. E A B C D. 1-3 F. E F G. 共有基因型. 地區獨特單基因型. 圖七、諸羅樹蛙根據七種單基因型所建構 one-step（1-1, 1-2, 1-3,1-4）、 two-step（2-1, 2-2）與 three-step（3-1）的 nested clade。 A, B, C, D 為共有單基因型，E, F, G 為地區獨特單基因型。. 47.

(20) 附錄一：萃取 DNA 流程。 1.. 將野外剪下指頭組織切碎置於 ddH20、Proteinase K、digestion buffer(郭，2002) 試管中，置於 56℃乾浴槽加熱反應，隔夜再取出。. 2.. 隔天加入等體積的 Licl 與二倍量的 Chloroform，放入垂直轉輪中轉動 30 分鐘，震盪均勻後進行離心，離心機的設定值為轉速 13000RPM、10℃、10 分鐘。. 3.. 取出上清液，再加入兩倍量體積的 Chloroform，震盪均勻後離心，離心機的設定值為 13000 轉、10℃、10 分鐘。. 4.. 取出上清液，加入 2.5 倍體積的 100%酒精後，將試管置入-80℃冰箱，進行酒精沈澱 20 分鐘。. 5.. 取出試管離心十分鐘，離心機的設定值為轉速 13000RPM、10℃、12 分鐘，流程完畢倒掉上清液。. 6.. 加入等體積 70%酒精，進行離心，離心機的設定值為轉速 13000RPM、10 ℃、10 分鐘。. 7.. 倒掉上清液之後，倒扣試管在通風櫥隔夜放置，以乾燥沈澱 DNA。. 8.. 隔天將試管的 DNA 溶於 50μl ddH20，再放入-20℃冰箱保存。. 9.. 取出 3μl 的 DNA，置入已加上溴化乙定螢光染色劑（0.5mg/ml EtBr）的洋菜膠體，進行 30 分鐘電泳後取出，使用 QUANTITY ONE 膠體照相系統，檢視 DNA 品質。. 48.

(21) 附錄二：PCR 流程。根據 GeneBank 中的相近物種 DNA 序列資料，包括 Buergeria Buergeria、 Rhacophorus moltrechti、Rhacophorus taipeianus，利用 FPCR（fast PCR）軟體設計寡核甘酸引子，進行增幅的片段包括細胞色素 c 次單元一（cytochrome oxidase c subunit 1，COX1）、細胞色素 b （Cytochrome b，cyto b）與控制區（displacement loop，D-loop）部分片段。在這三段基因周邊選取保守區段約 20mer 的寡核甘酸引子如圖二、三、四。 4 對引子的 PCR 反應流程皆相同，先進行 94℃、3 分鐘使 DNA 雙股變性解開（denature），接著進行 35 個循環，循環過程如下：94℃、30 秒，使 DNA 雙股變性解開；56.2℃、40 秒，使 DNA 與 Primer annealing；72℃、2 分鐘，進行 DNA 的延伸工作（extension）。35 個循環結束後，再進行 72℃、10 分鐘，使 DNA 的延伸工作完成，反應完畢產物置於 4℃冰箱保存。將 PCR 產物進行電泳定序，使用加入溴化乙定螢光染色劑的洋菜膠體，以電壓 100 伏特進行 TBE 電泳 30 分鐘，在紫外光燈下拍照解析，確定 PCR 的產物與長度片段，最後利用 ABI377 自動定序儀（PE Corp.）進行雙股序列定序。 DNA 定序後使用 SEQUENCHER 4.0.5（Gene Codes Corporation, 1999）進行雙股的排序與合併校正，修改過的序列在 NCBI （ National Center for Biotechnology Information）進行 Blast 比對，以確認序列位置，所得 haplotype 將在 Gene bank 進行 submitted。. 49.

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