流動注入分析訊號空時差異之進階研究

國立交通大學

應用化學研究所

碩士論文

流動注入分析訊號空時差異之進階研究

Comprehensive Investigation of The Difference Between

The Spatial and Temporal Signals in Flow Injection

Analysis

研 究 生:吳印從

指導教授:余 艇 博士

流動注入分析訊號空時差異之進階研究

Comprehensive Investigation of The Difference Between

The Spatial and Temporal Signals in Flow Injection

Analysis

研究生 ：吳印從 Student：Yin-Tsung Wu 指導教授：余 艇 博士 Advisor：Dr. Tiing Yu 國立交通大學 應用化學研究所 碩 士 論 文 A Thesis

Submitted to Institute of Applied Chemistry National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master of Science

In

Applied Chemistry June 2009

Hsinchu, Taiwan, Republic of China.

流動注入分析訊號空時差異之進階研究

學生: 吳印從 指導教授: 余 艇 國立交通大學應用化學研究所

摘要

一般小分子樣品在流動注入分析系統中，經由單通道偵測器 所紀錄之隨流析時間得到的訊號圖形(訊號強度 v.s. 時間)常呈現拖 尾的類高斯波形。根據本實驗室近年來之研究，若使用多通道偵測器 觀察其空間的分布(訊號強度 v.s 樣品位置)，可以發現其空間分布的 情形為一高斯對稱的波形。這兩種利用不同觀測方式(單通道 v.s 多 通道)而得到的兩種波形之間的差異即為空時差異。 以奈米粒子當做流動注入分析系統的樣品時，其本身的單通道偵 測器所記錄的訊號波形是非常特別的「雙峰」波形，因此本實驗想藉 由多通道偵測器來觀測，是否空時差異的情形也會存在於奈米粒子的 情況當中，並將奈米粒子與小分子樣品(tatrazine)兩者之空時差異情形 進行比較。除此之外，本實驗也利用了相對標準偏差當作波形延散情 形的指標，來對於波形的延散情形之空時差異進行探討。實驗的結果 發現，兩種不同觀測方式得到的奈米粒子波形形狀的確存在著明顯差 異的情形，但是此兩波形其相對標準偏差值卻是相似的。當時圖訊號 的相對標準偏差為 19.57%時，其波形還是以「雙峰」並存波形的形 式呈現，然而以多通道偵測器所觀測到的相對應訊號，其相對標準偏 差為 22.25%時，卻已呈現相當高斯的波形。除此之外，本實驗還發 現，時圖波形的相對延散（亦即相對標準偏差）情形與空時差異有很

大的關係，當其相對延散的情形越大，則此條件下之兩者波形形狀的 空時差異程度會越大，反之則越小，因此證明了相對延散的情況是影 響波形形狀空時差異的一項重要的指標。並且藉由實驗的結果找到相 對延散情形與各實驗參數(如：樣品擴散係數、管長等)的關係式。

Comprehensive Investigation of The Difference Between

The Spatial and Temporal Signals in Flow Injection

Analysis

Student: Yin-Tsung Wu Advisor : Tiing Yu

Institute of Applied Chemistry National Chiao Tung University

Abstract

The temporal signals of well diffusive solutes (typical small molecules) monitored using conventional single-channel detectors are usually Gaussian-like profiles with apparent tailing in flow injection analysis (FIA). According to the previous researches in our laboratory, the spatial signals monitored using the multi-channel detector were nearly Gaussian and symmetric under typical FIA conditions. The shape difference between the temporal and spatial profiles appeared due to the way how the measurements were conducted. The difference thus occurs is called spatial-temporal difference.

It has been reported that the temporal signals of nanoparticles in FIA emerged usually as double-humped shapes, including so-called convection and diffusion peaks. In this study, we examined how the difference between the temporal and spatial profiles of tartrazine and Ag nanoparticles could come out using the laboratory-made multi-channel

detector. The results showed a considerable difference between the temporal and spatial profiles for both solutes. However, their relative standard deviations, the parameter to describe the solute dispersion behaviors, turned out to be quite similar. The solute profile, acquired using the single-channel detection, was found to show somewhat double-hump character for Ag nanoparticles when the RSD was nearly 19.57%. However, the corresponding spatial signal of the same sample remained Gaussian with the RSD of 22.25%. In addition, the spatial-temporal difference became greater as the dispersion (RSD) of the temporal profile became larger. The dispersion was thus proved one of the major factors to affect the spatial-temporal difference. According to the results obtained using multi-channel detection, we also derived the relation between the signal RSD and other experimental factors including the molecular diffusion coefficient, and the tube length.

謝誌

耶~超開心的，終於畢業了!懸於心中的那塊大石總算得以卸下來 了。這兩年來的一切點點滴滴，就在此時此刻劃下了句點，心中其實 覺得滿不捨的。回想一路走來，受到了許多人的幫助，沒有你們的幫 助，就沒有今天的這些成果。 首先最主要的當然是要感謝我的恩師余艇老師，帶領我進入了分 析化學這個領域，並不時地給予我實驗及研究上的指導，讓我能順利 將研究完成；再來要感謝口試委員白書禎教授和王念夏教授，能在百 忙之中抽空來參加我的口試並對於我研究上及論文上的內容提出糾 正和指點，使我的論文內容和研究成果更加完美。 謝謝一直以來都很照顧我的淑慧學姊，每當我實驗上或是心靈上 遇到迷惘和疑惑時，總是能給即時地鼓勵我並提出建議，讓我能夠再 次的鼓起勇氣繼續克服我所遇到的困難。也謝謝經緯學長，總是能夠 幫助我解決實驗上或生活上所有遭遇到的難題，並常常找我們這些學 弟妹們出去聚餐、打球，讓實驗室裡的氣氛可以更加融洽，希望學長 也可以如期地順利畢業。也要感謝實驗室的同學婉茹以及學弟妹 Danny、伶宜和阿國，由於你們的開朗活潑，為平常的實驗室生活帶 來了許多歡樂，祝婉茹日後工作和學弟妹的學業及研究可以順利。還 有要感謝隔壁實驗室的云琦和雅柔，在修課的過程中受到了你們不少 的幫忙和照顧，也謝謝其他大學同學任逸、家誌、傑哥、查斯特、邦 邦、貓王、小白…等，彼此之間的互相幫忙和扶持。 最後要感謝我的父母親和家人及女朋友，由於你們的支持鼓勵和 體諒，才讓我能夠專心於學業和研究。

目錄

中文摘要

...ii

英文摘要

... iv

謝誌

... vi

圖目錄

... ix

表目錄

...xii

第一章

序論 ... 1

1.1 流動注入分析法簡介 ...1 1.2 奈米粒子的流動訊號波形 ...2 1.3 空時差異...4 1.4 研究動機與目標...6

第二章

文獻回顧 ... 8

2.1 奈米粒子在流動注入分析系統的波形成因 ...8 2.2 τ 值與波形的關係...10 2.3 理論板數(N)與波形的關係...11

第三章

實驗 ... 15

3.1 藥品...15 3.2 實驗裝置...15 3.3 儀器組裝...16

3.4 樣品及載液的選擇與製備 ...19 3.5 實驗參數的測量...23 3.6 電腦操作介面設定 ...24 3.7 實驗流程...27

第四章

結果與討論 ... 28

4.1 數據處理...28 4.2 波形參數指標...28 4.2.1 基本參數...29 4.2.2 進階參數...30 4.3 相對標準偏差與波形的關係 ...32 4.4 數據結果與討論...34 4.4.1 實驗條件...35 4.4.2 時圖波形變化趨勢...35 4.4.3 空圖波形變化趨勢...48 4.4.4 空時差異...59

第五章

結論 ... 68

參考文獻

... 70

附錄

A 符號定義表... 72

圖目錄

圖 1 典型流動注入分析系統 ...1 圖 2 流動注入分析法波形及其指標參數 ...2 圖 3 奈米粒子和一般樣品在流動注入分析系統中產生的波形...3 圖 4 不同粒徑的金奈米粒子的流動注入分析波形 ...4 圖 5 空圖和時圖的定義 ...6 圖 6 層流造成的流場 ...8 圖 7 τ 值對於波形的影響(電腦模擬之結果)...11 圖 8 螺旋管柱系統中離心力(F)對於流場產生的影響...12 圖 9 驗裝置示意圖 ...17 圖 10 濾片的穿透波長與燈源的放射波長 ...18 圖 11 管路纏繞示意圖...19 圖 12 tatrazine 的結構與 UV 光譜圖 ...21 圖 13 銀奈米粒子的掃描式電子顯微鏡的圖和粒徑分布圖以及 UV 光譜圖...22 圖 14 電腦操作介面圖 ...25 圖 15 積分法求波形面積的示意圖 ...29 圖 16 h1 和 h2 的示意圖...31 圖 17 tatrazine 在不同體積流速，相同偵測位置的時圖波形。...37

圖 18 銀奈米粒子在不同體積流速，相同偵測位置的時圖波形。..38 圖 19 tatrazine 在不同體積流速下的時圖...40 圖 20 銀奈米粒子在不同體積流速下的時圖 ...42 圖 21 tatrazine 在不同體積流速下的時圖相對標準偏差與偵測位置 的關係...44 圖 22 銀奈米粒子在不同體積流速下的時圖相對標準偏差與偵測位 置的關係...46 圖 23 tatrazine 在不同體積流速下，估算質量中心位置在附近的空圖 波形。...50 圖 24 銀奈米粒子在不同體積流速下，估算質量中心位置在附近的空 圖波形。...51 圖 25 tatrazine 在不同體積流速下的空圖...53 圖 26 銀奈米粒子在不同體積流速下的空圖 ...55 圖 27 tatrazine 在不同體積流速下的時圖相對標準偏差與質量中心 位置的關係...57 圖 28 tatrazine 在不同體積流速下的時圖(左)與其相對應的空圖(右) ...60 圖 29 銀奈米粒子在不同體積流速下的時圖(左)與其相對應的空圖 (右)...62

表目錄

表 1 曝光時間對照表 ...26 表 2 tatrazine 在不同體積流速，相同偵測位置的時圖波形相關參數 ...37 表 3 銀奈米粒子在不同體積流速，相同偵測位置的時圖波形相關參 數...38 表 4 tatrazine 在不同體積流速下，估算質量中心位置在附近的空圖 波形相關參數...50 表 5 銀奈米粒子在不同體積流速下，估算質量中心位置在附近的空 圖波形相關參數...51

第一章 序論

1.1 流動注入分析法簡介

流動注入分析法(Flow Injection Analysis, FIA)是在 1975 年，由 Ruzicka 和 Hansen[1]提出的一種可以在有限時間內完成大量樣品數 檢測的分析方法，該系統可以將傳統的手動操作步驟，例如加入樣 品、試劑、混合反應、送入偵測器等過程，整合在一個預先設計好的 管路中依序完成，達到自動化分析，既方便又省時。因此流動注入分 析法已被廣泛的應用在各種領域的檢測上。 一個最簡單的單線流動注入分析系統(single-line FIA)如圖 1 所 示，基本架構包含幫浦(pump)、樣品注入閥(sample injection valve)、 管路迴圈(coil tube)，以及一個偵測器(detector)。 圖 1 典型流動注入分析系統 基本架構包含幫浦(P)；樣品注入閥(S)；管路迴圈(C)；偵測器(D)。 幫浦推動管路中的載液(carrier)與試劑(reagent)，在樣品注入後順著管 路向前移動，經過管路迴圈後，送入偵測器測得訊號。流經偵測器的 樣品被記錄器以「時間對訊號值」的方式記錄，可以得到一組時間對 應訊號強度的波形。最常見的波形如圖2，此波形通常為拖尾單峰形

式的類高斯波形，根據這個波形，可訂出四個指標參數：波高(h)、 波寬(Wt)、面積(At)、波峰位置(tp)。

圖 2 流動注入分析法波形及其指標參數

此圖為波形示意圖，通常會觀察到波峰形狀呈現不對稱之拖尾的特徵。利用此波 形可訂出四種波形指標參數：波高(h, AU)、波寬(Wt, s)、面積(At, AU-s)、波峰位 置(tp, s)。 1.2 奈米粒子的流動訊號波形 奈米粒子在流動注入分析系統中產生的訊號波形常會以「雙峰波 形」的形式被觀察到，與一般常見到的單峰形式的類高斯波形的流動 注入分析訊號相當不同(如圖 3)。這個現象最早由 Fischer 等人所研究 [2]，Fischer 將此波形的兩個波峰分別加以命名，出現時間較早的波 峰為convection peak，而較晚出現的波峰為 diffusion peak。Fischer 等 人發現，當注入的奈米粒子樣品，粒徑越大則 convection peak 的訊號 AU time h t* Wt At

圖 3 奈米粒子和一般樣品在流動注入分析系統中產生的波形

奈米粒子的波形是獨特的「雙峰波波形」，與一般樣品所生的類高斯的單峰波形

非常的不同。這兩個雙峰的名稱分別為：convection peak(出現位置和時間較早) 以及diffusion peak(出現位置和時間較晚)

強度會越強，diffusion peak 的訊號強度會越弱。反之，當樣品粒徑越 小，convection peak 的訊號強度會減弱，而 diffusion peak 的訊號強度 會增強。當粒徑小到一個程度之後，convection peak 的訊號強度會趨 近於零，整個波形會變為只有diffusion peak 存在，此波形即為一般 常見到的單峰類高斯波形，整體波形的變化趨勢如圖4。 Fischer 等 人將奈米粒子其流動注入分析系統的波形會隨奈米粒子粒徑改變的 特性，應用到預測奈米粒子的粒徑分布上。

圖 4 不同粒徑的金奈米粒子的流動注入分析波形[2]

此圖可以分為四個部份來看，首先最左邊由上而下的圖形是這些不同粒徑的粒子 其相對應的掃描式電子顯微鏡(electronic screen microscope, SEM)的圖像；第二行 的圖形為這些不同粒徑的粒子的粒徑分布圖；第三行為這些不同粒徑的粒子的 size exclusion chromatography(SEC)的層析圖，越下面的奈米粒子粒徑越大，因此 SEC 的流析時間會比較短，層析圖的波峰會比較早出現；最右邊的圖為不同粒徑 的粒子其各自相對應的流動注入分析波形，可以發現粒徑較大的奈米粒子其 convection peak 的訊號會比較強，反之，若粒徑較小的奈米粒子，其 diffusion peak 的訊號會比較強，當粒仔的粒徑小到某個程度之後，波形convection peak 的訊號 會完全消失，只剩下diffusion peak 的訊號存在，此時的波形即為一般常見到的 單峰類高斯波形。 1.3 空時差異 Pai 在 2002 年和 2007 年所發表的兩篇文獻[3,4]中點出流動注入 分析訊號所產生的空時差異的概念，由一般單通道偵測器所得的波峰

在收集訊號的同時，樣品在管內的空間分布狀態隨時間一直在改變， 使得測量結果與樣品在管路內瞬間的空間分布有一定差異，稱之為空 時差異。空時差異，是探討波形理論和其成因的一個很重要的觀念， 然而這個現象長久以來常被大家所忽略。Pai 認為，這種差異普遍地 存在於採用一般單通道偵測器的流動型系統內，不僅是流動注入分析 系統，在層析系統中也應該存在這種現象[3]，並在 2003 年提出相關 的研究[4-6]。空時差異最常見的例子是，在流動注入分析系統中利用 一般的偵測器來偵測小分子樣品時，會偵測到一個拖尾的類高斯波 形，然而此小分子樣品其空間分布情形卻是一個相當對稱的高斯波形 [7]。因此推斷以往的波形理論在忽略空時差異的情況下，如果從實 驗結果來推測樣品在管路內的變化將會產生誤差。 在這裡我們先定義：固定一個單通道偵測器的位置，隨時間來擷 取樣品通過偵測位置的訊號，所得的圖形稱為時圖，一般的偵測器都 屬於單通道偵測器。如果使用多通道偵測器，可以同時偵測大範圍的 樣品空間分布，所得的圖形稱為空圖 (圖 5)。

圖 5 空圖和時圖的定義 時 圖 的 橫 座 標 單 位 是 流 析 時 間 (time) ， 空 圖 的 橫 座 標 單 位 則 是 管 路 位 置 (length) 。 1.4 研究動機與目標 根據 Pai 的文獻[3,4]指出，由一般單通道偵測器所得到的波形訊 號(時圖波形)與其空間上的波形分布(空圖波形)有空時差異的存在。 部份文獻[9-12]也已證實，小分子樣品在 FIA 系統中確實存在空時差 異，而根據Fischer 等人的研究[2]可得知，以奈米粒子當做注入的樣 品時，在流動注入分析系統中得到的時圖偵測波形是相當特別的，因 此本研究希望觀察奈米粒子在流動注入分析系統中的空時差異，並將 此空時差異與小分子樣品所產生的空時差異情形做比較。為了想同時 獲得空圖和時圖的實驗結果，使用本實驗室所設計的多通道偵測系 單通道偵測器 多通道偵測器 時間 位置

時圖

空圖

訊號強度 訊號強度

統，可同時得到大範圍的觀測視窗(21 公分)以取得樣品在管路中的 空間分布，也可以隨時間來收集樣品通過偵測位置的訊號，而得到時 間函數之訊號波形。 實驗的目標:於流動注入分析系統中，利用多通道偵測器得到奈 米粒子的空圖和時圖波形，並進一步測量相關波形參數，比較空圖波 形與時圖波形的差異情形。

第二章 文獻回顧

2.1 奈米粒子在流動注入分析系統的波形成因

在上述1.2 節中有提到，奈米粒子形成的波形會含有兩個波峰， 一個波峰是convection peak，其出現的時間較早，而另一個波峰是 diffusion peak，其出現的時間較晚。當流析條件保持不變，隨著注入 的樣品粒徑變大，convection peak 的訊號強度會增加，而 diffusion peak 的訊號強度會下降，反之若注入的樣品粒徑變小，則變化的情形相 反。Fisher 等人對於此現象提出解釋[2]，Fisher 指出，這個現象的產 生同時受到兩種效應的影響，第一個是來自於經由幫浦把載液帶入空 管中時產生了層流(laminar flow)的效應，第二個是樣品本身擴散係數 (diffusion coefficient, D)較低所導致。層流是由於樣品在管路內移動 時，流體受到管壁的摩擦作用，在管路中心的樣品摩擦力較小，速度 因而較快，而越接近管壁的樣品，摩擦力越大，速度越慢，導致管內 流速呈現拋物線(parabolic)或彈頭型的分布，如圖 6 所示。 圖 6 層流造成的流場 http://www.cvphysiology.com/Hemodynamics/H006.htm 由於層流的影響，在管柱中心的樣品會以最大的速度向前移動，而在管壁附近的 樣品，向前移動的速度會趨近於零。

至於擴散的影響，樣品的擴散方向可分為平行於流動方向(axial)的擴 散以及垂直於流動方向(radial)的擴散，由於樣品受到幫浦推動向前移 動時，其水平方向分子的擴散造成的位移比起流速造成的位移而言小 了許多，因此流動的過程中，我們只需考慮其垂直流動方向的擴散造 成的影響，所以樣品的擴散能力也就代表著其垂直流動方向的位移能 力。若樣品分子或粒子的擴散能力較差，初始位置處於管路中心的樣 品分子，在整個流動的過程直至抵達偵測器前，會有很大的機率，一 直待在管路的中心以流速較快的方式向前移動，造成一個很快就出現 的波峰訊號，此波峰訊號即為convection peak。值得一提的是，只要 波形有convection peak 訊號的出現，則此波形也勢必會有非常嚴重的 拖尾，convection peak 的訊號強度越強，拖尾程度越嚴重。這是由於 那些在流動初始位置接近管壁的樣品所造成的，由於擴散能力較差， 在流動過程直至抵達偵測器之前，此樣品會有很大的機率都是在管壁 附近以一個流速很慢的方式向前移動，造成抵達偵測器的時間會比較 晚，故整個波形結束的時間也會拖的比較長。當樣品的擴散能力變好 時，此樣品的樣品分子或粒子會有比較大的機率，從管路中心往管壁 附近移動或從管壁附近往管路中心移動，也就是說樣品分子或粒子待 在管路中心以流速較快方式向前移動的的機率，和待在管壁附近以流 速較慢的方式向前移動的機率都相同，因此，此樣品分子或粒子會以 一個趨近於平均速度的速度前進，而得到一個比 convection peak 晚出 現的波峰訊號，此訊號為diffusion peak。因此，當注入流動分析系統 中的奈米粒子，粒徑越大，則擴散能力越差，形成的convection peak 的訊號會越強，波形拖尾的情況也會跟著越嚴重。而當注入的奈米粒 子粒徑越小，擴散能力越好，diffusion peak 的訊號則會越強，波形拖

尾的現象就較不顯著。 2.2 τ 值與波形的關係 在 2.1 節所討論到影響波形的因素，主要的變因是樣品的擴散能 力。但是在2005 年的時候，Harada 等人提出了除了擴散能力外尚有 其他的實驗參數，會影響到奈米粒子在空管中產生的這個雙峰波形， 並將這些參數都結合起來，並以τ 值來表示[8]。τ 值的公式如下： (2.1) 其中D 是擴散係數，即樣品的擴散能力；L 是管長，即樣品抵達偵測 器所需要移動的距離；r 是管徑；uav是線性流速，也是整體樣品的平 均線性移動速度。值得注意的是，此公式是根據直線的空管中的流體 行為所推導出來的，還不能完全適用於流動注入分析系統的螺旋管 柱。 τ 值可視為波形的量化參數，藉由實驗參數的代入，我們就可以 預期我們所觀察到的波形應該要以什麼形式和形狀呈現。以τ 等於 1 為界線，當τ 大於 1 時，得到的波形應該是一個趨近於高斯的單峰波 形，而當τ 值小於 1 時，得到的波形就是同時有 convection peak 和 diffusion peak 共存的雙峰波形。τ 值越小，convection peak 的訊號越 高，diffusion peak 的訊號會越低，τ 值越大 convection peak 的訊號就 會越低，而diffusion peak 的訊號會越高，如圖 7。 2 av

DL

r u

τ

=

圖 7 τ 值對於波形的影響(電腦模擬之結果)[8]

以τ 值等於 1 為界線，當 τ 值大於 1 時，波形是單峰的高斯波形，只有 diffusion peak 的訊號而沒有 convection peak 的訊號，一但當 τ 值開始小於 1 時，convection peak 的訊號開始產生，τ 值越小，convection peak 的訊號會越大。

Harada 等人提出，樣品在抵達偵測器前，是否有足夠的時間能夠 在整個管路的截面進行完全地擴散，是影響整個波形的關鍵。當樣品 擴散能力比較差(D 值小)、管長太短(L 值小)、管路截面積太大(r 值大) 或流速太快(uav值大)，都會使得樣品在抵達偵測器之前無法完全地擴 散至整個管路截面，而計算出來的τ 值就會小於 1。τ 值等於 1 時， 樣品在抵達偵測器時恰好會完全地擴散於整個管路截面，波形會開始 以單峰的類高斯形式呈現。 2.3 理論板數(N)與波形的關係 過去有文獻提到，可以將流動注入分析法應用在測量蛋白質分子 量[9-11]。他們首先根據 Taylor[12,13]、Aris[14]和 Golay[15]的公式， 推導出在空管中流動的樣品，產生訊號波形的理論板高(H)應該要和

一些特定的實驗參數相關，理論板高的公式如下。 (2.2) 其中Q 為體積流速、D 為擴散係數。因為理論板數為管長除以理論 板高，因此我們可以將理論板數(N)的公式寫成： (2.3) 公式2.3 和公式 2.1 一樣，都只適用於直線形的空管，並不適用於流 動注入分析法的螺旋管柱系統，因此須將此公式以一個κ 值的參數對 其進行修正[16]。κ 值與螺旋管柱纏繞的圈數、纏繞的半徑以及體積 流速相關，這個參數的造成，是由於樣品在螺旋管柱中移動時會產生 離心力所造成的。在直線管柱的情況下，管路中心的流速較快，形成 一個拋物線型的流場。當管路變成螺旋形時，樣品在向前移動的過程 中都會受到一個垂直於流動方向且方向向外的離心作用力。在低流速 的條件下，離心力的影響不顯著，因此流場還會維持拋物線型的形 式，如圖8(a)。但是當流速變高時，離心力的作用增強，會使得流場 從原本的拋物線型，變成斜線型，如圖8(b)。 (a) (b) 圖 8 螺旋管柱系統中離心力(F)對於流場產生的影響 (a)低流速的條件下，離心力的影響還不顯著，因此流場還會維持一個拋物線型 的形式。(b)流速變高時，強離心力的作用，會使的流場會從原本的拋物線型，

24

Q

H

D

π

=

24

DL

N

Q

π

=

×

因此，需將公式加入κ 值進行修正： (2.4) 又當實驗的波形為一高斯波形時，理論板數可以下列公式計算： (2.5) 將公式2.5 代回公式 2.4，我們可以得到另一個表示式： (2.6) 其中tp為波峰位置，W1/2,t為此波形半高寬的寬度。公式 2.6 中，波峰 位置和半高寬可以從實驗的結果求得，管長和流量是實驗設定的條 件，因此將實驗結果和這些已知的參數代入，就可以推得此實驗的樣 品應有的擴散係數，再以擴散係數推算樣品的分子量，達到測量樣品 分子量的目的。除了利用公式2.6 可以求得樣品分子量之外，這個公 式還顯示出其他的資訊：一般的流動注入分析系統中，管長是固定 的，因此公式中的L 參數是固定的，由於管長是固定的，不論使用的 樣品為何，此樣品的訊號波形(單峰的高斯波形)的波峰位置應該都要 相同，因此公式中的 tp參數也是固定的。根據這樣的推論，我們可以 得到，當分子的擴散能力越差(D 值越小)，或實驗設定的體積流速越 大(Q 值越大)，會造成訊號波形的半高寬越寬(W1/2,t越大)，半高寬越 寬，意味著樣品訊號波形整體的分布也會跟著越大。因此藉由公式 2.6，可以估算出樣品的訊號分布情形。 如果將公式 2.3 中的流量，以管路的截面積(a=πr2)乘上線性流速 (uav)代換，可以將公式轉換成：

24

DL

N

Q

π

κ

=

×

2 1/ 2,

5.54

p t

t

N

W

⎛

⎞

=

_×⎜

_⎜

_⎟

_⎟

⎝

⎠

2 1/ 2,

5.54

p

24

t

t

_DL

N

W

π

κ

Q

⎛

⎞

=

×

_⎜

_⎜

_⎟

_⎟

=

×

⎝

⎠

(2.7) 最後再將公式2.1 代入公式 2.7 中，可以得到： (2.8) 藉由公式 2.8，我們可以清楚地了解，只要將理論板數經過係數的轉 換就可以得到τ 值。由於 τ 值與樣品的波形有很高的相關性，當 τ 值 大於1 時，波形才漸漸成為一個單峰的高斯波形，而 τ 值小於 1 時， 波形會是有雙峰訊號並存的形式出現。因此我們可以預期，理論板數 值也會和波形呈現的形狀有關係。無獨有偶地，Golay 提出當波形的 理論板數大於 30 時，才可將此波形視為是一個趨近於高斯的波形 [15]，根據公式 2.8，當理論板數大於 30 時，τ 值應該為 1.25，也的 確是大於1，符合了 Harada 等人所提出的當 τ 值大於 1 之後波形的形 狀才會變成類高斯波形的說法。因此我們可將τ 值和理論板數視為相 同的波形參數。 2

24

av

DL

N

r u

=

×

24

N

= ×

τ

第三章 實驗

3.1 藥品

(a)色素樣品

Tartrazine, C16H9N4O9S2Na3, M.W. 534.4, dye content approx. 90 %

(Sigma, St. Louis, MO, USA)

(b)銀奈米粒子(silver nanoparticle)合成試劑

Silver nitrate, AgNO3, M.W.169.87, 99.8%, GR grade (Showa, Tokyo,

Japan)

11-mercaptoundecanoic acid (MUA), C11H22O2S, M.W. 218.36, 95.0%,

GR grade (Aldrich, St. Louis, MO,USA)

Sodium borohydride, NaBH4, M.W. 37.83, 98.0%, GR grade (Alfa aesar,

Ward Hill, MA, USA) (c)酸液及緩衝溶液配置

Hydrochloric acid, HCl, M.W. 36.45, 35.0~37.0%, GR grade (Showa, Tokyo, Japan)

Potassium hydroxide, KOH, M.W. 56.11, 85%, GR grade (Showa, Tokyo, Japan)

Dipotassium hydrogenphosphate, K2HPO4, M.W. 174.18, 99%, GR grade

(Showa, Tokyo, Japan)

(a) 往復式幫浦 (Reciprocating Pump)

Series II Digital HPLC Pump(Pharma-Tech Research Company (Baltimore, Maryland, USA)，輸出體積流速範圍 0.01 mL/min ~ 9.99mL/min。

(b) 進樣閥門 (Sample injection Valve)

進樣用的六向閥，購自Valco(Houston, TX, USA)。 (c) 管路 (Tubing)

內徑為0.04 英吋 (1000 μm)，外徑為 1/16 英吋 (約為 1.6 公釐) ， 透明的Perfluoroalkoxy 材質管路(Teflon PFA tubing) ，購自於

Upchurch Scientific (Oak Harbor, WA, USA))。 (d) 固定管路的玻璃管 透明的玻璃管，內徑1.25 公分、外徑 1.5 公分、長為 28 公分，於 國立清華大學科學儀器中心訂做。 (e) 多通道偵測系統 光學盒由虹光精密工業股份有限公司(新竹市科學工業園區)提供； 435 奈米窄帶濾波片，穿透波長中心 435 nm，波峰寬度約 50 nm，穿 透度約等於90 %，由裕群光電科技股份有限公司(桃園縣龍潭鄉)製 作；向量調整機台委託彥宏開發科技有限公司(台北縣新莊市)設計製 造。 (f) UV-Vis 光譜儀

型號為Agilent8453 ， 購自 Agilent Technologies (Waldronn, Germany)，此儀器用來測量樣品吸收波長，和定性及定量實驗。

本實驗為了得到流動注入分析系統中的空圖及時圖，採用了自行設計 和組裝的實驗機台，搭配多通道偵測器來收集樣品訊號，實驗裝置系 統如圖9。 圖 9 驗裝置示意圖 1：往復式幫浦；2：樣品注入用六向閥；3：管路迴圈纏繞；4：玻璃管；5：燈 管；6：狹縫；7：濾波片；8：多通道偵測器；9：個人電腦 (a) 多通道偵測系統 多通道偵測系統包含多通道偵測器、濾波片與向量調整機台[17]。多 通道偵測器從虹光公司提供的光學掃描器拆解下來，以掃描器的燈管 與內部光學盒作為本實驗所需之光源與多通道偵測器，光學盒視窗寬 度為21 公分。光源之放射光譜與濾波片之穿透波長範圍如圖 10 所 示，光源強度在435 nm 左右最強，故需選擇在 435 nm 有吸收的樣 品。並將濾波片固定在光學盒的視窗上以過濾光源的其他放射波長。 向量調整機台分為兩個部份，第一個部份上可架設燈源、管路迴圈與 狹縫，第二個部份上架設光學盒(含濾波片)，兩個部份可分別調整彼 1 2 3 6 7 8 9 4 5

此間的距離與高度，並調整狹縫寬度與光源射入光學盒的角度。 圖 10 濾片的穿透波長與燈源的放射波長 (b) 管路迴圈 由於樣品在空管中延散(dispersion)非常大，對於本實驗的多通道偵測 器的最大偵測範圍21 公分而言，如果把管路與偵測器平行放置，將 無法完全觀測到樣品在管路中的分布。有文獻提出將反應管路做成迴 圈型(coiled)、編織型(knitted)或彎曲型(serpentine)，甚至在管路中填 入珠子[18,19]，可以降低軸分散的效應。於本實驗中，在玻璃管外圈 的一側貼上雙面膠帶，將透明的 Teflon PFA tubing 纏繞在此玻璃管 後，用透明膠帶固定住，作成管路迴圈(如圖 11)，藉此以達到降低軸 分散的效應，而使我們可以觀察完整的波峰訊號。最後再將光源置於 玻璃管中，並在玻璃管另一側放置多通道偵測器。

圖 11 管路纏繞示意圖

(c) 樣品注入

本實驗採用轉閥注入法 (valve injection) 進樣，剪裁一段與管路相同 的 Teflon PFA tubing 作為樣品迴圈 (sample loop)，先將六向閥轉至 進樣 (Loading) 位置，待樣品充滿迴圈後，再將六向閥轉到注入 (injection) 位置，樣品注入總體積為「樣品迴圈內體積」加上「注入 閥內的體積」，總體積測量方法，會於下節(3.5(a))中介紹。 (d) 載液的推動 使用往復式幫浦來輸送實驗用載液。 3.4 樣品及載液的選擇與製備 由於光源的放射波長與濾波片的可用波長範圍約435 nm 附近，因此 需選擇最大吸收波長也在此放射波長附近的樣品來進行實驗。本實驗 選擇tatrazine(最大吸收波長：429 nm)和平均粒徑為約 15 nm 的銀奈 米粒子(最大吸收波長：411 nm)來當做實驗的樣品，此兩種樣品的光 譜和其相對應的結構及SEM 圖分別如圖 12 和圖 13。本實驗中所使 用的銀奈米粒子其表面修飾著MUA 分子，而 MUA 分子的 pKa約為 Lamp Glass Column

5.7[20]，即大部分的 MUA 分子在環境 pH 值大於 5.7 後就會以解離 的狀態存在於溶液中，因此對表面修飾著 MUA 分子的銀奈米粒子而 言，在鹼性溶液中，銀奈米粒子在溶液內的分散的能力較佳，較不易 產生聚集(aggregation)的情況，故選擇高 pH 值的緩衝溶液來當做實驗 的溶劑和載液。值得注意的是，除了pH 值的調控需要注意之外，奈 米粒子存在環境的鹽類濃度如果太高，也會使得銀奈米粒子產生聚集 (salt-induce aggregate)[21]，因此使用的緩衝溶液其濃度不可以太高。 (a)

(b) 圖 12 tatrazine 的結構與 UV 光譜圖[22] (a)為 tatrazine 的結構式；(b)為其 UV 光譜圖。 200 400 600 800 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 Abso rbanc e (A U) Wavelength(nm)

Tartrazine 20 ppm (in water) 429 nm

(a) (b) (c) 圖 13 銀奈米粒子的掃描式電子顯微鏡的圖和粒徑分布圖以及 UV 光譜圖 (a)銀奈米的掃瞄式電子顯微鏡的圖(b)粒徑分布圖，粒徑為 15 ± 2 nm (c)銀奈 米粒子的 UV 光譜圖，最大吸收波成為 411nm。 0 10 20 30 40 50 60 70 80 7~8 9~10 11~12 13~14 15~16 17~18 19~20 21~22 size (nm) n um ber

(a)20mM 磷酸鉀緩衝溶液(pH11)之配製 將1.7418 g 之磷酸氫二鉀以 50 ml 的去離子水溶解，之後再加入 20 ml 之0.1 M 氫氧化鉀水溶液，最候將整體溶液之體積稀釋至 500 ml 即 完成緩衝溶液之配製。 (a)tatrazine 溶液之配製 將tatrazine 以緩衝溶液配製成濃度為 500 mg/l 的樣品水溶液。 (b)銀奈米粒子之合成[23]

將1.7 mg 的 MUA 加入 25 ml 的 sodium borohydride 水溶液(20 mM) 中，攪拌五分鐘。之後在劇烈攪拌的情況下，以緩慢滴入的方式加入 25 ml 的 Silver nitrate 水溶液(5 mM)。剛開始滴入時，只有少量的奈 米粒子形成，因此溶液的顏色會成淡黃色，待 Silver nitrate 水溶液完 全滴入後，由於形成大量的奈米粒子，溶液會呈現棕黑色。將溶液攪 拌24 小時之後，以 0.1 M 的鹽酸調整溶液之 pH 值成為 2，然後將此 溶液以6000 rpm 的轉速進行離心 2 分鐘。離心完後將沉澱下來的銀 奈米粒子(約 15 mg)再溶於 25 ml 的緩衝溶液裡保存，準備進行日後 的實驗。 3.5 實驗參數的測量 (a) 樣品體積 (Vs, ml) 本文實驗使用「染料注入法」來預估樣品體積[24]。首先，將一已知 濃度的染料注入後，六向閥轉到輸出位置，然後注入去離子水並收集 於定量瓶中，加水至定量瓶上刻度，測量其吸光值。接著，取幾組特 定體積的染料稀釋至相同體積，測量吸光值，做出一條染料體積對吸

光值的檢量線。最後將待測樣品體積吸光值代入此檢量線，便可反推 樣品的注入體積。 (b) 多通道偵測器訊號的校正 在偵測系統中，多通道偵測器測量到的訊號可能會受到下列幾項因素 的影響：(1)光源(燈管發出的光強度不均以及強度隨時間變化)；(2) 玻璃管(玻璃管壁厚度不均勻)；(3)管路(透明的 PFA 管路纏繞擠壓 後，其內徑不均勻)；(4)偵測器(偵測器上每一個偵測點對光線的靈敏 度)，造成訊號會有誤差存在，因此需要做吸收訊號之校正。將一已 知濃度的染料注入整個管路，以多通道偵測器測量吸收訊號，將每一 圈管路其光吸收值最高的偵測點挑出來，代表此圈管路的光吸收值， 即相當於光線通過此圈管路的最大光徑。每一圈管路都會有一個光吸 收值最高的偵測點，假設各偵測點的吸收值相同，之後才能分析樣品 訊號之變化，故將這些偵測點的吸收值平均，再除上每一點原本的吸 收值，即可得到每一個偵測點的吸收校正因子，此因子可用於樣品吸 收度之校正。 (c) 管路位置 樣品在管路中的空間分布波形的橫軸是以長度為單位，所以，必須知 道偵測點對應的管路位置 (L)。先使用氮氣先將管路迴圈吹乾，接 著，用幫浦推動染料進入空管路中，記錄染料前端(染料與空氣的接 觸面)通過每個偵測點花費的時間 (t)，將時間乘上體積流速(Q)再除 以管路截面積(a=πr2)，就得到偵測點對應的管路位置(L=t×Q/a)。 3.6 電腦操作介面設定

進行實驗前，必須先設定好電腦操作介面，例如：樣品取樣時間、曝 光時間…等，使多通道偵測器獲得樣品吸收訊號，以下會逐一介紹操 作介面(圖 14)。

圖 14 電腦操作介面圖

(a) Sampling interval (樣品取樣時間)

様品取樣時間是以毫秒(ms)為單位，根據樣品種類與幫浦流速等實驗 條件，輸入適當的取樣時間，使多通道偵測器在每個不同流速實驗條 件下獲取的空圖組數一樣多。 (b) Sampling method (取樣方法) 此欄可以選擇訊號收集點的數量，總共有五個選項：670、1340、2680、 5360、10720，在偵側範圍 21 公分的多通道偵測器裡，其光學盒內 線形CCD 上有 10720 個像素(即 10720 個訊號收集點)，若以相鄰 2 點做平均積分處理，會得到5360 個訊號收集點；以相鄰 4 點、8 點、

16 點做平均積分，分別會有 2680、1340、670 個訊號收集點。本實 驗的每一組訊號波形皆由670 個點所組成，其解析度已足夠，並且， 以相鄰16 點做平均積分，可以達到加強訊號雜訊比(S/N)的效果。 (c) Sampling mode (取樣模式) 光學盒內的CCD 有塗佈材料，可以過濾掉不同波長的光源，因此， 由取樣模式可以選擇光源通過CCD 的波段，選擇模式有 5 種，分別 為Red、Green、Blue、Color、Gray，在本實驗中，因光學盒已加上 自行設計的濾波片，使符合樣品吸收波長之波段的光源通過，所以， 選擇 ”Gray” 為取樣模式，即 CCD 不需濾掉任何波長的光，盡可能 讓所有可用的光線都能到達偵測器，提高偵測訊號的靈敏度。 (d) Exposure (曝光時間) 曝光時間是以百分比(%)為單位，輸入不同的數值會對應到不同的曝 光時間(表 1)，若偵測器接收到足夠的光源強度，儘量選擇較短的曝 光時間，因為曝光時間過長，對於空間分布瞬間變化很劇烈的樣品而 言，其實驗結果的解析度不好，樣品在管內的行為無法被偵測，所以， 曝光時間若過長會影響偵訊器所收集到的記錄波形。 表 1 曝光時間對照表

Exposure (%) time (sec)

100 0.003590 200 0.007190 300 0.01079 400 0.01439 500 0.01799 600 0.02159 700 0.02519 800 0.02879

3.7 實驗流程 實驗裝置架設完畢之後，先調整機台與多通道偵測器的相關位置與角 度，以及調整適當的狹縫寬度，使光源能夠通過管路迴圈並進入偵測 器，並且依照電腦操作介面上呈現的訊號強度，進行微調，調整完畢 後測量偵測點所對應的管路位置，上述步驟完畢後進入接下來的實驗 部份。 (1)將緩衝液以超音波洗淨器充分震盪後，使其充滿管路迴圈，並檢 查管路內是否有氣泡，若有氣泡則再重覆此實驗步驟，直到管路迴圈 內沒有氣泡；(2)依照實驗條件設定幫浦流量；(3)設定電腦操作介面 (Sampling mode： Gray ； Sampling method ： 670 ；Exposure： 100%)；(4)注入樣品，並將儀器蓋上黑布避免受其他光源干擾；(5) 開動幫浦推動載液進行實驗並同時收集偵測訊號；(6)從電腦操作介 面上看到訊號恢復至原本狀態即表示樣品已流出管路，此時停止收集 訊號；(7)進行吸光值校正。

第四章 結果與討論 4.1 數據處理 本實驗所使用的多通道偵測系統，其偵測器會在同一時間得到 670 個訊號收集點。每次取樣的曝光時間 (exposure time) 為 3.6 ms， 對本研究所使用的最高流速實驗條件1.06 ml/min (2.26 cm/s)來說，每 次取樣期間，樣品只會在管路內前進 81 μm，對於一個完整波形寬度 而言，此值甚小，故可忽略曝光時間對空間波形的影響。 數據處理步驟如下：實驗過程中，每次取樣會記錄 670 個訊號 收集點的偵測訊號，由「timeInfo.txt」檔案可以得到每次取樣時間的 數據；「result.txt」檔案內含整個系統偵測過程中樣品的吸收訊號，在 670 個訊號收集點內，挑出光線通過最大光徑的訊號偵測位置，將這 些偵測位置所測得的吸收訊號分別乘上3.5(b)節提及的吸收校正因 子，以校正樣品之正確吸收值。 在固定的偵測位置(L)，以固定的取樣間隔時間收集偵測訊號， 可得到「時間對應吸收值」的圖形，這種隨流析時間收取訊號作圖的 圖形稱為時圖(一般偵測器所得的記錄波形即為時圖)，本實驗中，為 了要比較不同體積流速下的時圖波形，因此將原本時圖橫座標的時間 單位(s 或 min)經由乘上體積流速來轉換成流量(ml)單位。 將同一時間(瞬間)中「不同偵測位置」的偵測訊號取出，依據偵 測點對應的管路位置作出「位置對吸收值」的圖形，這種在同一時間 獲得全部偵測點的訊號，並以管路位置作圖得到的圖形稱為空圖。 4.2 波形參數指標

4.2.1 基本參數 空圖與時圖波形基本的指標參數為： (a) 波高：訊號波形的最大訊號值。 (b) 波峰位置：即波形最高點所對應的橫座標位置，由於空圖與時圖 的作圖方式不同，其單位可為長度(空圖)或流量(時圖)。 (c) 波面積：本實驗採用積分法來估計波形下所涵蓋的波面積，此方 法將兩組訊號值以及兩訊號值的時間或距離差距以梯形面積相加 (圖 15)，計算公式為： (4.1)

其中 yi 代表第 i 個訊號值，xi 為 yi 對應的位置；yi+1 代表第 i+1 個

訊號值，xi+1 為 yi+1 對應的位置，若 xi 與 xi+1 間隔差距越小，則

累加結果會越接近真實面積。 圖 15 積分法求波形面積的示意圖 計算波形下涵蓋的面積，將 (xm, ym) 與 (xm+1, ym+1) 所涵蓋的梯形面積算出，再 將梯形面積累加即可逼近波形面積。

(

1

)

(

1

)

2

i i i i

y

y

x

x

A

=

∑

+

+

×

+

−

y x x1 x2 x3 x4 x5 x6 x7 x8 x9 y1 y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9

(d)波形質量中心(calculated mass center by the shape profile)：意義為波 形面積的一半，也是所有數據點位置的平均值，可由以下公式計算得 知： (4.2) 和波峰位置一樣，波形的質量中心由於空圖波形與時圖波形的作圖方 式不同，其單位可為長度(空圖)或流量(時圖)。

(e)由流速估算之空圖波形的質量中心(estimated mass center by the flow rate)：樣品在空間中移動時，其質量中心位置可以藉由線性流速 乘上樣品流析時間推算，公式如下： (4.3) (f)半高寬：波形高度一半的波寬，其單位可為長度或流量。 4.2.2 進階參數 本實驗目的是要了解奈米粒子在流動注入分析系統中空時差異的情 形，因此會對於空時圖的波形訊號結果進行比較，比較的方式有兩 種，第一是波形形狀的比較，第二為波形延散程度的比較。 (a)波形形狀： 由於大部分奈米粒子在流動注入分析系統中產生的波形同時會含有 convection peak 和 diffusion peak 這兩個波峰訊號的關係，因此可以將 convection peak 和 diffusion peak 的高度比當作波形形狀的參考指標。 此參數最早由Fischer 等人所提出[2]，他們定義 convection peak 的高 度為h1，diffusion peak 的高度為 h2，如圖 16，藉由 h1 和 h2 的比例 i i i

y

x

x

y

×

=

∑

∑

'

L av

x

=

u

×

t

可以推算出奈米尺寸(nano scale)粒子的擴散係數的關係以及其相對 應的尺寸大小分布。利用這個參數可以將不同波形彼此間形狀上的差 異量化成數字的結果。

圖 16 h1 和 h2 的示意圖

h1 為 convection peak 的訊號高度，h2 為 diffusion peak 的訊號高度。

(b)波形延散程度： 在統計學上，常常會以標準偏差值(σ)來當作數據點分散情形的參考 指標。空圖和時圖的波形，也是由許多的數據點所構成，因此也可以 藉由算出構成這些波形的數據點的標準偏差值，來代表這個波形的延 散程度。當波形是一個高斯波形，則此高斯波形的半高寬恰好會是 2.35 倍的標準偏差值，因此可以很簡單的被我們求得，但是當波形為 非高斯波形的情況下，就必須根據統計學上計算標準偏差的原始公式 來求得，公式如下： (4.4) 標準偏差，是一個有單位的數值，就像波峰位置、平均值和半高寬一 樣，會由於時圖和空圖做圖的方式不同，而使得時圖和空圖的標準偏 差有不同的單位，也因為如此，單位不同的兩種數據便無法直接拿來

(

)

i i i

y

x

x

y

σ

=

∑

×

−

∑

進行比較。 相對標準偏差(RSD)，是將標準偏差在除上所有數據點的平均值，並 以百分比的方式呈現，公式如下： (4.5) 相對標準偏差和標準偏差一樣都可以用來表示數據分散的情形，差別 只是相對標準偏差的分散情況是與平均值來做比較，是屬於相對分散 情形，而標準偏差是沒有考慮到平均值的絕對分散情形。除此之外， 相對標準偏差是一個沒有單位的數值，因此可以用在空時圖數據點分 散情形的比較。 實驗波形所得的各指標參數與理論公式中所使用的參數，其符號的定 義整理於附錄A。 4.3 相對標準偏差與波形的關係 (a)時圖的相對標準偏差 在2.2 和 2.3 節中，我們分別探討了 τ 值和理論板數與波形結果的關 係，同時也討論了τ 值和理論板數相關性。在此我們要將訊號波形的 相對擴張的情形，也就是相對標準偏差值，去與訊號波形以及實驗相 關條件進行關聯。理論板數其最原始的表示式為： (4.6) 若波形是高斯波形，由於波形左右對稱的關係，則此樣品的波峰位置

100%

RSD

x

σ

= ×

2

x

N

σ

⎛ ⎞

= ⎜ ⎟

_{⎝ ⎠}

可以視為是構成此訊號波形的所有數據點其位置的平均值，且其半高 寬恰好會是2.35 倍的標準偏差，因此才可將公式 4.6 理論板數的表示 式改寫成公式2.5 的形式。標準偏差除以平均值的結果會是相對標準 偏差，因此又可以將公式4.6 改寫成： (4.7) 利用公式4.7，我們可以藉由構成波形的所有數據點的相對標準偏差 值計算出任何波形的理論板數，而不再只是侷限於計算高斯波形的理 論板數。將公式2.8 的關係式代入公式 4.7 可得到： (4.8) 根據公式4.8，由於相對標準偏差與和波形的形狀相關的 τ 值有等式 的關係(公式 2.8)，因此我們可以斷定構成此波形的相對標準偏差， 也會與波形的形狀有很大的關係。根據Golay[15]等人的說法，當理 論板數大於30 之後，才可將波形視為是一個高斯波形，經由公式 4.7 的轉換，我們可以得到，若理論板數要大於30，則樣品的訊號波形 的所有數據點的相對標準偏差值應該要小於18.26%。因此當理論板 數大於30，或構成此波形的所有數據點的相對標準偏差值計算出來 小於18.26%時，我們可以預期此波形的形狀是一個趨近於高斯形狀 的波形。 再來，我們可以將公式4.7 中的理論板數值以公式 2.4 的理論板數與 各實驗參數的關係式代入，並將關係式中的流量，以截面積(a=πr2) 乘上線性流速(uav)進行代換，可以的到波形的相對分散情形或構成此 波形所有數據點的相對標準偏差與各實驗參數間的關係式： 2

1

N

RSD

⎛

⎞

= ⎜

_⎝

⎟

_⎠

2

1

24

N

RSD

τ

⎛

⎞

=

_{× = ⎜}

_⎟

⎝

⎠

(4.9) 根據公式4.9，我們可以預期，當樣品擴散能力越好(D 值大)、管長越 長(L 值大)、管徑越細(r 值較小)以及流速越慢(uav值較小)，樣品所形 成的波形相對延散程度或平均標準偏差會越小，一旦波形的相對延散 程度或相對標準偏差小於18.26%時，此波形即可視為一個單峰的高 斯波形。 (b)空圖的相對標準差 當樣品沿著管路擴張時，其延散程度σL應與樣品的移動距離的平方 根成正比，而樣品的移動距離即為其所在的質量中心位置，即： (4.10) 其中，μL是樣品的延散係數(dispersion coefficient)。將公式 4.10 的等 號左右兩邊都除上質量中心，即可得到： (4.11) 將標準偏差除以平均值的結果即為相對標準偏差，且為了與時圖的相 對標準偏差值的關係式(公式 4.9)進行比較，可將公式 4.11 改寫成： (4.12) 根據公式4.12，我們可以得知，在相同延散係數的實驗條件下，樣品 的質量中心位置越向管路後端移動，樣品的相對延散程度越小。 4.4 數據結果與討論 2 2

1

24

av

DL

N

RSD

π

κ

r u

⎛

⎞

=

_⎜

_⎟

=

×

⎝

⎠

L L

x

σ

=

μ

L L

x

_x

σ

₌

μ

2 2

1

L

x

RSD

μ

⎛

_{⎞ =}

⎜

⎟

⎝

⎠

4.4.1 實驗條件

本實驗使用兩種不同擴散係數的樣品，分別是 tatrazine 和銀奈米 粒子。將濃度500 mg/L 的 tatrazine 水溶液和 600 mg/L 的銀奈米粒子 水溶液分別注入管徑1000μm 的流動注入分析系統中，再以 5 種不同 的體積流速( 0.21 ml/min、0.43 ml/min、0.64 ml/min、0.85 ml/min、1.06 ml/min)將載液(緩衝溶液)打入並收集訊號。在數據處理時，分別將偵 測點設定在5 個不同的管路位置( 274.5 cm、372.5 cm、471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm)，收集隨流析時間而改變的樣品吸收訊號，將所得結 果做圖，因此每種流速有 5 組時圖，並找出空圖樣品估算質量中心位 置(由公式 4.3 估算而得)移動到此 5 個管路位置時的空圖，所以每種 流速的5 組時圖會有相對應的 5 組空圖。 4.4.2 時圖波形變化趨勢 (a) 不同體積流速，相同偵測位置的時圖波形趨勢比較 圖 17 和圖 18 分別為偵測位置在管路位置 471.6 cm 處，tatrazine 和銀奈米粒子在5 種不同體積流速( 0.21 ml/min、0.43 ml/min、0.64 ml/min、0.85 ml/min、1.06 ml/min)下所得到的時圖偵測結果，其各波 形參數列於表2 和表 3。在 tatrazine 的實驗結果方面，不論流速如何 改變，我們所得到的波形都還是屬於類高斯的波形，波峰位置都會在 流析流量約為3.7 ml 的時候出現，只是當流速提高時，樣品的波高會 下降，而波寬會增加。但是，在銀奈米粒子的實驗結果方面，可以明 顯的看的到，流速改變時，我們所得到的波形結果會非常的不同。以

銀奈米粒子當樣品時，其流動注入分析訊號的波形會以雙峰的形式出 現(convection peak 和 diffusion peak)。以本實驗而言，convection peak 的訊號會出現在流析流量2.5 ml 處，而 diffusion peak 訊號出現在流 析流量3.7 ml 處。低流速時 diffusion peak 訊號較強，波峰位置即為 diffusion peak 出現的位置，而隨著流速提升，convection peak 的訊號 也會慢慢變強，甚至到了後來，波峰位置也會往前移動到convction peak 出現的位置。 根據 4.3(b)節中相對標準偏差對於波形的探討，當時圖的實驗波 形其相對標準偏差值小於18.26%時，實驗所得的波形應該是一個趨 近於高斯的單峰波形。依照本實驗的實驗結果，也的確發現這樣的現 象存在。表2 中，tatrazine 不管在何種流速的條件下，其波形的相對 標準偏差值都小於18.26%，因此在每個流速條件下其波形都會趨近 於高斯波形。然而，在表3 中，不論何種流速條件下，奈米粒子的相 對標準偏差都大於18.26%，當流速最小時(0.21 ml/min)其相對標準偏 差值為19.57%，是最接近上述 18.26%之值，因此相較於其他流速 (0.43~1.06 ml/min)下所產生的波形而言，的確也是最接近高斯波形的 一個實驗波形。

圖 17 tatrazine 在不同體積流速(0.21~1.06ml/min)，相同偵測位置(471.6cm)的時 圖波形。 表 2 tatrazine 在不同體積流速(0.21~1.06ml/min)，相同偵測位置(471.6cm)的時圖 波形相關參數 體積流速(ml/min) 0.21 0.43 0.64 0.85 1.06 波高 h (AU) 0.337 0.278 0.233 0.210 0.189 波峰位置 tp (ml) 3.68 3.63 3.64 3.68 3.64 面積 At (AUml) 0.262 0.265 0.263 0.265 0.262 質心流量 x (ml) _t 3.72 3.71 3.73 3.73 3.74 半高寬 W1/2,t (ml) 0.733 0.895 1.07 1.19 1.31 標準偏差 σt (ml) 0.314 0.396 0.463 0.504 0.561 相對標準偏差 RSD (%) 8.5 10.7 12.4 13.5 15.0

圖 18 銀奈米粒子在不同體積流速(0.21~1.06ml/min)，相同偵測位置(471.6cm)的 時圖波形。 表 3 銀奈米粒子在不同體積流速(0.21~1.06ml/min)，相同偵測位置(471.6cm)的 時圖波形相關參數 體積流速(ml/min) 0.21 0.43 0.64 0.85 1.06 波高 h (AU) 0.204 0.173 0.146 0.191 0.208 波峰位置 tp (ml) 3.70 3.39 3.41 2.43 2.57 面積 At (AU-ml) 0.378 0.387 0.390 0.383 0.396 質心流量 x (ml) _t 3.85 3.73 3.87 3.93 3.93 半高寬 W1/2,t (ml) - - - - - 標準偏差 σt (ml) 0.753 0.854 1.01 1.23 1.25 相對標準偏差 RSD (%) 19.6 22.9 26.2 31.2 31.6 h1/h2 0.29 0.71 0.90 1.47 1.99

(b)相同體積流速，不同偵測位置的時圖波形趨勢比較 除了探討不同流速對時圖波形變化的影響之外，我們也對於不同 偵測位置所偵測到的時圖波形進行探討。圖19(a)~(e)和圖 20(a)~(e) 為tatrazine 和銀奈米粒子這兩種不同的樣品在 5 種不同流速所得到的 時圖波形，每一組時圖分別代表著5 個不同偵測位置( 274.5 cm、372.5 cm、471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm)，模擬單通道偵測器隨流析時間 紀錄樣品訊號而得到的波形。以tatrazine 的同組時圖波形而言，當管 路越長，樣品抵達偵測器所花的時間越久，導致波峰越慢出現，波形 也會變的越矮和越寬的趨勢。對於銀奈米粒子的實驗結果而言，除了 管路越長，波峰會越慢出現和波形會越矮越寬的趨勢之外，偵測位置 的改變也會影響到convection peak 和 diffusion peak 消長的情況。偵 測位置較前面所得到的時圖波形，convection peak 的訊號會較為明 顯，隨著管路位置越來越後面，則diffusion peak 的訊號則會越來越 明顯。

公式 4.8 顯示出，同種樣品在固定流速和管路截面積的情況下， 偵測到的時圖波形平均標準偏差值之倒數平方(RSD-2)，應該要和偵測 位置(L)有正比的關係。圖 21(a)~(e)和圖 22(a)~(e)分別為 tatrazine 和 銀奈米粒子，在各流速下不同偵測位置，所得到的時圖波形平均標準 偏差的倒數平方和偵測位置的做圖結果。結果顯示，不論是 tatrazine 或是銀奈米粒子的時圖，亦即波形不論是類高斯的波形還是非常遠離 高斯且不對稱的波形，都會遵守著平均標準偏差的倒數平方和偵測位 置為線性的關係。

(a)

(b)

(c)

圖 19 tatrazine 在不同體積流速下的時圖 (a) 0.21 ml/min (b) 0.43 ml/min (c) 0.64 ml/min

每一組時圖由左至右有 5 個波形，分別代表該流速下，以多通道偵測器在不同偵 測位置隨時間取得的紀錄波形，偵測位置由左至右分別為：274.5 cm、372.5 cm、 471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm。

(d) (e) 圖 19 tatrazine 在不同體積流速下的時圖(續) (c) 0.85 ml/min (d) 1.06 ml/min 每一組時圖由左至右有 5 個波形，分別代表該流速下，以多通道偵測器在不同偵 測位置隨時間取得的紀錄波形，偵測位置由左至右分別為：274.5 cm、372.5 cm、 471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm。

(a)

(b)

(c)

圖 20 銀奈米粒子在不同體積流速下的時圖 (a) 0.21 ml/min (b) 0.43 ml/min (c) 0.64 ml/min

每一組時圖由左至右有 5 個波形，分別代表該流速下，以多通道偵測器在不同偵 測位置隨時間取得的紀錄波形，偵測位置由左至右分別為：274.5 cm、372.5 cm、 471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm。

(d) (e) 圖 20 銀奈米粒子在不同體積流速下的時圖(續) (c) 0.85 ml/min (d) 1.06 ml/min 每一組時圖由左至右有 5 個波形，分別代表該流速下，以多通道偵測器在不同偵 測位置隨時間取得的紀錄波形，偵測位置由左至右分別為：274.5 cm、372.5 cm、 471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm。

(a)

(b)

(c)

圖 21 tatrazine 在不同體積流速下的時圖相對標準偏差與偵測位置的關係 (a) 0.21 ml/min (b) 0.43 ml/min (c) 0.64 ml/min

(d)

(e)

圖 21 tatrazine 在不同體積流速下的時圖相對標準偏差與偵測位置的關係 (續) (d) 0.85 ml/min (e) 1.06 ml/min

(a)

(b)

(c)

圖 22 銀奈米粒子在不同體積流速下的時圖相對標準偏差與偵測位置的關係 (a) 0.21 ml/min (b) 0.43 ml/min (c) 0.64 ml/min

(d)

(e)

圖 22 銀奈米粒子在不同體積流速下的時圖相對標準偏差與偵測位置的關係 (續)

4.4.3 空圖波形變化趨勢

(a)不同體積流速，相同估算質量中心位置的空圖波形趨勢比較 圖 23 和圖 24 為 tatrazine 和銀奈米粒子這兩種樣品在 5 種不同體 積流速下( 0.21 ml/min、0.43 ml/min、0.64 ml/min、0.85 ml/min、1.06 ml/min)樣品估算質量中心移動到接近 471.6 cm 管路位置時進行訊號 偵測所得到的空圖波形，其各波形的參數如表4 和表 5。tatrazine 的 空圖波形，不論流速為何，波形都是類高斯的波形，波峰位置都會出 現在管路位置476.98 cm 處。隨著流速變快，波高會降低而波寬會增 加。銀奈米的空圖波形，也同時存在著convection peak 和 diffusion peak 這兩種形式的波峰。Convection peak 訊號出現在管路位置 675.29 cm 處，而diffusion peak 訊號出現在管路位置 443.96 cm 處。流速越快 convection peak 的高度越高，反之，若流速越慢則 diffusion peak 的高 度會越高。 tatrazine 空圖的估算質量中心位置與實際波形的質量中心位置誤 差值很小，而銀奈米粒子空圖的結果卻存在著些許的誤差，推測的原 因有兩個：第一，由於多通道偵測系統所使用的光源最大放射波長位 於435nm 處，此放射波長使得 tatrazine 的樣品(最大吸收波長：429nm) 的偵測靈敏度比銀奈米粒子樣品(最大吸收波長：411nm)的偵測靈敏 度來得好，因此tatrazine 在多通道偵測系統內的訊號雜訊比(S/N)較佳 而銀奈米粒子的訊號雜訊比較差。在利用公式4.2 計算實際質量中心 位置時，若訊號雜訊比較差時就很容易會產生誤差，因此銀奈米粒子 的誤差值才會比tatrazine 的誤差值大。第二，奈米粒子樣品在管路中

的延散(dispersion)效應很強，樣品在管內的空間分散情況會非常的 廣，因此造成有一小部分的樣品超出多通道偵測器的偵測視窗範圍 (21 cm)而無法被偵測到，因此在計算實際質量中心位置時，會產生誤 差。

圖 23 tatrazine 在不同體積流速(0.21~1.06ml/min)下，估算質量中心位置在 471.6cm 附近的空圖波形。 表 4 tatrazine 在不同體積流速(0.21~1.06ml/min)下，估算質量中心位置在 471.6cm 附近的空圖波形相關參數 體積流速(ml/min) 0.21 0.43 0.64 0.85 1.06 估算質心位置 x ’ (cm) _L 472.24 470.98 471.03 471.39 471.58 波高 h (AU) 0.341 0.280 0.237 0.212 0.192 波峰位置 Lp (cm) 476.98 476.98 476.98 471.63 476.98 面積 AL (AU-cm) 34.2 33.9 33.5 33.6 34.0 質心位置 x _L 473.09 473.32 473.11 473.58 475.46 質心誤差(%) 0.180 0.497 0.442 0.464 0.824 半高寬 W1/2,L 94.420 114.67 135.49 152.28 170.16 標準偏差 σL 40.179 48.794 57.655 64.799 72.408 相對標準偏差 RSD (%) 8.4 10.2 12.1 13.7 15.2

圖 24 銀奈米粒子在不同體積流速(0.21~1.06ml/min)下，估算質量中心位置在 471.6cm 附近的空圖波形。 表 5 銀奈米粒子在不同體積流速(0.21~1.06ml/min)下，估算質量中心位置在 471.6cm 附近的空圖波形相關參數 體積流速(ml/min) 0.21 0.43 0.64 0.85 1.06 估算質心位置 x ’ (cm) _L 471.83 471.81 471.91 471.39 471.58 波高 h (AU) 0.211 0.173 0.152 0.133 0.141 波峰位置 Lp (cm) 443.96 482.67 460.71 438.74 680.57 面積 AL (AU-cm) 50.6 51.6 51.2 53.0 53.3 質心位置 x _L 465.37 492.72 490.03 491.67 501.79 誤差值 (%) -1.37 4.43 3.84 4.30 6.41 半高寬 W1/2,L - - - - - 標準偏差 σL 103.57 114.28 128.30 143.95 150.25 相對標準偏差 RSD (%) 22.3 23.2 26.7 29.3 29.9 h1/h2 0.12 0.39 0.54 0.90 1.25

(b)相同體積流速，不同估算質量中心位置的空圖波形趨勢比較 除了探討不同流速對空圖波形變化的影響之外，我們也對於不同 樣品其估算質量中心移動到不同管路位置時的空圖波形進行探討。圖 25(a)~(e)和圖 26(a)~(e)分別為 tatrazine 和銀奈米粒子這兩種不同的樣 品在5 種不同流速的空圖波形，每一組空圖的 5 個波形，是分別由樣 品估算質量中心來到274.5 cm、372.5 cm、471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm 這 5 個管路位置時的樣品空間分布波形。以 tatrazine 的同組空圖 波形而言，當樣品估算質量中心位置移動到較後面的管路位置時，波 形會變的越矮越寬。對於銀奈米粒子的實驗結果而言，樣品估算質量 中心移動到較後面的管路位置時的波形除了也會有越矮越寬的趨勢 之外，同時也可以看的到convection peak 和 diffusion peak 消長的情 況。估算質量中心位置較前面所得到的時圖波形，convection peak 的 訊號會較為明顯，隨著估算質量中心往後面的管路位置移動，diffusion peak 的訊號則會越來越明顯。 公式 4.11 顯示出，樣品在空間中移動的過程，其平均標準偏差 倒數之平方，應該要和該樣品質量中心移動的距離有著線性的關係。 圖27(a)~(e)為 tatrazine，在各不同流速下條件下，所得到的空圖波形 平均標準偏差的倒數平方和質量中心移動到的管路位置的做圖結 果，結果顯示，平均標準偏差值經過倒數平方後和樣品質量中心移動 的距離的確存在著線性的關係。由於多通道偵測器的偵測範圍僅有 21 cm 的關係，加上奈米粒子在空管中的延散(dispersion)效應很強， 空間上分布的波形會很廣，因此奈米粒子樣品質量中心在比較前面和 後面的管路位置的空圖波形，會是一個不完整的空圖波形，因此無法 將其每個空圖波形平均標準偏差都計算出來，故在此不加以討論。

(a)

(b)

(c)

圖 25 tatrazine 在不同體積流速下的空圖 (a) 0.21 ml/min (b) 0.43 ml/min (c) 0.64 ml/min

每一組空圖由左至右有 5 個波形，分別代表該流速下，以多通道偵測器偵測不同 估算質量中心位置的空圖，空圖的估算質量中心由左至右分別為：274.5 cm、372.5 cm、471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm。

(d)

(e)

圖 25 tatrazine 在不同體積流速下的空圖(續) (d) 0.85 ml/min (e) 1.06 ml/min

每一組空圖由左至右有 5 個波形，分別代表該流速下，以多通道偵測器偵測不同 估算質量中心位置的空圖，空圖的估算質量中心由左至右分別為：274.5 cm、372.5 cm、471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm。

(a)

(b)

(c)

圖 26 銀奈米粒子在不同體積流速下的空圖 (a) 0.21 ml/min (b) 0.43 ml/min (c) 0.64 ml/min

每一組空圖由左至右有 5 個波形，分別代表該流速下，以多通道偵測器偵測不同 估算質量中心位置的空圖，空圖的估算質量中心由左至右分別為：274.5 cm、372.5 cm、471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm。

(d)

(e)

圖 26 銀奈米粒子在不同體積流速下的空圖(續) (d) 0.85 ml/min (e) 1.06 ml/min

每一組空圖由左至右有 5 個波形，分別代表該流速下，以多通道偵測器偵測不同 估算質量中心位置的空圖，空圖的估算質量中心由左至右分別為：274.5 cm、372.5 cm、471.6 cm、570.6 cm、670.5 cm。

(a)

(b)

(c)

圖 27 tatrazine 在不同體積流速下的時圖相對標準偏差與質量中心位置的關係 (a) 0.21 ml/min (b) 0.43 ml/min (c) 0.64 ml/min

(d)

(e)

圖 27 tatrazine 在不同體積流速下的時圖相對標準偏差與質量中心位置的關係 (續)

4.4.4 空時差異 根據文獻[24,25]，空圖與時圖這兩種因為觀測方式不同而得到的 兩種波形，它們有著某種程度的差異性，也就是所謂的空時差異。由 於以特定位置為固定偵測點所獲得的的時圖之所有數據點，是由實驗 過程中的每一張空圖在此偵測位置的訊號強度所貢獻的，因此，時圖 上每一個數據點都會對應到一張空圖。所以，必須要去選擇一張具有 代表性的空圖來與時圖進行比較。本實驗選定當樣品估算質量中心位 置移動到目標時圖的偵測位置的空圖，來與目標時圖進行比較，比較 的方式有兩種，第一是比較兩者之波形之形狀，第二是比較兩種波形 之相對標準偏差。圖28(a)~(e)和圖 29(a)~(e)分別為 tatrazine 和銀奈米 粒子在五個不同體積流速條件下，以管長471.6 cm 為固定偵測位置 所得到的時圖以及其相對應的空圖(估算質量中心位置在接近 471.6 cm 處)。值得一提的是，空時圖波形兩者的方向左右相反像是鏡像的 關係。這是由於樣品是不斷的向右移動時，其空圖的右邊是波形的前 端，而當樣品碰觸到偵測器時，時圖的訊號產生是由左至右，因此時 圖的左邊反而是波形的前端，故使得空時圖呈現波形的方向變成左右 相反。

(a)

(b)

(c)

圖 28 tatrazine 在不同體積流速下的時圖(左)與其相對應的空圖(右) (a) 0.21 ml/min (b) 0.43 ml/min (c) 0.64 ml/min