蛋白激脢之細胞訊息傳遞路徑中DARPP-32蛋白所扮演的角色：對大鼠學習記憶和抗細胞凋亡機制的影響

行政院國家科學委員會專題研究計畫 成果報告

蛋白激酉每之細胞訊息傳遞路徑中 DARPP-32 蛋白所扮演的

角色：對大鼠學習記憶和抗細胞凋亡機制的影響(第 3 年)

研究成果報告(完整版)

計 畫 類 別 ： 個別型 計 畫 編 號 ： NSC 98-2320-B-004-002-MY3 執 行 期 間 ： 100 年 08 月 01 日至 101 年 07 月 31 日 執 行 單 位 ： 國立政治大學神經科學研究所 計 畫 主 持 人 ： 趙知章 計畫參與人員： 碩士班研究生-兼任助理人員：李曉怡 碩士班研究生-兼任助理人員：黃鉉豐 碩士班研究生-兼任助理人員：洪禎廷 公 開 資 訊 ： 本計畫涉及專利或其他智慧財產權，2 年後可公開查詢

中 華 民 國 101 年 11 月 27 日

中 文 摘 要 ： 蛋白激酶 CK2 是一種具有多種功能的絲胺酸/蘇胺酸蛋白質 激酶，其作用的受質眾多且普遍存在於哺乳類動物細胞中。 從許多的研究結果顯示，蛋白激酶 CK2 參與調節許多的神經 系統功能其中包括有神經保護作用，但是其分子層面的機制 目前尚未釐清。DARPP-32（Dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein, Mr 32 kDa）主要表現在紋狀體中型多刺狀 GABA 神經元中的蛋白質，參與調控與藥物成癮相關的多巴胺 訊息傳遞路徑，近年來的一些研究報告指出 DARPP-32 亦參與 了細胞的抗凋亡作用。雖然先前已有研究發現 DARPP-32 Ser102 胺基酸是 CK2 的磷酸化作用受質，但是並沒有進一步 的研究證實，該胺基酸的磷酸化作用是否參與 CK2 所調控的 細胞機制。屬於抗細胞凋亡蛋白 Bcl-2 家族成員之ㄧ的 bcl-x 基因會經由 pre-mRNA 選擇性剪裁機制（alternative splicing）而產生兩種異構蛋白 Bcl-xL 和 Bcl-xS，其中 Bcl-xL 蛋白被證實會促進細胞存活；而 Bcl-xS 蛋白則會造 成細胞死亡。研究結果發現，轉染野生型 CK2α DNA 質體會 增加 DARPP-32 Ser102 的磷酸化現象、Bcl-xL 的蛋白質表現 以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例；而處理 CK2 抑制劑 TBB 則會降低 DARPP-32 Ser102 的磷酸化現象、Bcl-xL 的蛋白質 表現以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例。此外，轉染 DARPP-32 siRNA 會降低 Bcl-xL 的蛋白質表現。轉染模擬之磷酸化 構型的 DARPP-32 S102D DNA 質體會增加 Bcl-xL 的蛋白質表 現以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例；但是，轉染突變型 DARPP-32 S102A DNA 質體則會降低 Bcl-xL 的蛋白質表現以 及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例。利用過氧過氫產生細胞氧化 逆境下，CK2α 或 DARPP-32 siRNA 處理可以顯著降低 DARPP-32 Ser102 的磷酸化現象、Bcl-xL 的蛋白質表現以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例，同時會顯著造成細胞凋亡。 中文關鍵詞： 蛋白激酶 CK2、DARPP-32 蛋白、抗細胞凋亡 Bcl-xL 蛋白、促 細胞凋亡 Bcl-xS 蛋白、抗細胞凋亡

英 文 摘 要 ： Protein kinase CK2 is a multifunctional

serine/threonine protein kinase with many protein substrares and is ubiquitously expressed in mammalian cells. Many studies have shown that CK2 is involved in many neuronal functions including neuroprotection, but its cellular mechanisms are not well-studied. DARPP-32 (Dopamine- and cAMP-regulated

phosphoprotein, Mr 32 kDa) is highly enriched in striatal medium-size spiny GABA neurons and is a prominent mediator of dopamine signalling which

relates with drug abuse. Beside its well-known function in drug abuse, recent studies also reveal that DARPP-32 may be involved in the anti-apoptotic effects. Although the Ser102 residue of DARPP-32 is a phosphorylation site for CK2, this phosphorylation-mediated CK2 signaling has not been studied yet. The bcl-x gene, one member of the Bcl-2 family, encodes two isoform proteins Bcl-xL and Bcl-xS by the pre-mRNA alternative splicing. The former increases cell survival and the later enhances cell apoptosis. Our results revealed that DARPP-32 Ser102

phosphorylation, Bcl-xL protein level and Bcl-xL/Bcl-xS mRNA ratio were all increased by wild-type CK2α plasmid DNA transfection. Meanwhile, CK2 inhibitor TBB treatment decreased DARPP-32 Ser102

phosphorylation, Bcl-xL protein level and Bcl-xL/Bcl-xS mRNA ratio. On the other hand, DARPP-32 siRNA transfection decreased Bcl-xL protein level.

Furthermore, transfection of DARPP-32 S102D, which mimics the constitutive phosphorylation form, increased whereas transfection of mutant S102A

decreased the Bcl-xL protein level and Bcl-xL/Bcl-xS mRNA ratio. From the results of H2O2-induced

oxidative stress experiments, we also found that prior knock-down of CK2a or DARPP-32 can aggravate the decrease in DARPP-32 Ser102 phosphorylation, Bcl-xL protein level and Bcl-Bcl-xL/Bcl-xS mRNA ratio by H2O2 treatment.

英文關鍵詞： protein kinase CK2, DARPP-32, Bcl-xL, Bcl-xS, anti-apoptosis

行政院國家科學委員會補助專題研究計畫

■成果報告

□期中進度報告

蛋白激酶

CK2

之細胞訊息傳遞路徑中

DARPP-32

蛋白所扮演的角

色：對大鼠學習記憶和抗細胞凋亡機制的影響

計畫類別：■個別型計畫 □整合型計畫

計畫編號：

NSC 98-2320-B-004-002-MY3

執行期間： 2009 年 08 月 01 日至 2012 年 07 月 31 日

執行機構及系所：國立政治大學神經科學研究所

計畫主持人：趙知章

共同主持人：

計畫參與人員：李曉怡、黃鉉豐、洪禎廷

成果報告類型(依經費核定清單規定繳交)：□精簡報告 ■完整報告

本計畫除繳交成果報告外，另須繳交以下出國心得報告：

□赴國外出差或研習心得報告

□赴大陸地區出差或研習心得報告

□出席國際學術會議心得報告

□國際合作研究計畫國外研究報告

處理方式：

除列管計畫及下列情形者外，得立即公開查詢

■涉及專利或其他智慧財產權，□一年■二年後可公開查詢

中 華 民 國 101 年 11 月 27 日

中文摘要

蛋白激酶 CK2 是一種具有多種功能的絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶，其作用的受質眾 多且普遍存在於哺乳類動物細胞中。從許多的研究結果顯示，蛋白激酶 CK2 參與調節 許多的神經系統功能其中包括有神經保護作用，但是其分子層面的機制目前尚未釐清。 DARPP-32（Dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein, Mr 32 kDa）主要表現 在紋狀體中型多刺狀 GABA 神經元中的蛋白質，參與調控與藥物成癮相關的多巴胺訊 息傳遞路徑，近年來的一些研究報告指出 DARPP-32 亦參與了細胞的抗凋亡作用。雖 然先前已有研究發現DARPP-32 Ser102 胺基酸是 CK2 的磷酸化作用受質，但是並沒 有進一步的研究證實，該胺基酸的磷酸化作用是否參與 CK2 所調控的細胞機制。屬於 抗細胞凋亡蛋白 Bcl-2 家族成員之ㄧ的 bcl-x 基因會經由 pre-mRNA 選擇性剪裁機制 （alternative splicing）而產生兩種異構蛋白 Bcl-xL 和 Bcl-xS，其中 Bcl-xL 蛋白被證實 會促進細胞存活；而Bcl-xS 蛋白則會造成細胞死亡。研究結果發現，轉染野生型 CK2α DNA 質 體會 增加 DARPP-32 Ser102 的磷 酸化現 象、Bcl-xL 的蛋白 質表 現以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例；而處理 CK2 抑制劑 TBB 則會降低 DARPP-32 Ser102 的磷酸化現象、Bcl-xL 的蛋白質表現以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例。此外，轉染 DARPP-32 siRNA 會降低 Bcl-xL 的蛋白質表現。轉染模擬之磷酸化構型的 DARPP-32 S102D DNA 質體會增加 Bcl-xL 的蛋白質表現以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例；但是， 轉 染 突 變 型 DARPP-32 S102A DNA 質 體 則 會 降 低 Bcl-xL 的 蛋 白 質 表 現 以 及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例。利用過氧過氫產生細胞氧化逆境下，CK2α 或 DARPP-32 siRNA 處理可以顯著降低 DARPP-32 Ser102 的磷酸化現象、Bcl-xL 的蛋白質表現以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比例，同時會顯著造成細胞凋亡。

關鍵字：蛋白激酶CK2、DARPP-32 蛋白、抗細胞凋亡 Bcl-xL 蛋白、促細胞凋亡 Bcl-xS 蛋白、抗細胞凋亡

Abstract

Protein kinase CK2 is a multifunctional serine/threonine protein kinase with many protein substrares and is ubiquitously expressed in mammalian cells. Many studies have shown that CK2 is involved in many neuronal functions including neuroprotection, but its cellular mechanisms are not well-studied. DARPP-32 (Dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein, Mr 32 kDa) is highly enriched in striatal medium-size spiny GABA neurons and is a prominent mediator of dopamine signalling which relates with drug abuse. Beside its well-known function in drug abuse, recent studies also reveal that DARPP-32 may be involved in the anti-apoptotic effects. Although the Ser102 residue of DARPP-32 is a phosphorylation site for CK2, this phosphorylation-mediated CK2 signaling has not been studied yet. The bcl-x gene, one member of the Bcl-2 family, encodes two isoform proteins Bcl-xL and Bcl-xS by the pre-mRNA alternative splicing. The former increases cell survival and the later enhances cell apoptosis. Our results revealed that DARPP-32 Ser102 phosphorylation, Bcl-xL protein level and Bcl-xL/Bcl-xS mRNA ratio were all increased by wild-type CK2α plasmid DNA transfection. Meanwhile, CK2 inhibitor TBB treatment decreased DARPP-32 Ser102 phosphorylation, Bcl-xL protein level and Bcl-xL/Bcl-xS mRNA ratio. On the other hand, DARPP-32 siRNA transfection decreased Bcl-xL protein level. Furthermore, transfection of DARPP-32 S102D, which mimics the constitutive phosphorylation form, increased whereas transfection of mutant S102A decreased the Bcl-xL protein level and Bcl-xL/Bcl-xS mRNA ratio. From the results of H2O2-induced oxidative stress experiments, we also found that prior knock-down of CK2 or DARPP-32 can aggravate the decrease in DARPP-32 Ser102 phosphorylation, Bcl-xL protein level and Bcl-xL/Bcl-xS mRNA ratio by H2O2 treatment.

前言

蛋白激酶 CK2 是一種普遍存在於細胞質、細胞核以及其他胞器中且具有調控細胞 週期、細胞增生、細胞分化功能的絲胺酸/蘇胺酸的蛋白質激酶 (serine/threonine protein kinase)，具有一個四聚體蛋白質結構，其中兩個是具有酵素催化活性的 α、α’ 次單元， 其餘兩個則是具有調控功能的 β 次單元，因此可形成的異四聚體 (heterotetramers) 的形式有 2β2、’2β2、’β2 (Chester et al., 1995)。研究發現剃除蛋白激酶 CK2 次 單元基因，會造成小鼠的胚胎致死 (Lou et al., 2008)，而剃除 β 次單元基因的小鼠， 則發現其胚胎體積比一般正常胚胎體積顯著較小，雖然沒有觀察到細胞凋亡的情形，但 對細胞增生有抑制的現象 (Buchou et al., 2003, Lou et al., 2008)，顯示蛋白激酶 CK2 對個體胚胎發育扮演重要的調節功能。蛋白激酶 CK2 有超過 300 種的受質，這些受 質涉及在訊息傳遞路徑、細胞骨架、蛋白質合成、轉錄因子以及核酸合成等等 (Meggio and Pinna, 2003)，舉例來說，在細胞骨架的相關研究發現，N2A 神經母細胞瘤中的 MAP-1B (microtubule- associated protein 1B) 磷酸化現象會因 CK2 的作用而增加， 並且與細胞的分化過程有相關性 (Diaz-Nido et al., 1988)；此外，也有研究文獻指出， p53 蛋白在 CK2 磷酸化的作用下可持續維持其活化態不易被去磷酸化，進而影響細胞 週期與促進細胞凋亡 (McKendrick et al., 1999)。由於 CK2 的受質種類繁多且在細胞內 的分布非常廣泛，因此，CK2 所參與調控的細胞功用和機制亦相對眾多，蛋白激酶 CK2 被發現會促進癌細胞的抗細胞凋亡功能，在肝癌細胞的研究發現，給予 emodine 抑制 蛋白激酶 CK2 會顯著增強與腫瘤壞死因子死亡配體 (Death ligand) 相關的細胞凋亡 誘發配體 (Tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL）所誘發的 細胞凋亡和自然殺手細胞 (Natural killer cell) 所誘發的細胞凋亡 (Kim et al., 2008b)； 在正常細胞中的 CK2 是均勻分布於細胞質和細胞核，但在前列腺癌病患的細胞中卻發 現 CK2 在細胞核中的表現量顯著增加，且病患顯示有較高的不良預後因子 (Laramas et al., 2007)，此外， CK2 亦被發現會對屬於 Bcl-2 蛋白家族成員中促進細胞凋亡之 Bid 蛋白的 serine 胺基酸進行磷酸作用化，抑制 Bid 蛋白被 caspase-8 的裁切活 化，進而促進 HeLa 細胞的存活 (Desagher et al., 2001)。這些研究結果均顯示蛋白激 酶 CK2 會增加細胞的存活能力。在神經細胞方面，蛋白激酶 CK2 普遍存在於大腦， 且發現在皮質、海馬迴、尾狀核-被殼 (caudate-putamen) 中有大量的表現 (Girault et al., 1990)，後續的研究亦發現在海馬迴 CA1 區域產生 long-term potentiation (LTP) 時會伴隨 CK2 的被高度活化現象 (Charriaut-Marlangue et al., 1991)，而在阿茲海默 症 和 精 神 分 裂 症 病 人 大 腦 皮 質 的 蛋 白 激 酶 CK2 表 現 量 則 發 現 會 顯 著 的 減 少 (Aksenova et al., 1991)，這些研究結果顯示 CK2 參與了神經系統的功能運作。相關神 經細胞中 CK2 酵素活性調節的研究文獻則指出，大腦衍生滋養因子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 和神經滋養因子 NT-4 (neurotrophin-4) 會增加在大鼠海 馬迴腦區之CK2 的酵素活性 (Blanquet, 1998)；而在與神經細胞保護機制的相關研究 中亦發現，大腦衍生滋養因子會促進大鼠海馬迴腦區細胞的 CK2 酵素活性，進而增加 NF-B (Nuclear Factor Kappa B) 調節抗細胞凋亡蛋白 Bcl-xL 基因表現的效果(Chao et al., 2011)；除此之外，在大鼠黑質 (Substantia nigra) 腦區的研究亦發現神經膠細胞

滋養因子 (Glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF) 會增加蛋白激酶 CK2 的 活性進而保護多巴胺神經細胞 (Chao et al., 2006)。綜合上述的研究文獻可得知，蛋白 激酶 CK2 對神經細胞的抗凋亡也具有促進的作用。

DARPP-32 主 要 表 現 在 紋 狀 體 (Striatum) 之 中 型 多 刺 狀 GABA 神 經 元 (medium-sized spiny GABA neurons) (Ouimet et al., 1984, Walaas and Greengard, 1984)。針對 DARPP-32 與基因表現的研究指出，活化多巴胺 D1 受體和 NMDA 麩氨 酸 (glutamate) 受體，透過 DARPP-32 的調節可抑制第一型蛋白質磷酸水解酶 PP1 而 增 加 extracellular signal-regulated kinase (ERK) 磷 酸 化 ， 進而 影 響 基因 轉 錄 (Valjent et al., 2005)；多巴胺活化 D1 受體進而活化蛋白激酶 PKA 會增加轉錄因子 CREB (cAMP responsive element binding protein) Ser133 位置的磷酸化，而第一型蛋 白質磷酸水解酶 PP1 作用會使得 CREB Ser133 位置去磷酸化 (Liu and Graybiel, 1996)，CREB 的磷酸化會調節一些早期即時表現基因 (immediate early genes) 的表 現。因此，藉由DARPP-32 抑制第一型蛋白質磷酸水解酶 PP1 可以增加轉錄因子、神 經傳遞物質受體和離子通道的磷酸化進而增強突觸的功能和可塑性(Greengard et al., 1999)。雖然 DARPP-32 被認為主要是廣泛表現在細胞質的蛋白質，但近期的研究亦發 現，在小鼠濫用藥物（如安非他命）或食物增強式學習 (Food reinforcement learning) 過程中可觀察到在紋狀體 DARPP-32 顯著累積在細胞核，並且 Thr 34 位置磷酸化 之 DARPP-32 也顯著累積在細胞核，發現是經由多巴胺 D1 受體的活化，進而活化蛋白 質磷酸水解酶 PP2A (protein phosphatase-2A)，蛋白質磷酸水解酶 PP2A 作用使得 DARPP-32 Ser 97 位置去磷酸化，也發現 DARPP-32 S97A 位置突變小鼠會改變小鼠 對濫用藥物的反應以及減少對食物酬賞的動機 (Stipanovich et al., 2008)。除了大量 DARPP-32 在藥 物成癮 、運動 協調的 研究外， 在胃癌 細胞發 現到 DARPP-32 和 t-DARPP (truncated isoform of DARPP-32) 基因大量表現，t-DARPP 的磷酸化位置和 DARPP-32 相比為 Thr34 位置缺失 (El-Rifai et al., 2002)，而 DARPP-32 的大量表 現會維持粒線體的膜電位 (mitochondrial transmemberane potential)、增加抗細胞凋亡 蛋白 Bcl-2 的表現而抑制細胞凋亡 (Belkhiri et al., 2005)，顯示 DARPP-32 也具有抗 細胞凋亡功用。

Bcl-x 是屬於 Bcl-2 蛋白家族的成員之ㄧ，其 mRNA 在 Exon 2 發生 alternative splicing 後，經轉譯作用產生具有抗細胞凋亡功能的 Bcl-xL 和促細胞凋亡功能的 Bcl-xS。在癌細胞發現有 Bcl-xL 大量表現，而大量表現 Bcl-xL 會抑制細胞凋亡並且 增加腫瘤對化學療法的抗性 (Liu et al., 1999)，在神經母細胞瘤細胞株 (neuroblastoma cell line) 發現 Bcl-xS 會抑制細胞的存活增加細胞凋亡 (Dole et al., 1996)，給予初級 培養大鼠皮質神經細胞安非他命發現會造成神經細胞的凋亡，並且可觀察到 Bcl-xL 的 表現減少 Bcl-xS 表現增加 (Stumm et al., 1999)。在癌細胞的研究則發現 Bcl-x 的 alternative splicing 會受到 ceramide 調節，ceramide 會促使調節 alternative splicing 的因子 SR 蛋白質 (serine/arginine-rich protein) 去磷酸化，而SR 蛋白質則被證實為 第一型蛋白質磷酸水解酶 PP1 的受質。研究發現給予肺癌細胞 ceramide 處理或增加 內生性的 ceramide，或對不同的癌細胞像是子宮頸癌、前列腺癌或乳癌細胞給予蛋白 質合成抑制劑 emetine 後，皆發現 Bcl-xL 的表現減少並伴隨著 Bcl-xS 表現增加，若

再給予第一型蛋白質磷酸水解酶 PP1 和蛋白質磷酸水解酶 PP2A 的抑制劑 calyculin A 則會阻斷 ceramide 和 emetine 所誘發的 alternative splicing 變化，而給予蛋白質 磷酸水解酶 PP2A 特定的抑制劑 okadaic acid 則不會影響 Bcl-x 的 alternative splicing，顯示 Bcl-x 的 alternative splicing 調控作用是透過第一型蛋白質磷酸水解酶 PP1 (Chalfant et al., 2002, Boon-Unge et al., 2007)。

早先許多的研究已指出神經退化性疾病像是阿茲海默症、巴金森氏症、亨丁頓舞蹈 症，皆會有細胞凋亡之現象，且發現在阿茲海默症和精神分裂症病人其大腦皮質蛋白激 酶 CK2 的表現顯著減少。由於 DARP-32 已被證實是蛋白激酶 CK2 的受質，在癌細 胞的研究也發現蛋白激酶 CK2 和 DARPP-32 皆有大量的表現，並且具有抗細胞凋亡 功能，因此，研究目的欲進一步探討，蛋白激酶 CK2 的抗凋亡機制是否是透過調控 DARPP-32 的磷酸化作用，進而增加具有抗細胞凋亡功用之 Bcl-xL 的表現以及減少具 有促進細胞凋亡功用之 Bcl-xS 的表現，以及此細胞訊息傳遞路徑是否參與在逆境環境 中對細胞的保護機。

材料與方法

細胞培養

實驗所使用的細胞株為大鼠 PC12 細胞株，培養於含有 5％ 胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS) 和 10％ 馬血清 (Horse serum, HS) 的 DMEM 培養液中，此細 胞株為貼附型的細胞，為使 PC12 細胞能貼附於培養盤。

質體製備

所用之 Flag-tagged DARPP-32 質體的建構是使用 PC12 細胞之 cDNA 以聚合 酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction) 來選殖 DARPP-32 基因全長的核苷酸，所 使用的引子為 5’-CGC GAA TTC ATG GAC CCC AAG GAC CGC-3’ (底線標示的序列 為 EcoR 切位，ATG 為起始密碼子) 和 5’-GCT CTC GAG TTA TGT GCC GGA CTC AGG -3’ (底線標示的序列為 Xho 切位，TTA 為終止密碼子)。實驗使用 QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) 將 DARPP-32 Ser102 位置的密碼子 TCG 突變為 Ala 密碼子 GCG 以下簡稱 DARPP-32 S102A 所使用的引子為 F： 5’-GTG AGA ACC AGG CCG CGG AGG AAG AGG ACG AG -3’ ，R：5’-CTC GTC CTC TTC CTC CGC GGC CTG GTT CTC AC -3’和 DARPP-32 Ser102 位置的密碼 子 TCG 突變為 Asp 密碼子 GAC 以下簡稱 DARPP-32 S102D 所使用的引子為 F：5’-CCT GAG TGA GAA CCA GGC CGA CGA GGA AGA GGA CGA G -3’ ，R： 5’-CTC GTC CTC TTC CTC GTC GGC CTG GTT CTC ACT CAG G -3’ ，接著將構築 的DNA 質體送交進行核苷酸定序分析，確認 DARPP-32 S102A 和 DARPP-32 S102D 確實為突變型的質體。

DARPP-32 S102 位置磷酸化抗體製備

根據 Hamada 等學者的研究文獻 (Hamada et al., 2005)，針對大鼠 DARPP-32 Ser102 位置磷酸化設計一段 Ser102 攜帶磷酸根的 peptide [SENQA(pS)EEE]，並委 託濁水溪生物科技股份有限公司 (LTK BioLaboratories) 合成 peptide 及進行兔子免疫 反應，所獲得之抗體再利用西方點墨法分析對 Ser102 位置磷酸化的辨識專一性。 藥物處理

實 驗 使 用 蛋 白 激 酶 CK2 抑 制 劑 4,5,6,7- tetrabromobenzotriazole (TBB ； Calbiochem)，TBB 的作用為對 CK2 造成 ATP/GTP 競爭的抑制劑 (Sarno et al., 2001)。TBB 先以 1 ml 的細胞等級 Dimethyl sulfoxide (DMSO, sigma) 溶解，再取部 份稀釋至 10 mM，再以 10 mM TBB 與培養液稀釋為 50 M 加入細胞培養盤，作用 24 小時後再萃取蛋白質進行西方點墨法 (Western blot)。另外也使用 30％ Hydrogen peroxide solution (sigma)，以培養液稀釋成 250 M，加入經轉染 CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 之細胞培養盤，作用 24 小時後再萃取 RNA 進行即時定量聚合酶 連鎖反應 (Quantitative real-time polymerase chain reaction)。

西方點墨法

PC12 細胞依實驗需求經藥物或轉染處理後，加入含有蛋白酶抑制劑 (Calbiochem) 以 及磷酸酶抑制劑 (Calbiochem) 的裂解緩衝液，裂解緩衝液 (pH＝8.0) 的成分為 50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl 、2 mM EDTA、1％ NP40，在 4 ℃ 下以 14000 ×g 轉 速離心 10 分鐘，離心後抽取上清液進行蛋白質電泳分離及轉漬 PVDF 膜 (Millipore)。 以 0.05% TBST 緩衝液所配製的初級抗體於 4 ℃環境下反應 16-18 小時。初級抗體 包含 mouse anti-actin antibody (1：100000, Chemicon)、mouse anti-CK2α antibody (1：4000, Abcam)、rabbit anti-DARPP-32 antibody (1：1000, Cell Signaling)、 customized rabbit anti-phospho-DARPP-32 (Ser102) antibody (1 ： 3000, LTK BioLaboratories)、mouse anti-Bcl-x antibody (1：1000, Chemicon)。使用影像系統 ( AVEGENE) 進行冷光訊號擷取，所得結果使用 NIH Image J 軟體進行量化分析。 即時定量聚合酶連鎖反應

使用 Applied Biosystem 7300 Real-Time PCR System 進行即時定量聚合酶連鎖 反應，並使用 Maxima SYBR Green /ROX qPCR master mix (Fermentas) 進行基因 表現量分析。實驗反應條件為：50 ℃ 2 mins，95 ℃ 10 mins，95 ℃ 15 secs，60 ℃ 1 min 共 40 cycles。反應完成後，利用儀器所附之軟體進行數據分析，測定出 Ct 值 再帶入公式算出標的基因與 HPRT 的相對值，進行分析。Bcl-xL 和 Bcl-xS 引子的設 計根據 Bcl-X 基因經 alternative splicing 後，Bcl-xS 和 Bcl-xL 相比在 Exon 2 靠近 3’ 處缺失，因此 Bcl-xL 和 Bcl-xS 設計相同的 forward 引子，Bcl-xS 的 reverse 引 子設計在跨 Exon 2a 和 Exon 3的位置，Bcl-xL 的 reverse 引子則設計在 Exon 2b的 位置(Boon-Unge et al., 2007)。

TUNEL assay

實驗使用 Apoptag plus peroxidase in situ apoptosis detection kit (Chemicon) 偵 測細胞凋亡。在顯微鏡明視野下以 20× 物鏡隨機取 10 個區域，每個區域再隨機取 3 個區域做細胞計數，實驗數值以 Apoptosis cells/ 100 cells 表示。

統計分析

實驗結果數據以 Sigmastat 軟體進行分析，當實驗組別為對照組和實驗組兩組 時，要比較兩者之間的差異時以 Sigmastat 軟體中的 Student’s t-test 統計方式進行分 析，而當實驗組別為三組或三組以上時，則使用 Sigmastat 軟體中的單因子變異數分 析 (One-way analysis of variance with repeated measure, one-way ANOVA) 進行統 計分析，若欲比較任一實驗組與對照組的差異，使用 Dunnett’s t-test 進行事後比較， 若是比較實驗各組間的差異，則使用 Student Newman-kuel’s method 進行事後比較。 統計分析結果顯著差異表示方法： 表示 p<0.05， 表示 p<0.01。

實驗結果

細胞在接受野生型 CK2WT DNA 質體轉染後，以西方點墨法分析，結果顯示轉染 野生型的CK2WT DNA 質體確實會在細胞內進行基因表現，造成細胞內 CK2 蛋白 質的表現量增加並且達到統計上顯著差異 (p<0.01 by Student’s t-test)（圖一），同時也 可以發現 DARPP-32 Ser102 位置的磷酸化現象有顯著性增加 (p<0.01 by Student’s t-test) (圖二 B)，而 DARPP-32 蛋白質則無顯著差異 (p＞0.05 by Student’s t-test) (圖 二 C)，並且也會顯著促進 Bcl-xL 蛋白質的含量 (p<0.01 by Student’s t-test) (圖二 D)。以 real-time PCR 進行定量分析實驗結果顯示，Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比值有顯 著性增加 (p<0.01 by Student’s t-test) (圖二 E)。

過度表現（over-expression）CK2WT 可有效增加細胞內 DARPP-32 Ser102 磷 酸化以及抗細胞凋亡蛋白 Bcl-xL 的蛋白質含量，但是抑制 CK2 活性是否也同樣可以造 成DARPP-32 Ser102 磷酸化以及 Bcl-xL 蛋白質含量的減少？因此實驗接著同樣使用 西方點墨法來觀察 CK2 抑制劑 TBB 對細胞 DARPP-32 Ser102 磷酸化以及 Bcl-xL 蛋白質含量的影響，所選用的 TBB 濃度依據實驗室先前研究中處理 50 M TBB 可有 效影響 CK2 作用的下游分子。實驗結果發現 50 M TBB 處理 24 小時後，可顯著降 低 DARPP-32 Ser102 的磷酸化 (p<0.01 by Student’s t-test) (圖三 B)，而 DARPP-32 蛋白質含量無顯著差異 (p＞0.05 by Student’s t-test) (圖三 C)，同時 Bcl-xL 的蛋白質 含量會顯著減少 (p<0.05 by Student’s t-test) (圖三 D)。以 real-time PCR 進行定量分 析結果則顯示 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比值有顯著性減少 (p< 0.05 by Student’s t-test) (圖三 E)。因此，由實驗結果推論抑制 CK2 活性會顯著降低 DARPP-32 Ser102 位置 的磷酸化、抗細胞凋亡蛋白 Bcl-xL 的蛋白質含量以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 表現。 從上述實驗的實驗結果可以確認調控 CK2 會影響 DARPP-32 Ser102 的磷酸 化以及Bcl-xL 蛋白質的含量和 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA，但是 DARPP-32 是否參與 CK2α 對Bcl-xL 調控的細胞訊息傳遞路徑？因此，實驗設計首先是利用 DARPP-32 siRNA 觀 察抑制內生性的 DARPP-32 是否會影響細胞內 Bcl-xL 蛋白質含量和 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的表現。首先，將細胞分別轉染單獨一組及兩組合用的 DARPP-32 siRNA 後， 使用西方點墨法分析，由圖四可以觀察到，轉染 DARPP-32 siRNA 可以顯著影響內生 性 DARPP-32 蛋白質表現 (p<0.01) 其中，轉染兩組合用的 DARPP-32 siRNA 和對 照組相比，顯著減少內生性 DARPP-32 蛋白質表現 (p<0.01 by Dunnett’s t-test)。而 在圖五的實驗結果顯示轉染 DARPP-32 siRNA 後會顯著影響 Bcl-xL 蛋白質含量 (F3,28=12.115, p<0.01)，其中轉染兩組合用的 DARPP-32 siRNA 的組別和對照組相比 顯著減少 Bcl-xL 蛋白質含量 (p<0.01 by Dunnett’s t-test) (圖五 A)；雖然以 real-time PCR 定量分析的結果則顯示 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 表現並無顯著差異 (圖五 B)，但 是，從上述實驗結果可以證實 DARPP-32 確實參與 Bcl-xL 蛋白質含量的細胞調節機 制。

由上述實驗可知，調控 DARPP-32 蛋白質含量確實會影響 Bcl-xL 的蛋白質表 現，實驗欲進一步確認 DARPP-32 Ser102 的磷酸化現象是否參與 Bcl-xL 的調控作用？ 實驗首先以核苷酸定點突變 （site directed mutagensis）技術來構築模擬 Ser102 磷酸

化現象之突變型的 DARPP-32 S102D DNA 質體，將 DARPP-32 Ser102 位置的密碼 子 TCG 突變為 Asp 密碼子 GAC，以及構築模擬 Ser102 無法被磷酸化之突變型的 DARPP-32 S102A DNA 質體，將 DARPP-32 Ser102 位置的密碼子 TCG 突變為 Ala 密碼子 GCG，並將此 DNA 質體送交定序分析，確認成功構築了 DARPP-32 S102D 和 DARPP-32 S102A DNA 質體。

接 著 將 細 胞 分 別 進 行 野 生 型 DARPP-32 、 突 變 型 DARPP-32 S102D 或 DARPP-32 S102A DNA 質體 48 小時後，以西方點墨法分析，由圖十一實驗結果顯示 轉染野生型 DARPP-32 或突變型 DARPP-32 S102D DNA 質體，其細胞 DARPP-32 的表現量確實有增加的情形 (圖六 A)，且 Bcl-xL 蛋白質的含量有顯著變化 (p<0.05)， 其中，處理突變型 DARPP-32 S102D DNA 質體和對照組相比，Bcl-xL 蛋白質的含量 有顯著性的增加 (p<0.05 by Dunnett’s t-test) (圖六 B)，以 real-time PCR 定量分析實 驗結果則顯示 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比值有顯著增加 (p<0.05 by Student’s t-test) (圖六 C)。圖十二的實驗結果則顯示，轉染野生型 DARPP-32 或突變型 DARPP-32 S102A DNA 質體，其細胞 DARPP-32 的蛋白質含量確實有增加的情形 (圖七 A)，並 且 Bcl-xL 蛋白質的含量有顯著變化 (p<0.01)，其中處理突變型 DARPP-32 S102A DNA 質體和對照組相比，其 Bcl-xL 蛋白質的含量有顯著降低 (p<0.01 by Dunnett’s t-test) (圖七 B)，而且以 real-time PCR 定量分析實驗結果則顯示 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比值亦有顯著降低 (p<0.05 by Student’s t-test) (圖七 C)。從上述的實驗結果顯示細 胞內DARPP-32 S102 磷酸化確實與 Bcl-xL 基因表現的調控具有相關性。

實驗欲進一步確認蛋白激酶 CK2 和 DARPP-32 是否在遭受壓力下，扮演著更重 要的保護角色？實驗首先對細胞轉染 CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 後，再處理過 氧化氫 (Hydrogen peroxide)，以西方點墨法進行分析，所選用的濃度依據 Jang and Surh, 2001; Cho et al., 2008 研究選擇處理 250 M 濃度進行實驗，實驗結果顯示 CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 和過氧化氫共同處理對 CK2、DARPP-32 Ser102 的磷酸化、DARPP-32、Bcl-xL 蛋白質表現之單因子變方統計分析皆有整體顯著差異 (p<0.01) (圖八)。其中轉染 CK2 siRNA 再處理過氧化氫和單獨處理過氧化氫相比可 顯著降低DARPP-32 Ser102 的磷酸化 (p<0.05 by Newman-Keul’s method, 圖八 C) 和 Bcl-xL 蛋 白 質 表 現 (p<0.01 by Newman-Keul’s method, 圖 八 E) ， 轉 染 DARPP-32 siRNA 再處理過氧化氫和對照組相比可顯著降低 DARPP-32 Ser102 的磷 酸化 (p<0.01 by Newman-Keul’s method, 圖八 C) 和 Bcl-xL 蛋白質表現 (p<0.01 by Newman-Keul’s method, 圖八 E)。以 real-time PCR 進行定量分析的實驗結果則顯 示，CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 和過氧化氫共同處理對 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 表現有整體顯著差異 (p<0.01)(圖八 F)。其中，轉染 CK2 siRNA 再處理過氧化氫和 單 獨 處 理 過 氧 化 氫 相 比 可 以顯 著 降 低 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的 比 值 (p<0.05 by Newman-Keul’s method)。而單獨 DARPP-32 siRNA 轉染處理並無達到統計差異，但 轉 染 DARPP-32 siRNA 後 再 處 理 過 氧 化 氫 和 對 照 組 相 比 則 可 以 顯 著 降 低 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比值 (p<0.05 by Newman-Keul’s method)。綜合上述的實驗 結果顯示，抑制細胞蛋白激酶 CK2 和 DARPP-32 表現會加劇細胞在氧化壓力逆境下 DARPP-32 Ser102 的磷酸化、Bcl-xL 蛋白質含量的減少以及 Bcl-xL /Bcl-xS mRNA

表現比值的下降。

實驗進一步確認是否會影響細胞存活？實驗首先對細胞轉染 CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 後，再處理 250 M 過氧化氫 (Hydrogen peroxide)，以 TUNEL 方 法觀察細胞凋亡。由實驗結果得知轉染 CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 對過氧化 氫處理之細胞凋亡程度整體達顯著差異(p<0.01，圖九 B)，過氧化氫處理和對照組相比 顯著增加細胞的凋亡 (p<0.01 by Newman-Keul’s method)，轉染 CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 再處理過氧化氫和單獨處理過氧化氫相比顯著增加細胞的凋亡 (p<0.01 by Newman-Keul’s method)。綜合上述的實驗結果顯示，抑制細胞蛋白激酶 CK2 和 DARPP-32 表現會加劇在氧化壓力逆境下細胞的凋亡。

討論

先前的研究文獻指出蛋白激酶 CK2 對癌細胞和神經細胞皆具有抗細胞凋亡的功 能 (Desagher et al., 2001, Kim et al., 2008b) ， 而 蛋白 激 酶 CK2 受 質之 一 的 DARPP-32 蛋白主要表現於接收多巴胺訊息的神經細胞 (Girault et al., 1989)，雖然 DARPP-32 在先前研究著重於探討其與多巴胺訊息傳遞的調控、藥物濫用、抗精神病 藥的相關性 (Greengard, 2001)，而後的研究亦發現在癌細胞中 DARPP-32 蛋白有大 量表現的現象並可增進癌細胞的存活 (Belkhiri et al., 2005)，因此，CK2 磷酸化 DARPP-32 蛋白是否為 CK2 之抗細胞凋亡的機制之ㄧ是本研究探討的重點。 DARPP-32 蛋白的 Ser102 胺基酸已被證實是 CK2 磷酸化作用的位置 (Girault et al., 1989)，但此磷酸化的作用是否會受到細胞內 CK2 基因表現變化而調控則尚未 被驗證，藉由轉染 CK2WT 質體、CK2 siRNA 以及處理 CK2 抑制劑 TBB 操弄 CK2 的基因表現或抑制其酵素活性來觀察 CK2 活性的增加或減少對 DARPP-32 Ser102 磷酸化的影響。雖然 CK2 的蛋白激酶活性才是真正會影響其下游受質磷酸化的 改變，而在-論文的實驗中僅以西方點墨法證明，轉染 CK2WT 質體或 CK2 siRNA 確實可以促進或抑制細胞內 CK2 蛋白質的表現，不過在先前所發表與 CK2 相關的 研究中已經證實，轉染 CK2WT DNA 質體在活體動物之黑質 (Substantia nigra) 腦 區的細胞中，確實可以顯著促進細胞內 CK2 的酵素激酶活性 (Chao et al., 2006)，因 此在實驗中發現細胞內 CK2 蛋白質的含量會因轉染 CK2WT 質體而增加的現象應 可推測反映在其酵素激酶活性的增加。此外，從轉染 CK2WT 質體會增加 DARPP-32 Ser102 磷酸化的實驗結果可以證實，調控細胞內 CK2 的基因表現會影響 DARPP-32 Ser102 磷酸化的變化，在給予 CK2 抑制劑 TBB 造成 DARPP-32 Ser102 磷酸化程度 減少的實驗結果同樣可以支持此一結論。調控蛋白激酶 CK2 除了會影響 DARPP-32 Ser102 的磷酸化外，改變細胞內 CK2基因表現的亦被證實也會影響其他蛋白質的磷 酸化現象，例如：在大鼠海馬迴轉染 CK2WT 質體的研究也發現會增加轉錄因子 NF-B (Nuclear Factor Kappa B) Ser-529 的磷酸化和 Bcl-xL 的基因表現，處理 TBB 會阻斷 BDNF 對促進海馬迴腦區細胞之 NF-B 的磷酸化和 Bcl-xL 的作用 (Chao et al., 2011) ；另外，針對 Jurkat 細胞處理 TBB 亦會發現可以抑制 Akt 的活性，對人 類前列腺癌細胞 (LNCaP cell line) 轉染 CK2 siRNA 也發現會抑制 Akt 的活性，而 Akt 的活化被認為具有抗細胞凋亡的功能 (Di Maira et al., 2005)。

DARPP-32 不同胺基酸的磷酸化已被證實對第一型蛋白質磷酸水解酶 PP1 的調 控扮演相當的重要性。研究文獻指出DARPP-32 Ser102 被 CK2 作用產生磷酸化後會 增強蛋白激酶 PKA 對 Thr 34 的磷酸化作用 (Girault et al., 1989)，進而抑制第一型蛋 白質磷酸水解酶 PP1 (Hemmings et al., 1984)，而 DARPP-32 Thr75 經細胞週期蛋白 依賴性激酶 CDK5 磷酸化作用後則會抑制蛋白激酶 PKA，進而解除其對第一型蛋白質 磷酸水解酶 PP1 的抑制作用 (Bibb et al., 1999)。此外，蛋白激酶 PKA 亦會經由活 化蛋白質磷酸水解酶 PP2A 而導致 DARPP-32 Thr75 的去磷酸化 (Nishi et al., 2000, Ahn et al., 2007)。由於蛋白質磷酸水解酶 PP1 活性的增加會導致 Bcl-xL mRNA 的表 現減少 (Yang et al., 2004)，綜合上述的文獻結果，在論文中發現調控 CK2 而影響

DARPP-32 Ser102 磷酸化的實驗結果可以推論對細胞內蛋白質磷酸水解酶 PP1 的活 性具有一定程度調節作用。

屬於 Bcl-2 家族的 Bcl-x 基因經 mRNA alternative splicing 後產生具有抗細胞凋 亡功能的 Bcl-xL 以及具有促進細胞凋亡功能的 Bcl-xS (Boise et al., 1993)，Bcl-xL 作 用維持粒線體外膜的完整性抑制粒線體外膜的通透性增加，進而抑制細胞色素 C (Cytochrome c) 釋放到細胞質中防止細胞凋亡 (Green and Reed, 1998)，而 Bcl-xS 的促細胞凋亡機制目前尚未明確，但研究指出 Bcl-xS 的表現會增加神經細胞和癌細胞 的凋亡 (Dole et al., 1996, Chalfant et al., 2002)。細胞調控 Bcl-xL 的機制除了可以經 由 IGF1 (Insulin-like growth factor 1) 透過 IGF1-R (Insulin-like growth factor 1 receptor) 作用活化 Akt 的訊息傳遞路徑 (Sekharam et al., 2003) 外，先前研究也發現 BDNF/CK2/NF-kB/Bcl-xL 的訊息傳遞路徑 (Chao et al., 2011) ，共同轉染 CK2WT 和 DARPP-32 S102A 的實驗結果顯示蛋白激酶 CK2 也可以透過 DARPP-32 Ser102 位置調控 Bcl-xL 蛋白質含量，確立了細胞內另外存在有一條 CK2/DARPP-32/Bcl-xL 的訊息傳遞路徑。

Bcl-x 是經由蛋白質磷酸水解酶 PP1 參與的 alternative splicing 機制而生成具有抗 細胞凋亡功能的 Bcl-xL 以及具有促進細胞凋亡功能的 Bcl-xS (Chalfant et al., 2002, Boon-Unge et al., 2007) ， 研 究 文 獻 指 出 ， 甲 硫 胺 酸 (methionine) 代 謝 產 物 S-adenosylmethionine (SAMe) 和 5-methylthioadenosine (MTA)處理促使肝癌細胞凋 亡的細胞機制即是增 加蛋白質磷酸水 解酶 PP1 的表現，進而使 調節 alternative splicing 的 SR (serine/arginine-rich protein) 蛋白產生去磷酸化作用而導致 Bcl-xL 的 表現的減少和Bcl-xS 表現的增加 (Yang et al., 2004)。雖然，先前的研究也發現在大 鼠 CA1 區域轉染 CK2WT DNA 質體會顯著增加 Bcl-xL mRNA 表現而轉染 CK2 siRNA 會顯著減少 Bcl-xL mRNA 表現是透過活化轉錄因子 NF-B 的細胞機制 (Chao et al., 2011)，但是並未觀察 Bcl-xS mRNA 表現的變化。從 CK2WT 和模擬磷酸化現 象的 DARPP-32 S102D DNA 質體轉染顯著增加 Bcl-xL 蛋白質表現和 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 比例，以及 CK2α siRNA 和突變型 DARPP-32 S102A DNA 質體轉染會減少 Bcl-xL 蛋白質表現和 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 比例的實驗結果顯示，CK2 除了可以透過 NF-B 調控 Bcl-x 基因轉錄作用外，同時也可以透過 DARPP-32 蛋白調控 Bcl-x mRNA 的alternative splicing 作用來促進細胞內 Bcl-xL 蛋白質含量。而轉染 CK2α siRNA 的 實驗結果顯示對 Bcl-xL 蛋白質減少的效果大於 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 比例的減少，在 其他研究發現 CK2 會作用磷酸化轉譯起始的分子 Eukaryotic translation initiation factor (eIF) 5 和 eIF2 (Meggio and Pinna, 2003, Homma et al., 2005)，推論可能是因 為 CK2 除了調控基因的轉錄外，還會作用調控轉譯過程而使得此結果的不同。 實驗中單獨處理 CK2 siRNA、DARPP-32 siRNA 雖然有效減少抗細胞凋亡蛋白 質 Bcl-xL 的表現，但轉染 DARPP-32 siRNA 並不會顯著減少 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的比值，雖然兩者 siRNA 對促進細胞凋亡也有統計上顯著性的差異，但是卻不會造成 細胞大量的死亡 (圖十四)。但是在轉染 CK2 siRNA、DARPP-32 siRNA 後再利用過 氧化氫產生氧化逆境的實驗結果可以發現，處理過氧化氫會降低DARPP-32 Ser102 的 磷酸化、Bcl-xL 蛋白質表現以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 比值，其中轉染 CK2 siRNA 再

處理過氧化氫和單獨處理過氧化氫相比更為顯著降低 DARPP-32 Ser102 的磷酸化和 Bcl-xL 蛋白質表現以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 比值，而轉染 DARPP-32 siRNA 再處理 過氧化氫和對照組相比可顯著降低 DARPP-32 Ser102 的磷酸化、Bcl-xL 蛋白質表現 以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 比值，並且實驗結果也顯示兩者 siRNA 處理後再處理過氧 化氫會顯著造成細胞凋亡，推論在細胞遭逢氧化逆境時，細胞內若 CK2 或 DARPP-32 的減少將會加劇氧化自由基對細胞的傷害，在其它研究發現處理 CK2 的抑制劑 DMAT 會增加活性氧化物 (reactive oxygen species, ROS) 的產生和 DNA 雙股斷裂造成細 胞凋亡 (Schneider et al., 2009)。活性氧化物(reactive oxygen species, ROS) 的傷害 是造成阿茲海默症的危險因子之一 (Gorman et al., 1996, Deigner et al., 2000)，先前 研究曾指出給予細胞處理過氧化氫後會顯著造成細胞死亡 (Jang and Surh, 2001, Cho et al., 2008, Kim et al., 2008a)，相關的研究則指出過氧化氫所造成的細胞凋亡傷害是 透過增加 caspase3 和 caspase 8 的活性以及抑制 JNK (c-Jun-N-terminal kinase) 的磷酸化，進而促進細胞凋亡 (Matsura et al., 1999; Kim et al., 2008a)。綜合上述的 實驗結果，證實CK2/ DARPP-32/ Bcl-xL 的訊息傳遞路徑存在於細胞中，進一步利用 過氧過氫製造細胞氧化逆境的實驗結果則可以推論，此條細胞訊息傳遞路徑對於細胞對 抗氧化逆境扮演相當程度的重要性。

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圖一、轉染野生型的CK2WT DNA 質體對 CK2 蛋白質表現的影響

細胞轉染 pcDNA3 或野生型的 CK2WT DNA 質體後，以西方點墨法分析 CK2 蛋白質含量。實 驗數值以 mean±SEM 表示，並以 Student’s t-test 方法進行統計分析；其中表示 p<0.01。

圖二、轉染 CK2WT DNA 質體對 DARPP-32 Ser102 位置的磷酸化、DARPP-32 和 Bcl-xL 蛋白質 含量以及 Bcl-xL /Bcl-xS mRNA 表現的影響

細胞轉染 pcDNA3 或野生型的 CK2WT DNA 質體後，以西方點墨法分析，圖 (A) 為蛋白質電泳 圖譜，(B) DARPP-32 Ser102 位置的磷酸化 (各實驗組別 n=8-9) 、(C) DARPP-32 蛋白質含量和 (D) Bcl-xL 蛋白質的含量；以及利用 real-time PCR 分析 (E) Bcl-xL /Bcl-xS mRNA 的表現。實驗數值以 mean±SEM 表示，並以 Student’s t-test 方法進行統計分析；其中 表示 p<0.05，表示 p<0.01。

圖三、CK2 抑制劑 TBB 對細胞中 DARPP-32 Ser102 位置的磷酸化、DARPP-32、Bcl-xL 蛋白質含量 以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 表現的影響

給予細胞處理 50 M TBB 24 小時後，以西方點墨法分析，圖(A) 蛋白質電泳圖譜，(B) DARPP-32 Ser102 的磷酸化（各實驗組別 n=6），(C) DARPP-32 蛋白質含量，(D) Bcl-xL 的蛋白質含量以及以 real-time PCR 定量分析 (E) Bcl-xL /Bcl-xS mRNA 的表現。實驗數值以 mean±SEM 表示，並以 Student’s t-test 方法進行分析統計；其中 表示 p<0.05，表示 p<0.01。

圖四、轉染 DARPP-32 siRNA 對細胞 DARPP-32 蛋白質表現的影響

分別對細胞轉染 Negative control siRNA、單獨一組及兩組合用（的 DARPP-32 siRNA 後，以西方 點墨法分析 DARPP-32 蛋白質表現。n=8-9，實驗數值以 mean±SEM 表示，並以 One way ANOVA 與 Dunnett’s t-test 方法進行統計分析；其中 表示 p<0.05，表示 p<0.01。

圖五、轉染 DARPP-32 siRNA 對細胞 Bcl-xL 蛋白質含量以及 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 表現的影響 分別對細胞轉染 Negative control siRNA、單獨一組及兩組合用的 DARPP-32 siRNA 後，以 (A) 西 方點墨法分析 Bcl-xL 蛋白質含量（各實驗組別 n=6-9），(B) real-time PCR 定量分析 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的表現（各實驗組別 n=5）。實驗數值以 mean±SEM 表示，實驗結果先以 One way ANOVA 再 以 Dunnett’s t-test 方法進行統計分析；其中 表示 p<0.05，表示 p<0.01。

圖六、轉染突變型 DARPP-32 S102D DNA 質體對細胞 Bcl-xL 蛋白質含量和 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的 表現的影響

分別對細胞轉染 pCMV、野生型 DARPP-32、突變型 DARPP-32 S102D DNA 質體後，以西方點 墨法分析 (A) DARPP-32 和 (B) Bcl-xL 蛋白質的含量(各實驗組別 n=5) 以及用 real-time PCR 定量分 析 (C) Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的表現 (各實驗組別 n=3)。實驗數值以 mean±SEM 表示，(A) 和 (B) 實 驗結果先以One way ANOVA 再以 Dunnett’s t-test 方法進行統計分析；(C) 實驗結果以 Student’s t-test 方法進行統計分析；其中 表示 p<0.05。

圖七、轉染突變型 DARPP-32 S102A DNA 質體對細胞 Bcl-xL 蛋白質含量和 Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的 表現的影響

分別對細胞轉染 pCMV、野生型 DARPP-32、突變型 DARPP-32 S102A DNA 質體後，以西方點墨 法 分 析 (A) DARPP-32 和 (B) Bcl-xL 蛋 白 質 的 含 量 ， 以 及 用 real-time PCR 定 量 分 析 (C) Bcl-xL/Bcl-xS mRNA 的表現。實驗數值以 mean±SEM 表示，(A) 和 (B) 實驗結果先以 One way ANOVA 再以 Dunnett’s t-test 方法進行統計分析；(C) 實驗結果以 Student’s t-test 方法進行統計分析； 其中 表示 p<0.05， 表示 p<0.01。

圖八、轉染 CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 對過氧化氫 (Hydrogen peroxide) 處理之細胞 CK2、 DARPP-32、DARPP-32 Ser102 的磷酸化、Bcl-xL 蛋白質含量以及 Bcl-xL /Bcl-xS mRNA 表 現的影響

對細胞轉染 CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 後，再處理 250 M H2O2，以西方點墨法分析進行

分析， 圖 (A) 蛋白質電泳圖譜，(B) CK2蛋白質含量、(C) DARPP-32 Ser102 的磷酸化、(D) DARPP-32 蛋白質含量 和 (E) Bcl-xL 蛋白質含量。圖 (F) 以 real-time PCR 進行 Bcl-xL /Bcl-xS mRNA 表現的 定量分析。實驗數值以 mean±SEM 表示，實驗結果先以 One way ANOVA 再以 Newman-Keul’s 方法 進行統計分析；表示 p<0.05，表示 p<0.01，其中：a 表示與對照組 Neg siRNA+PBS 相比之結果， b 表示與 Neg siRNA+H2O2 相比之結果，c 表示與 CK2 siRNA+PBS 相比之結果，d 表示與 DAR

圖九、轉染 CK2 siRNA 和 DARPP-32 siRNA 對過氧化氫處理之細胞凋亡的影響

分別對細胞轉染 CK2 siRNA 或 DARPP-32 siRNA 後，再處理 250 M H2O2後，使用 TUNEL 方

法觀察細胞凋亡。圖 (A) 因 methyl green 染色呈現藍色反應的細胞代表健康的細胞，而 DAB 染色呈現 褐棕色反應的細胞則為處在細胞凋亡狀態下的細胞，scale bar 為 25 m。圖 (B) 則為各個處理的細胞凋 亡定量柱狀圖。實驗數值以 mean±SEM 表示，實驗結果先以 One way ANOVA 再以 Newman-Keul’s 方法進行統計分析；表示 p<0.05，表示 p<0.01，其中：a 表示與對照組 Neg siRNA+PBS 相比之 結果，b 表示與 Neg siRNA+H2O2相比之結果，c 表示與 CK2 siRNA+PBS 相比之結果，d 表示與 DAR

國科會補助計畫衍生研發成果推廣資料表

日期:2012/11/27

國科會補助計畫

計畫名稱: 蛋白激酉每之細胞訊息傳遞路徑中DARPP-32蛋白所扮演的角色：對大鼠學習 記憶和抗細胞凋亡機制的影響 計畫主持人: 趙知章 計畫編號: 98-2320-B-004-002-MY3 學門領域: 生理

無研發成果推廣資料

98 年度專題研究計畫研究成果彙整表

計畫主持人：趙知章 計畫編號：98-2320-B-004-002-MY3 計畫名稱：蛋白激酉每之細胞訊息傳遞路徑中 DARPP-32 蛋白所扮演的角色：對大鼠學習記憶和抗細胞 凋亡機制的影響 量化 成果項目 實際已達成 數（被接受 或已發表） 預期總達成 數(含實際已 達成數) 本計畫實 際貢獻百 分比 單位 備 註 （ 質 化 說 明：如 數 個 計 畫 共 同 成 果、成 果 列 為 該 期 刊 之 封 面 故 事 ... 等） 期刊論文 0 0 100% 研究報告/技術報告 0 0 100% 研討會論文 0 0 100% 篇 論文著作 專書 0 0 100% 申請中件數 0 0 100% 專利 已獲得件數 0 0 100% 件 件數 0 0 100% 件 技術移轉 權利金 0 0 100% 千元 碩士生 1 3 100% 博士生 0 0 100% 博士後研究員 0 0 100% 國內 參與計畫人力 （本國籍） 專任助理 0 0 100% 人次 期刊論文 0 1 100% 研究報告/技術報告 0 0 100% 研討會論文 0 0 100% 篇 論文著作 專書 0 0 100% 章/本 申請中件數 0 0 100% 專利 已獲得件數 0 0 100% 件 件數 0 0 100% 件 技術移轉 權利金 0 0 100% 千元 碩士生 0 0 100% 博士生 0 0 100% 博士後研究員 0 0 100% 國外 參與計畫人力 （外國籍） 專任助理 0 0 100% 人次

其他成果

(

無法以量化表達之成 果如辦理學術活動、獲 得獎項、重要國際合 作、研究成果國際影響 力及其他協助產業技 術發展之具體效益事 項等，請以文字敘述填 列。) 無 成果項目 量化 名稱或內容性質簡述 測驗工具(含質性與量性) 0 課程/模組 0 電腦及網路系統或工具 0 教材 0 舉辦之活動/競賽 0 研討會/工作坊 0 電子報、網站 0 科 教 處 計 畫 加 填 項 目 計畫成果推廣之參與（閱聽）人數 0

國科會補助專題研究計畫成果報告自評表

請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況、研究成果之學術或應用價

值（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性）

、是否適

合在學術期刊發表或申請專利、主要發現或其他有關價值等，作一綜合評估。

1. 請就研究內容與原計畫相符程度、達成預期目標情況作一綜合評估

■達成目標

□未達成目標（請說明，以 100 字為限）

□實驗失敗

□因故實驗中斷

□其他原因

說明：

2. 研究成果在學術期刊發表或申請專利等情形：

論文：□已發表 □未發表之文稿 ■撰寫中 □無

專利：□已獲得 □申請中 ■無

技轉：□已技轉 □洽談中 ■無

其他：（以 100 字為限）

3. 請依學術成就、技術創新、社會影響等方面，評估研究成果之學術或應用價

值（簡要敘述成果所代表之意義、價值、影響或進一步發展之可能性）（以

500 字為限）

DARPP-32 蛋白主要表現在大腦紋狀體 medium spiny meuron 中，此種神經細胞參與了運動 起始和協調的功能，相關的退化性神經疾病如：巴金森氏症和亨丁頓氏症與此種神經細胞 的死亡皆有相關性，本研究成果證實蛋白激酶 CK2 調控於 DARPP-32 蛋白所參與的細胞訊 息傳遞路徑確實與抗細胞凋亡有關，對於藥物開發治療相關疾病提供了另一可行性的選 擇。