合成有潛力的抗癌化合物及利用人類穀氧還蛋白活化之抗癌化合物之前驅物

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合成有潛力的抗癌化合物及利用人類穀氧還蛋

白活化之抗癌化合物之前驅物

Synthesis of Potential Anticancer Agent and

Pro-anticancer Agent Activated by Human

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中文摘要

人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）為專門且有效地對麩胺基硫蛋白（protein-SSG）進行去麩胺基硫反應（deglutathionylation）的催化蛋白質。論文中主要是針對此還原機制設計藥物，以期釋放抗癌藥物於過度表現Glutaredoxin的癌細胞當中。本文所合成之藥物主要以石膽酸(Lithocholic acid)和鬼臼毒素(podophyllotoxin)為基底藥物進而修飾為人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）的受質，對含-SH基團中間產物測試α(2→3) 唾液酸轉移酶之生物活性和乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）的活性測試。在實驗室先前合成出具有活性的石膽酸（Lithocholic acid）衍生物中，首先挑選以石膽酸為骨架所衍生具有Asparate amino acid基團者(Li-O-Asp)為主要發展目標，其對

α(2→3)唾液酸轉移酶之IC50約為 12 μM，而合成之化合物 20 中，發

現多了-SH基團在尾端不僅可以增加抑制α(2→3)唾液酸轉移酶的活

性(IC50約為 7.5 μM)，在乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）活性測試中

亦可增加其殺死乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）的能力(23% 抑制效果)，並發現在石膽酸(Lithocholic acid)尾端的羧基團對於增加殺死乳癌細胞之毒性是必須的，而含有酯基尾端會阻礙其對乳癌細胞毒殺能力。而利用人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）還原機制釋放抗癌藥物於細胞當中之生物實驗測試都陸續在進行中。

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Abstract

Glutaredoxin, a member of the thiol-disulfide oxidoreductase (TDOR) enzyme family, catalyzes the reduction of protein-glutathionyl-mixed disulfides (protein-SSG). Based on the mechanistic pathway, the goal focuses on design and synthesis of inhibitor-glutathionyl-mixed disulfides (inhibitor-SSG), which might be effectively activated by glutaredoxin, overexpressed in several cancer cell lines. Synthesis of podophyllotoxin derivatives and lithocholic acid related compounds was achieved and several of them significantly displayed inhibitory property toward sialyltransferase and also notably inhibited the growth of breast cancer cell. For example, compound 20 is an inhibitor of sialyltransferase with an IC50 value of 7.5 μM , meanwhile, it achieved 23% inhibition of MDA-MB-231 growth at the concentration of 20 µM. Furthermore, results demonstrate that the carboxylate group of lithocholic acid derivatives is essential for the inhibition of cancer cell growth and etherification of carboxylate group reduces the ability of cytotoxicity. Currently, study on activation of lithocholic acid-glutathionyl-mixed disulfide by glutaredoxin is still in progress.

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ㄧ、導論

癌症是威脅人類生命的惡性疾病之一，全世界因患癌症死亡人數每年在500 萬以上，從其威脅人類生命健康、造成個人和家庭沉重的精神壓力、乃至社會資源的耗費不貲，都是值得我們重視的問題。目前對於癌症的治療方式仍以注射或服用藥物、外科手術切除和放射線治療為主。雖然最近加入的基因和免疫療法逐漸受到注意，然而其耐藥性、副作用和有效性等問題仍然在評估中。因此，在新的有效治療方法尚未確定前且治病刻不容緩下，發展比目前更具療效的抗癌藥物仍不失為可行的策略。目前化療所使用的許多藥物都是通過干擾細胞生長、代謝與增殖過程，誘導腫瘤細胞凋亡以達到治療目的，這種化療往往因腫瘤對藥物産生耐藥或高副作用毒性而告失敗。因此，需要研究結構新型、療效高、毒副作用小而又耐藥的抗癌新藥。目前臨床上使用的抗癌天然物與其衍生物包括泰索（taxol; paclitaxel）、喜樹鹼（camptothecin）與其衍生物 topotecan and irinotecan (CPT-11)、鬼臼毒素（podophyllotoxin）與其衍生物 etoposide (VP-16) 、以及長春花生物鹼 (vinca alkaloid) 與其衍生物 vinorelbine 等均是。

taxol camptothecin

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多年來，科學家將所有焦點放在蛋白質學上，認為細胞信息傳遞之主宰者為蛋白質，但二十一世紀初，理論數學家將蛋白質分子可能構形的數據及人體功能運轉所須之指令訊號的數據做一試算，結論是蛋白質沒有足夠的數據可以提供所有信息之功能，因為它缺乏一種醣蛋白密碼提供人體正常細胞功能之運轉所需。所以醣質生物學已經為科學家所重視。還有細胞與細胞之間之黏合及溝通對細胞生命是很重要的，正常細胞間之排列是有規則的，是一個接著一個，成一定的序列排列者，當組織破壞後，細胞之修護及生長是有節制的，當傷口已癒合時，細胞就終止其細胞分裂。但癌細胞因缺乏細胞與細胞之連繫、溝通及黏合，其細胞就失序而亂生長，到處轉移及不斷細胞分裂，結果組織功能喪失而使生物體喪命。而這些調控因子端賴細胞膜上接受器之正常功能。免疫細胞及免疫球蛋白上之組成，醣類也是重要成分之一，若缺乏會造成免疫失調，除此之外，醣質營養素在醫學上之重要性，包括傳染病、懷孕、嬰兒及小孩生長、心血管疾病、癌症、慢性病、關節炎、運動傷害、牙疾病、老化及自體免疫性疾病等佔有一席之地。醣類於身體中不僅參與了細胞認知，訊息的傳遞，也和能量供應及組成細胞結構有關，而唾液酸（sialic acids）更是在許多生理機制上扮演重要角色。唾液酸轉移酶負責催化唾液酸和醣受體形成鍵結，而許多研究指出，唾液酸轉移酶的表現量和許多癌症有關，例如：乳癌，子宮頸癌，及腦癌，在病人的腫瘤細胞中，發現唾液酸轉移酶的活性顯著增加1。而唾液酸(sialic acids) 也在許多的生理機制上扮演著重要的角色。

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二、研究背景與文獻論述

1. 唾液酸的結構與功能

唾液酸其實是一群neuraminic acid (2-keto-3-deoxy-nonulosonic acid)

衍生物的通稱2。他們是一種由 9 個碳原子所構成的醣分子，最常出現在細胞表面多醣體及醣蛋白的末端，尤其在哺乳類的末端醣 (terminal sugar) 中最常發現到唾液酸的蹤跡。唾液酸與其他醣分子最大的差異，在於 5 號碳上所帶的胺基 (amino group)及 1 號碳上的羧基 (carboxyl group)，由於羧基帶有負電荷，使唾液酸與其他電中性的醣分子相比，具有不同的化學性質，而被視為是一種有機酸。在過去這些年來，自然界中已有 43 種唾液酸的衍生物被發現。在自然的形態下，未被取代的 neuraminic acid 是不存在的，最常被發現

的衍生物是由 5-acetamido-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid

(N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac, 1) 衍生而來的。N-acetylneuraminic acid (Neu5Gc, 2) 及 3-deoxy-D-glycero- D-galacto-2-nonulosonic acid

(KDN, 3) 的衍生物也曾被發現，只是較不常見。 O CO₂H OH HO R HO OH HO 1 2 3 5 6 9 1 R = HNAc (Neu5Ac) 2 R = NHGc 在自然界中，唾液酸的衍生物通常都是氫氧基 (hydroxy gruop) 被乙醯化 (acetylation) ，通常都是發生在 9 號碳上，也曾發現過有二到三個氫氧基被乙醯化的衍生物。而其他的衍生物包括了在9 號碳上的

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類連結形成醣共軛物 (glycoconjugate) ，而大大地增加其多樣性。最常發現的是由α(2,3)或α(2,6)和其他的六碳醣 (通常是半乳糖) 鍵結，也可由α(2,8)和別的唾液酸鍵結。在動物的世界中，唾液酸是十分常見的，從棘皮動物到人類體內，都可發現到唾液酸蹤跡。而在植物或一些低等動物體內，則沒有唾液酸的存在，唯一的例外，是在果蠅的幼蟲，發現了唾液酸。另外，在一些病毒及細菌中，也有唾液酸的存在，在一些大腸桿菌的菌株中，發現了含有200 個唾液酸多醣體出現在其中。在高等生物體內，唾液酸也是血漿及黏膜的重要成分之一。許多微生物及病毒含有酵素（sailidase），可以催化唾液酸從細胞表面的黏液素中斷裂，而這些會破壞細胞表面對這些病毒的接收器（receptor）活性，使病毒無法被宿主免疫系統辨識而入侵細胞。許多的寄生蟲，由於無法自身合成唾液酸，會藉由酵素將外在的唾液酸轉移到自身上表面，可以藉此避免遭受宿主的免疫系統所攻擊3。但相反的，有一些微生物及病原體卻會利用宿主表面的唾液酸並與之吸附，而使宿主可能感染得病。而在抗體與抗原的辨識上，有些情況也是藉由辨識唾液酸是否存在於抗原上而使其能與抗體結合3，甚至於在穩定醣蛋白（glycoprotein）及多醣體（glycan）的構形上，也佔了很重要的因素，跟黏蛋白相同，有潤滑的作用。在生物體內，唾液酸影響到了幾個重要的生理現象及疾病感染。它出現的位置經常在於細胞表面多醣體的末端，使得唾液酸在醣類-蛋白質辨識功能的互動上，扮演著重要的角色，例如細菌及病毒的受體；細胞-細胞間吸附的調停者；細胞-細胞間溝通的管道。其中最有名的例子就是流行性感冒病毒，免疫系統也藉由細胞表面唾液酸的型態 (sialic acid pattern)，來辨識其是否為外來物，更突顯出唾液酸結構在生理反應上的重要性。

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2. 唾液酸轉移酶在生物上的功能

唾液酸轉移酶是一種酵素，常出現於內質網(endoplasmic reticulum) 及高基氏體(Golgi apparatus)中，是醣轉移酶(glycosyltransferase)的一

種。其最主要的功能，是催化先驅物胞嘧啶核苷酸- 唾液酸

(CMP-sialic acid) ，而將唾液酸連結到醣蛋白 (glycoprotein) 或醣脂質 (glycolipid) 的末端，形成唾液酸共軛物，其反應機構如圖一所示。唾液酸轉移酶廣泛地分布於一些微生物及高等動物體內，在羊、牛及人類的乳汁中也可發現他們的存在。一些從哺乳類組織及細菌單離出來的唾液酸轉移酶，其一、二級結構已經被鑑定出來，而其三級結構也在2004 年的一篇文獻中被剛剛被報導出來。現今發現的唾液酸轉移酶至少有 20 種，分別負責催化唾液酸和不同的醣受體 (acceptor) 形成 α(2→3)、α(2→6)、α(2→8)及 α(2→9)的鍵結，其中已有 18 種唾液酸轉移酶從動物體內被選殖出來。研究中指出，唾液酸轉移酶中包含了一組胺基酸序列，稱之為 ”sialyl motif”，其和醣受體(acceptor)的結合，有很大的關係，例如：α(2→6) 唾液酸轉移酶會辨識β-galactose 的 6-OH 及 glucosamine 的 N-acetyl group，而 α(2→3)唾液酸轉移酶則會辨識β-galactose 的 3-OH、4-OH

及 6-OH。有時，甚至在醣受體後面所接的胺基酸或脂質也會有所影

響。

相對的，唾液酸轉移酶對 donor (CMP-sialic acid)的選擇性就沒有

這麼高了，並不一定要 Neu5Ac 這種唾液酸才能有活性，有一些唾液

酸的衍生物對唾液酸轉移酶一樣是有活性的，因此，唾液酸轉移酶的

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O OH OH O N N NH2 O O HO OH HO CO2 O P O O sialytransferase activation O OH OH O N N NH2 O O P O O HO OH AcHN HO O O δ δ O HOR O HO OH AcHN HO OR CO2 CMP-Neu5Ac α-sialoside AcHN OH OH OH

Eur . J. Org. Chem. 2000, 9, 1745 圖一：唾液酸轉移酶可能的反應機構

唾液酸轉移酶在分類上是屬於 membrane-associated proteins (膜組成蛋白質) ，這類蛋白質可分成 integral membrane proteins 及 peripheral membrane proteins，這類型的蛋白質都因為一段長芳香性及脂肪性的非親水基團與細胞膜連接，所以溶解度不佳，除非於比較疏水性的環境才會使這種蛋白質的溶解度提高。

也因為如此，唾液酸轉移酶的立體結構於之前都不曾被發現，直

到於 2004 年的一篇文獻中才成功的得到其 3-D立體結構，到目前為

止CstⅡ是從Campylobacter jejuni (C jejuni)中被選殖出，而得知其立體結構的唾液酸轉移酶，從不同種C jejuni中選殖出來的

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的 CstⅡΔ32 這一個唾液酸轉移酶更被發現具有雙功能性 (bifunctional) ，可以先催化α(2→3)的受體之後，再以所形成的雙醣作為受體與另外一個donor進行α(2→8)的催化。其四級結構是由 4 條蛋白質長鏈所成的四聚體(tetramer)25，但是由於此唾液酸轉移酶缺乏多個功能上的domains，且和高等動物體內之唾液酸轉移酶二級結構相似度不高，因此利用其X-ray結構來設計抑制劑之可能性大大地降低。圖二是一個CstⅡ將其與膜表面連結的 32 個氨基酸殘基移除之後所產生的唾液酸轉移酶Cst Δ32Ⅱ 。許多研究中指出，唾液酸轉移酶的表現量和許多癌症有關。例如，在直腸癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌和腦瘤4-8的病人腫瘤檢體中，唾液酸轉移酶的活性顯著地增加。另外的研究報告也指出，在人類神經膠細胞瘤細胞株中大量表現唾液酸轉移酶，將使癌細胞的轉移能力增強 9_{。唾液酸轉移酶的活性可被Ca}2+_{或磷酸所控制，也因此在一些腫瘤} 細胞中，唾液酸轉移酶的活性會大大地增加，而其專一性也有所改變，這導致了大量及不同形式的唾液酸化(sialylation)發生在腫瘤細胞上。在設計唾液酸轉移酶的抑制劑時，其目的，也是最令人感興趣的地方，往往是希望能夠調控唾液酸化的現象。藉由抑制唾液酸化的發生，而找出癌症的治療方法。由此可知，唾液酸轉移酶在癌症病理學上佔有重要的地位，而了解唾液酸轉移酶活性和腫瘤細胞成長與轉移之間的關係也成為一項重要的研究。

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Nature Structure & Molecular Biology, 2004, 11, 163-170

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3. 唾液酸轉移酶抑制劑的設計

唾液酸轉移酶抑制劑的設計，大多以donor與acceptor的類似物為基礎骨架，雖然在 2004 年已經由X-ray發現CstⅡ立體結構，在其催化的過程中，鹼基(base)部分與組胺酸（Histidine）而其磷酸根（phosphate）則是與兩個酪胺酸（Tyrosine）有分子作用關係，這可以幫助我們瞭解某幾相似類唾液酸轉移酶的催化機制25。在之前抑制劑的設計，大多是donor與acceptor的類似物，或是模擬過渡狀態的化合物(transition-state mimetics)，也有一些是從天然物中尋找出來的。我們可以藉由得知這些抑制劑和酵素之間結構與活性的關係(structure-activity relationship)，而進一步了解唾液酸轉移酶的結合與催化方式。現今所合成的抑制劑大約分成了三大類：1、以dornor 結構為基礎所設計的抑制劑。2、過渡狀態類似物的抑制劑。3、醣受體(acceptor)類似物的抑制劑10。

3.1 以 donor 結構為基礎所設計的抑制劑

唾液酸轉移酶的抑制劑中最常見的設計方式，就是以 donor 的結構為基礎，改變或去掉一些不需要的官能基，但保留必須的醣苷鍵 (glycosidic linkage)或結構，希望能藉此達到和酵素的結合並抑制其活性。而這些抑制劑都是以唾液酸轉移酶最常見的 CMP-Neu5Ac 這個

donor 為基礎所設計的，這個 donor 包含了唾液酸 Neu5Ac 及核苷酸 CMP 的結構，並適用於所有的唾液酸轉移酶。在以往的研究中發現，CMP(K = 50 μM)及CDP(Ki i = 19 μM)是唾液酸轉移酶的天然抑制劑，而含有cytidine結構的化合物，對α(2→6)唾液酸轉移酶都有抑制效果。因此在抑制劑的設計上，多半保留了 cytidine的結構，而選擇性的修飾唾液酸的結構。在 1993 年，Hatanaka 教授設計出將磷取代為碳的化合物，對唾液酸轉移酶就有抑制效果

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此可推論quinic acid是可以用來取代唾液酸骨架並有相似的生物活性表現。而也有將接在磷上的氧取代為碳、磷的化合物，對唾液酸轉移酶也有抑制效果。其結構及其抑制效果如圖三所示11-14。 O HO HO AcHN HO CO2CH3 OH OCH2CH2 N NH2 O N O OH OH P O O N NH2 O N O OH OH O NH CO2 H R

Hatanaka: Chem. Abstr. 1993, 119, 49839v

inhibitor

Halcomb: Bio. Med. Chem. Lett. 2003, 13, 301

R = H-_{, K} i = 5.3 mM CH3-, Ki = 2.3 mM CH2CH(CH3)2-, Ki = 0.9 mM CH2Ph-, Ki = 2.3 mM CH2CO2-, Ki = 5.1 mM O HO HO AcHN HO CO2 OH O N NH2 O N O OH OH P O O O CMP-Neu5Ac, dornor HO HO CO2 O N NH2 O N O OH OH P O O O OH Ki = 44 μM Schmidt: Glycoconj. J. 1998, 15(4), 345 O HO HO AcHN HO CO2 OH N NH2 O N O OH OH P O O O

Schmidt: Tetrahedron Lett. 1998, 39, 509

Ki = 250 μM Km = 46 μM 圖三：以donor 結構為基礎所設計的抑制劑由以上結果可以知道，以donor結構為基礎所設計的抑制劑，其結構都較於簡單、易於合成或較為穩定。但其效果皆不如天然抑制劑 CDP(K = 19 μM)，在結合親合力上，連天然的donor也比不上(K_i _m= 46 μM)。可見核苷酸及唾液酸結構對酵素結合力具有舉足輕重的意義。將來設計新的抑制劑時，必須要再改變唾液酸的結構，增加其和酵素的結合能力，才能有更好的抑制效果。

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3.2 過渡狀態類似物的抑制劑

在 1996 年，Horenstein教授推測唾液酸轉移酶催化反應可能是類似S_N1 的反應機構(S_N1 like mechanism)15-19。催化時，離去基(CMP) 在親核性取代基(acceptor)進入前便先行離去。其過渡狀態(Neu5Ac┿₎ 推測含有oxocarbenium ion的結構，使得過渡狀態為half-chair構形，且在唾液酸O-6 的位置上帶有部分的正電荷，此正電荷會在O-6 及C-2 上形成共振。反應機構如圖一所示。從動力學的角度來看，在只有一個受質(substrate)的催化反應中，過渡狀態的類似物和酵素的結合能力會比處於基態的受質高 107-1015 倍。因此，由過渡狀態Neu5Ac┿ 的結構所設計的抑制劑，理論上會對酵素有很高的選擇性及抑制效果。Schmidt教授利用這個方式發展出許多抑制劑，他們使用 dehydroacetylneuraminic acid (Neu5Ac2en)這個結構為基礎，來模擬中間產物oxocarbenium ion的立體結構，設計出一連串的α(2→6)唾液酸轉移酶抑制劑。再加上SAR (structure- activity relationship)的研究與構形的分析，使得抑制劑的效果越來越好。而Horenstein教授也利用雙環的結構來模擬過度狀態，設計出另一種形式的過渡態抑制劑，對α(2→6)及α(2→3)的唾液酸轉移酶都有抑制效果。其結構及其抑制效果如圖四所示20-23。綜合以上的結果，具有強大效果的唾液酸轉移酶抑制劑都是極性很高的化合物。由於這樣的結構對細胞膜的滲透能力很低，使得這些抑制劑在細胞或有機體中都很難展現其效力。目前，設計出能在細胞中抑制唾液酸轉移酶的抑制劑仍是一項挑戰。

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O AcHN HO HO HO P O O O OH P O O O N NH₂ O N O OH OH 2 Na P O O O O P O OH O N NH₂ O N O OH OH 2 Na O OH HO OH OH O P O O O O P O O O N NH₂ O N O OH OH 3 Na O OH O R O AcHN AcHN H H

Schmidt: Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37(20), 2893 Schmidt: Chem. Eur. J. 1998, 4(6), 1106

Schmidt: J. Am. Chem. Soc. 2002, 124(8),1632

K_i= 40 nM K_i= 350 nM R = phenyl-, K_i= 29 ~ 690 nM hydroxyethyl-, K_i= 38 ~ 59 nM CO2 O P O O O N NH2 O N O OH OH H

Horenstein: T etrahed ron Lett. 2001, 42, 2451

K_i= 10 μM 圖四：過渡狀態類似物的抑制劑

3.3 醣受體類似物的抑制劑

唾液酸轉移酶同時催化 donor 及 acceptor 兩個分子進行反應，因此利用

醣

受體的結構來設計抑制劑是另一種可行的方法

。

發展此類抑制劑的同時，也可以探討酵素和受體間的辨識過程。最早設計此類抑制劑的是Hashimoto教授。在 1993 年，他們針對 α2,6-唾液酸轉移酶的受體D-Gal-(β1-4)-GlcNAc-β-OCH₃，設計出一系列的抑制劑24。他們將此受體中D-galactose的C-6’位置修飾成 6- deoxy、6-thio、6-O-THP以及利用雙硫鍵鍵結的衍生物，而這些受體都是α(2→6)唾液酸轉移酶的抑制劑。另外，從結果中發現，α(2→6) 唾液酸轉移酶的受體結構上需要Gal上C-6’的OH group和Glc上C-2 的 NAc group，而其他位置的OH group就算被取代也不會影響受體的反應性。其結構及其抑制效果如圖五所示。

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Hashimoto: Carbohydr . Res. 1993, 127, 179 R = H-, Ki= 0.76 mM SH-, Ki= 3.78 mM OTHP-, Ki= 4.14 mM O R HO HO OH O O OH HO NHAc OMe O AcHN OH M eO HO O _O HO OH S OH S O OH HO OH O O OH HO NHAc OMe Ki= 2.00 mM D-Gal-(b1-4)-GlcNAc-b-OCH3, R = OH-, Km = 0.90mM 圖五：醣受體類似物的抑制劑在其抑制結果上，我們可以發現，和以 donor 結構為基礎所設計的抑制劑比較起來，醣受體類似物的抑制劑其抑制效果普遍較差。其

原因可能是α(2→6)唾液酸轉移酶擁有 multivalent binding site，當其

和抑制劑結合之後，仍有足夠的空間容納天然受體，使得其抑制效果變差。若要設計此類型的抑制劑，可能在其結構上需要完全佔滿 α(2→6)唾液酸轉移酶的 multivalent binding site，才會有較好的抑制效

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4. 鬼臼毒素（podophyllotoxin）

D-ring E-ring A-ring O O O OH O O O O 4 4' 3 2 1 1' 2' 3' 6' 5' 8 5 C-ring

鬼臼毒素(podophyllotoxin)發現於八角蓮 (Podophyllum peltatum，俗稱 l 由四個環( ， : Etoposide 以及 Ten Mayapple 或 Mandrake)為鬼臼屬的天然植物中，廣泛分布於美洲、亞洲等地，被作為天然解毒劑、瀉藥、催吐劑、驅蟲劑、或毒藥等藥物使用，而後亦被發展作為殺蟲劑、驅蟲劑、植物生長抑制劑等等許多不同用途。於 1880 年代，Podwyssotzki 等人於 Podophyllum peltatum 之粗萃取物 podophyllin 中分離了其活性物質鬼臼毒素 podophyl otoxin，而鬼臼毒素為鬼臼屬植物之木聚醣 (lignan)中最主要的活性成分，進而開始了人們對於鬼臼毒素的廣泛研究。鬼臼毒素的結構於 1930 年代由 Späth 所解出，其結構主要 A~D 環)所構成，而在 C 環的 C1 位置上具有一個額外的苯環構造 (E 環)，其中 A 環以及 E 環是鬼臼毒素分子其活性所必須存在之結構，而D 環酮環 (lactone ring) 結構之存在可提高鬼臼毒素作用之活性，另外在鬼臼毒素結構中 C 環的 C4 位置可接受大分子基團的修飾，進而產生不同的鬼臼毒素衍生物所以其他許多種類利用半合成方式產生的鬼臼毒素衍生物，多在 C 環之 C4 位置進行分子修飾而改變分子活性，甚至改變鬼臼毒素分子的作用機制。在 90 年代末期鬼臼毒素亦用以作為癌症治療藥物 iposide，為現行兩種主要的鬼臼毒素衍生物，此二半合成藥物為

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1966 年由 Sandoz 所發展。Etoposide 以及 Teniposide 皆以鬼臼毒素分子為半合成之基礎，Etoposide 於鬼臼毒素分子的 C4 位置以一個大分子的醣基取代其原有的羥基，而 Teniposide 與 Etoposide 不同之處在於其醣基分子尾端甲基則以含硫五碳環取代，其他如TOP-53 亦於 C4 位置進行取代，以及水溶性之 etoposide phosphate 則為 E 環 4’位置的磷酸衍生物，其水溶性之優點則期望可以大幅降低因有機合成過程或是用藥所使用之有機溶劑所產生之強烈副作用，而此二種不同的鬼臼毒素衍生物亦被認為是相當具有潛力之癌症用藥。 OH podophyllotoxin

European Journal of Medicinal Chemistry 2003, 38, 899

臼毒素主要之抗癌作用機制，在於影響細胞分裂時所必須的細胞骨

鬼

架 microtubule，使得 microtubule 之結構去穩定化，造成細胞骨

架 microtubule 之聚合作用受到抑制 (tubuline polymerizatioin inhibition)，無法順利聚合 microtubule 以進行細胞分裂，造成細胞生長受到抑制，並使細胞週期停止於細胞分裂期 (Mitosis, M)，造成 M-phase arrest，最後甚至導致細胞凋亡。 O O O H₃CO OCH₃ OCH₃ O 4 4' 3 2 1 1' 2' 3' 6' 5' 8 5

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用，但其對於癌細胞的毒殺作用亦同時對於正常組織細胞有著相同的影響，並且施用鬼臼毒素的病人會伴隨強烈的腸胃道副作用，例如嘔吐、暈眩、白血球下降 (neutropenia) 、骨髓造血功能受到抑制 (myelosupression)等等。故雖然鬼臼毒素對於癌細胞為一具有潛力之抗癌藥物，卻因其副作用強烈，於臨床之應用性備受限制，但也由於鬼臼毒素所具有之高度毒殺能力，引發了許多科學家以鬼臼毒素之結構為基礎，嘗試對其結構進行修飾以改變其生物活性，而產生許多新穎並具有潛力的鬼臼毒素衍生物類抗癌藥物，現在已有數種不同結構以及不同生物活性之鬼臼毒素衍生物用於癌症臨床化療用藥，並對於不同癌細胞皆具有相當之療效。

4.1 鬼臼毒素衍生物於癌症之臨床應用

E FDA 核准上市，直到目 toposide 於 1983 年取得美國食品藥物管理局前仍為重要的癌症用藥，在臨床上對於許多不同癌症皆具有治療效果，如白血病 (leukaemia)、攝護腺癌 (prostate cancer)、乳癌 (breast cancer)、小細胞以及非小細胞肺癌 (small cell and non-small cell lung caner)、生殖細胞腫瘤 (germ cell tumor)、淋巴癌 (lymphoma)、肌瘤 (sarcoma)、以及各種不同具有轉移能力之惡性腫瘤等等。

(20)

5. 人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）簡介

物細胞內許多的蛋白質含有硫醇基（sulfhydryl group），且其易於被含有兩種人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）： Glu ay 結構如圖八所示，靠近酵素反應中心帶生氧化進而改變蛋白質的生物活性（biological activity）26-29。一般在經過氧化壓力條件下，會將該蛋白質以雙硫鍵與穀胱甘肽（glutathione）相接（protein-SSG）30-32，而此一型態的轉換被認為可調控體內氧化還原機制（mechanism）和訊號的傳遞33-35。例如：麩胺

基硫化反應（S-glutathionylation）抑制了核因子I（nuclear factor I）的 DNA結合能力（the DNA binding activity），HIV-1 蛋白酶（HIV-1 protease），以及酪胺酸磷酸酵素 1B（protein tyrosine phosphatase 1B）

的催化能力36-38。

哺乳動物的細胞

39

taredoxin 1（GRx1）和Glutaredoxin 2（GRx2）。Glutaredoxin 1 （GRx1）為專門且有效的對麩胺基硫化蛋白（protein-SSG）進行去

麩胺基硫反應（deglutathionylation）的催化蛋白質40-42，其反應機構

如圖六；此外，Glutaredoxin（GRx1）也催化進行glutathionylated HIV-1

protease的去麩胺基硫反應，使原本無活性的HIV-1 protease轉換成超

活性狀態（superactive form）43；諸多例子指出Glutaredoxin（GRx1）

幫助恢復了麩胺基硫化蛋白質（S-glutathionylated proteins ， protein-SSG）的功能，暗示Glutaredoxin（GRx1）為體內重要的調節因子33, 34, 42。而利用人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）對化合物 31 進行去麩胺基硫反應（deglutathionylation）而形成之化合物 20， 由生物活性發現，抑制α(2→3)唾液酸轉移酶的活性(IC50約為 7.5 μM)，並在乳癌細胞MDA-MB-231 活性測試中，發現有殺死乳癌細胞的能力( 23 %抑制生長效果)。 Glutaredoxin（GRx1）的 X-r 正電之胺基酸（R68、K20、R72、R28）和帶負電之 Cys23 標示

(21)

RS-SG RSH 1 2 GSH GSSG GRx S SH GRx S-SG SH 圖六：Glutaredoxin（GRx1）催化機制1 O H N OH O O S S N N H COOH O H H2N COOH O OH O O H N OH O O OH O 20 hGRx1 S SH hGRx1 SSG SH 31 O O SH 圖七：利用人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）對化合物 31 進行去麩胺基硫反應（deglutathionylation）機構圖

(22)

http://www.people.virginia.edu/~jhb4v/structure.html

(23)

Cytosolic GRx1 的功能除前述之外，尚與細胞凋亡有關（apoptosis） 16, 18_{。Glutaredoxin 2（GRx2）則是近年來才被發現、鑑定出來}44, 45_， Glutaredoxin 2（GRx2）促進維持粒腺體內部細胞凋亡誘發時的氧化還原動態平衡（mitochondrial redox homeostasis ），防止心磷脂

（cardiolipin）氧化和細胞色素c（cytochrome c）的釋出46。

近年研究指出 Glutaredoxin 2 （ GRx2 ）為硫氧還蛋白家族（thioredoxin-fold protein family）第一個被發現用 Fe-S 為中心團簇形成二聚體（dimer）酵素，如圖十，當其處於 dimeric holo-GRx2 狀態

時會失去活性，而經由降解成為monomeric apo-GRx2 狀態時則恢復

其活性，可幫助催化蛋白質進行去 -/ 麩胺基硫化反應

（de-/glutathionylation）、防止心磷脂（cardiolipin）氧化和細胞色素

c（cytochrome c）的釋出…等功能。

Biochemistry 2006, 45, 7998-8008.

(24)

6.榖胱甘肽（Glutathione，簡稱 GSH）簡介：

穀胱甘肽，或稱麩胺基硫，是由麩胺酸- 半胱胺酸 - 甘胺酸（γ-glutamyl-cysteinyl-glycine）結合而成的三胜肽，是生物體內最強大的小分子抗氧化劑之一，其化學作用主要表現在硫醇基位置（-SH），故簡稱 GSH。穀胱甘肽在身體內所扮演的角色：（1）抗氧化劑、自由基掃除劑：穀胱甘肽存在於每個細胞中，是生物體內主要的抗氧化分子，其生理濃度達到10 mM，可保護細胞免受自由基的攻擊。（2）解毒分子：穀胱甘肽也是個重要的解毒分子，它可以幫助生物體把身體內的毒素藉著尿液或膽汁排出體外。（3）輔酶：穀胱甘肽在某些氧化還原反應中也扮演輔酶的角色。 H N N H OH O O SH O H2N CO2H

Glutathione reduced form (GSH) Glu-Cys-Gly

(25)

三、結果與討論

Part 1. 合成鬼臼毒素（podophyllotoxin）衍生物

Part 1.1 設計合成化合物

O O O H H _O O O O N N N S N N H COOH O H H2N COOH O S O O O H H _O O O O N N N SH 3 4 圖十一:化合物 3 和 4 結構 由於鬼臼毒素（podophyllotoxin）毒性太強，對正常細胞與癌細胞沒有選擇性，以至於太多副作用與抗藥性的產生，所以我們實驗室希望能合成出能利用癌細胞中大量表現的人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）所引發的去麩胺基硫（deglutathionylation）反應機制，進而針對癌細胞釋放藥物，如圖十一。此一思路尚未被發表過，其可行性及對藥物釋放的成效，值得期待與證實！穀胱甘肽氧化型（ GSSG ）為人類穀氧還蛋白（ human glutaredoxin）的受質（substrate），在氧化型穀胱甘肽（GSSG）進

(26)

入人類穀氧還蛋白的活化位置（active site），其中的雙硫鍵（disulfide bond）便會被切斷，而後穀胱甘肽（Glutathione）被釋放出來。因此我們嘗試以氧化的穀胱甘肽（Glutathione）為骨架做衍生來設計合成藥物：將已經具有毒殺癌細胞的鬼臼毒素（podophyllotoxin）經由修飾接出含有氧化的穀胱甘肽中間的雙硫鍵，使此一類型化合物保有部分穀胱甘肽（Glutathione）的特性可被人類穀氧還蛋白辨識，進入其活化位置產生鍵結。分析目標產物化合物結構可知要先將鬼臼毒素（podophyllotoxin） 4 號位上之α-form –OH先行轉變為-N₃基團： O O O OH H H _O O O O Podophyllotoxin O O O H H _O O O O N3 O O O H H _O O O O N3 HN3/ CHCl3 BF3 · Et2O 5 6 81% 13% + 流程(1-1): 化合物 5 及 6 的合成路徑

(27)

圖十二：HN₃/ CHCl3 試劑製備圖：冰浴 N₂ 將NaN 加入 45 ℃之d.d H₃ 2O再加入 20 mL CHCl3混合後至於冰浴 10-15 mins直到溫度計顯示 0 ~ 5 ℃ 。隨後conc. H SO₂ ₄由分液漏斗中慢慢滴加，需注意溫度計停留在 0~5 ℃。取出CHCl3有機層並加入 Na SO₂ ₄乾燥，並置於含血清塞的圓底瓶中，以鋁箔紙包著，避免光照。將鬼臼毒素（podophyllotoxin）溶於CH Cl 和HN / CHCl_{2 2} ₃ 3中，在 -15 ℃下慢慢滴加BF OEt3 2，並在-15 ℃下攪拌一小時後，以TLC片上看到起始物的點幾乎消失，再加入pyridine ，以水和CH Cl_{2 2}萃取收有機層，並用Na₂SO₄除水之後迴旋濃縮。利用管柱層析純化後得到化合物5 和 6，產率分別為 81%和 13%。將化合物 5 做肺癌細胞活性 測試，發現效果很好，而且只針對肺炎細胞毒殺而不影響正常細胞。

(28)

將化合物 5 接上帶有-SH 官能基但由於此基團需要三步自行製備 所以先用類似鏈長但尾端是-OH 基團先行測試其活性，如流程(1-2)。 O O O H H O O O O N3 O O O H H O O O O N₃ OH SH CuSO₄ · 5H₂O O O O H H O O O O N N N OH O O O H H O O O O N N N SH 7 sodium ascorbate CuSO4 · 5H2O sodium ascorbate 65% 3 5 5 流程(1-2): 化合物 3 及 7 的合成路徑 將化合物 5 溶於THF / d.d H₂O (1：1)中，並加入 3-butyn-1-ol acid，

再加入CuSO 5H₄ ₂O和sodium ascorbate催化反應三小時，等溶液成黃

色混濁，以TLC片觀察到有產物產生，以水和DCM萃取收集有機層，

並用Na SO₂ ₄除水之後迴旋濃縮。利用管柱層析純化產物 7 產率為

65%。進行活性測試發現當接出-OH鏈出來後，毒殺效用幾乎完全消失，所以嘗試用另一種方式接出含有-SH鏈長，如流程(1-3)。

(29)

O O O H H _O O O O N3 SmI2/ THF t-BuOH O O O H H _O O O O H2N O O O H H _O O O O H2N HS OH O EDC, HOBT,DMF O O O H H _O O O O HN SH O 8 9 5 8 70% 79% 流程(1-3): 化合物 8 及 9 的合成路徑 將化合物 5 溶於t-BuOH和THF中，在室溫氮氣反應條件下緩緩加 入SmI₂，反應 10 分鐘，觀察到溶液顏色由藍色變成黃色，由TLC判定5 反應完全後迴旋濃縮抽乾。加入水和EtOAc (1：6)後過濾，以EtOH 沖洗沉澱物，再用NaHCO 萃取並用MgSO₃ ₄除水後抽乾。以管柱層析法純化得到化合物8 產率 70%。 再將化合物 8 溶於無水DMF中，加入 3-mercaptopropanoic acid， 以EDC和HOBT為偶合試劑，在室溫和氮氣反應條件下反應約 12 個小時，以TLC片觀察到有產物產生後抽乾DMF，以NaHCO₃和DCM萃取，再用Na SO₂ ₄除水。經由管柱層析純化得到 9 產率約 79%。經活 性測試發現毒殺肺癌細胞效果並不好，所以對於鬼臼毒素（podophyllotoxin）C-ring triazole上接出-SH的計畫暫時擱置，而轉換為在C-ring triazole上接出苯環類的衍生物，下面為 10、11、12 和 13 的合成反應式：

(30)

流程(1-4): 化合物 10 及 11 的合成路徑 O O O H H O O O O N3 Cl O O O O O O O N N N O O O O O O O N N N O O O H H O O O O N3 Cl CF3 sodium ascorbate 77% sodium ascorbate 83% CuSO₄ · 5H₂O CuSO4 · 5H2O CF3 5 5 10 11 如流程(1-4)：將化合物 5 溶於THF / d.d H₂O (1：1)中，並加入

3-chloro-1-ethynyl benzene，再加入CuSO₄ 5H₂O和sodium ascorbate 催化反應三小時，等溶液成黃色混濁，以TLC片觀察到有產物產生，以水和DCM萃取收集有機層，並用Na SO₂ ₄除水之後迴旋濃縮。利用管柱層析純化產物10 產率為 77%。而化合物 11、 12、 13 都用同樣 合成步驟，只將所接的炔類替換為不同官能基。產率分別83%、74%、 88%。其中挑選化合物 13 去做活性測試，發現對於肺癌細胞的毒殺 效用很不穩定，所以對於鬼臼毒素（podophyllotoxin）衍生物的開發就到此先暫停，但對於5 生物活性測試都還在陸續進行中。

(31)

O O O O O O O N N N O O O O O O O O N N N O N O O O O O H H O O O O N₃ O O O O H H O O O O N₃ O N O O sodium ascorbate 74% sodium ascorbate 88% 5 12 5 13 CuSO₄ · 5H₂O CuSO₄ · 5H₂O 流程(1-5): 化合物 12 及 13 的合成路徑

(32)

Part 1.2 生物活性

The survival of normal/tumor lung cell after 48hr treatment of ching-pd001

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 5 10 15 20

Drug concentration (uM)

S u rvi val CL1-0 CL1-5 MRC5 IMR90 O O O H H _O O O O N3 5 別名:ching-pd001

The cell cytotoxicity of CL1-0 CL1-5 with pd002 treated 48hr 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 5 10 15 20 Su rv iv a l CL1-0 CL1-5 O O O H H _O O O O N N N OH 7 別名:ching-pd002

(33)

Survival of CL1-0 and CL1-5 after ching-pd003 treated 48hr 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 0.5 1 3 5 10 20

Drug concentration (uM)

Su rv iv a l CL1-0 CL1-5 O O O H H _O O O O HN SH O 9 別名:ching-pd003

Survival of CL1-0 and CL1-5 after ching-pd007 treated 48hr 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.5 1 3 5 10 20 Drug concentration (uM)

S u rvi val CL1-0 CL1-5 O O O O O O O N N N O N O O 13 別名:ching-pd007

(34)

Part 1.3 結論

化合物 5 為針對鬼臼毒素（podophyllotoxin）的結構進行修飾後所 產生的鬼臼毒素衍生物中明顯對於肺癌細胞有很好的毒殺作用，在低濃度處理時，對於正常肺細胞則無明顯之細胞毒性。雖然在接上延伸出-SH 鏈長後，發現毒殺癌細胞之能力大為降低及不穩定，但在未來的目標上，還是希望可以從鬼臼毒素（podophyllotoxin）上 E-ring 中

的其中之ㄧ的methoxy group 轉換為-OH 基團，再接出-SH 尾端的衍

生物，進而反應合成為人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）的受質，希望能合成出能利用癌細胞中大量表現的人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）而引發的去麩胺基硫（deglutathionylation）反應機制，進而針對癌細胞釋放藥物。

(35)

Part 2. 合成可由人類穀氧還蛋白（ human

glutaredoxin）還原之石膽酸(Lithocholic acid)衍生物

Part 2.1 石膽酸（Lithocholic acid）類似物合成

類固醇(steroid)是一類源於動物及植物的多環狀化合物，主要由三

個6 環及一個 5 環所生成，類固醇代表了很多種類化合物，包括固醇

類（sterol），膽酸類（bile acids）以及腎上線皮質激素和性激素等等。而膽固醇（cholesterol）則是脊椎動物於身體內所存在的固醇類中最主要的成分，也是具多種生物功能的膽酸和類固醇激素之前驅物，因其A-ring 上C-3 所帶的hydroxyl group，本身為一個amphipatic的分子，真核生物(Eukaryote)體內的固醇類是由乙醯輔酶A經過異戊二烯（isoprene）單元合成而得，但是細菌本身無法自行合成固醇類化合物，也因此少了很多像人體以固醇類作為消化代謝、訊號傳遞、調控因子或抑制效果等等的一些生理機能1,2,3。 HO OH O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 H R2 R1 Cholicic Acid Chenodeoxycholic Acid Lithocholic Acid Deoxycholic Acid R1 R2 OH OH OH OH H H H H 圖十三：膽酸及其衍生物

(36)

石膽酸（Lithocholic acid）是屬於膽酸(Bile acid) 中的一類結構，在生理上也是有著相當重要的功能，例如石膽酸（Lithocholic acid）可以抑制哺乳類體中的DNA聚合酶(Pol beta)以及DNA topoisomerase

II (topo II)的活性7。近幾年，有研究指出，石膽酸（Lithocholic acid）

在人體中是扮演著tumor promoter 的角色8，即是本身不是致癌物，但當反覆的投給曾暴露於起始致癌物的細胞時，就會引發腫瘤。更甚者，在 2005 年的一篇Review中指出有許多間接的證據說明膽酸的一系列衍生物可能是致癌物9，即膽酸會造成DNA的受損，使tumor suppression genes受損，在人體中於是造成突變的機會大增。雖然現在還有許多的生理機制地方需要再研究，但可以確定在生理上卻是是與人體關係重大。實驗室在生物活性測試掃描的情況下，發現人體內含量豐富的膽酸的衍生物，而石膽酸（Lithocholic acid ）本身對於 α(2→3)sialyltransferase 就已經有著相當不錯的生物活性，大約在 25 μM，於是我們相信在石膽酸結構中的某些位置的基團一定會與 α(2→3)唾液酸轉移酶之活性位置有相互作用的效果存在，因此設計改變石膽酸的基團並加以探討若由人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）還原後之抑制效果的增減，來更進一步瞭解 α(2→3)唾液酸轉移酶與substrate 作用的機制。ㄧ開始先由實驗室先前所發表具有良好抑制 α(2→3)唾液酸轉移酶的化合物 Li-O-Asp 著手進行修飾，希望能接出具有還原型態的 -SH，而後再與還原態之穀胱甘肽(Glutathione) 反應，形成可由人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）還原之石膽酸（Lithocholic acid）衍生物，期望達到更好的藥物釋放並減低副作用之產生。

首先，先將石膽酸（Lithocholic acid）上之羧基（-COOH）以allyl group保護起來，將石膽酸（Lithocholic acid）以DMF為溶劑，加入

(37)

HO Lithocholic acid Cs2CO3, DMF allyl bromide OH O 14 95% HO O O 流程(2-1): 化合物 14 成路徑 Asp的胺基酸及γ-羧基端保護的合成：根據文獻的方法54,55,56，以 H-Asp-OH為起始物，加入無水allyl alcohol至溶解，於冰浴下緩緩滴入chlorotrimethylsilane反應 18 小時。待反應結束，以少許MeOH使其溶解，加入大量乙醚靜置待產生沈澱析出後抽氣過濾，乾燥後取得化合物15 產率 94%，由於是已知化合物，便繼續將化合物 15 二次去離 子水溶解，加入triethylamine，再將Boc2O以dioxane溶解後緩緩滴入，於室溫下反應隔夜。待反應結束，萃取收集水層以6% HCl酸化至pH = 2，接著以EtOAc萃取，收集有機層，經由快速管柱層析分離的方式純化後可得到化合物16 產率 89%。如流程(2-2)。 O OH O H₂N OH O O O H2N OH O O O HN OH Boc OH _Boc 2O Et3N 15 TMS-Cl 16 H-Asp-OH 94% 89% 流程(2-2): 化合物 15 及 16 的合成路徑

(38)

O H N Boc O O O O O DMAP , DCC , CH2Cl2 OH O O O H N Boc HO O O 17 14 16 90% 流程(2-3): 化合物 17 的合成路徑 將化合物 14 溶於 DCM，加入化合物 16 在 DMAP 催化下，以 DCC 為偶合試劑反應約一小時，以 TLC 片觀察起始物消失，結束反應。將白色沉澱物過濾後，濾液以迴旋濃縮機抽乾。以管柱層析純化後得到化合物17，產率約為 90%，如流程(2-3)。 O H N Boc O O O O O H2N O O O O TFA 95% 17 18 O O 流程(2-4): 化合物 18 的合成路徑 如流程(2-4)，將所得到化合物 17 以 TFA 去 Boc 保護基，利用快 速管柱層析純化後，得到化合物18，產率約為 95%。 O H N O O O O SH 3-mercapto-propionic acid O O DMF , EDC, HOBt 65% O H2N O O O O O

(39)

如流程(2-5)，將化合物 18 溶於DMF中，加入 3-mercapto-propionic acid，以EDC, HOBT為偶合試劑，反應約 12 小時，以TLC片觀察到有產物產生後抽乾DMF，以NaHCO 和DCM萃取，再用Na3 2SO4除水後抽乾。經由管柱層析純化得到化合物19，產率約 65%。 O H N O O O O SH O O O H N OH O O O SH OH O Pd(PPh3)4 Morpholine , THF 19 20 流程(2-6): 化合物 20 的合成路徑 如流程(2-6)，將化合物 19 之 allyl 官能基去保護，經嘗試文獻各 種不同的去保護方法，最後選擇其中反應性較好的條件用以合成化合物 20：取化合物 19、tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0)以無水 THF 溶解後，加入 morpholine，於室溫下反應 3 小時後終止反應。以快速管柱層析分離的方式純化後，去測 crude NMR，卻發現只得到去一個 allyl 官能基的產物，所以又再拉長反應時間和 tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0)的催化量，但始終得不到完全去 allyl 官能基的產物，但與實驗室其他同學比較後發現也許是因為 -SH 官能基的影響，導致兩個 allyl 官能基無法完全去除，所以想要先行保護-SH 官能基。參考許多文獻中發現，-SH 官能基以 triphenyl 保護基的產率最高也最為方便，不用使用管柱純化，用沉澱過濾即可得到很純的產物。

(40)

HS OH O S OH O Ph3C BF3 · Et2O 21 Ph3COH 流程(2-7): 化合物 21 的合成路徑

如流程(2-7)，將 3-mercaptopropionic acid以acetic acid為溶劑，加

入triphenylmethanol和BF Et3 2O，反應約 30 分鐘產生大量白色沉澱物，加入冰水攪拌10 分鐘後抽濾，收集固體以冰水和乙醚反覆沖洗，抽真空乾燥之。可得到化合物21 產率約為 95%。 EDC, HOBT, DMF 18 22 75% Ph3CSCH2CH2COOH O H2N O O O O O O H N O O O O O O SCPh3 流程(2-8): 化合物 22 的合成路徑 將去Boc保護化合物 18 溶於DMF中，加入上述以triphenyl保護的 3-mercaptopropionic acid（Ph3CSCH2CH2COOH），以EDC、 HOBT

為偶合試劑，反應約 12 小時，以TLC片觀察到有產物產生後抽乾

DMF，以NaHCO 和DCM萃取，再用Na3 2SO4除水後抽乾。經由管柱層

(41)

O H N O O O O O O SCPh3 O H N OH O O OH O O SCPh3 Pd(PPh3)4 Morpholine , THF 22 23 流程(2-9): 化合物 23 的合成路徑 再將化合物 22 用 tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0)以無水 THF 溶解後，加入 morpholine，於室溫下反應 3 小時後終止反應。以快速管柱層析分離的方式純化後，去測 crude NMR，卻也只得到去一個 allyl 官能基的產物，如流程(2-8)。雖然如此但還是嘗試再拉長反 應時間和tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0)的催化量，可是始終得不到完全去 allyl 官能基的產物。由此可知用 allyl 官能基要選擇性去保護的方式，並不適用於含有S 原子的反應物，在文獻中也似乎很少看見以 allyl 官能基要選擇性去保護的反應式，所以就尋求另一種 以 tert-Butyl 選擇性保護和去保護的官能基，從頭開始合成。 HO OH O

Lithocholic acid AcO

O OH acetic anhydride pyridine 24 90% 流程(2-10): 化合物 24 的合成路徑 如流程(2-10)，先將石膽酸（Lithocholic acid）上之-OH以Acetyl group 保護起來，先加入pyridine後反應約十分鐘，再加入acetic anhydride，攪拌約六個小時以TLC片觀察起始物的點完全消失後抽乾，以HCl和DCM萃取後取有機層，再用NaHCO3和DCM萃取，取有機層後再用Na SO2 4除水後抽乾。經由管柱層析純化得到化合物(20)， 產率為90%。

(42)

t-BuOH, (Boc)₂O DMAP 85% AcO O OH 24 AcO O OtBu 25 流程(2-11): 化合物 25 的合成路徑 將化合物 24 上的-COOH以tert-Butyl保護起來，以tert-BuOH為溶 劑依序加入(Boc)2O和DMAP，反應約一小時後以迴旋濃縮機抽乾。經由管柱層析純化得到化合物25 產率為 85%。如流程(2-11)。 NaOCH3 MeOH 92% AcO O OtBu 25 HO O OtBu 26 流程(2-12): 化合物 26 的合成路徑 得到化合物 26 後將之融於MeOH中，加入NaOCH3除去acetyl group，反應約六小時以迴旋濃縮機抽乾。經由管柱層析純化得到化合物26，產率為 92%。如流程(2-12)。 OH H N Fmoc Ot_Bu O O DMAP, DCC, DCM 87% HO O Ot_Bu 26 O OtBu 27 O H N Fmoc Ot_Bu O O 流程(2-13): 化合物 27 的合成路徑

化合物 26 溶於DCM中加入Fmoc-Asp-(Ot_{Bu)-OH ，在DMAP催化}

(43)

DBU, DCM 93% O OtBu 27 O H N Fmoc Ot_Bu O O O Ot_Bu 28 O H2N Ot_Bu O O 流程(2-14): 化合物 28 的合成路徑 將化合物 27 溶於DCM中，加入DBU去除Fmoc-保護基形成-NH2，經由快速管柱層析純化後得到化合物28，產率約 93%。如流程(2-14)。 HSCH₂CH₂COOH EDC, HOBT, DMF 75% O OtBu 28 O H2N Ot_Bu O O O Ot_Bu 29 O H N Ot_Bu O O O SH 流程(2-15): 化合物 29 的合成路徑 將化合物 28 溶於DMF中，3-mercaptopropionic acid，以EDC和 HOBT為偶合試劑，反應約 12 小時，以TLC片觀察到有產物產生後抽乾DMF，以NaHCO3和DCM萃取，再用Na2SO4除水後抽乾。經由管柱層析純化得到化合物29 產率為 75%。如流程(2-15)。

(44)

TFA 2% H2O 60% O OtBu 29 O H N OtBu O O O SH O OH 20 O H N OH O O O SH Et3Si 流程(2-16): 化合物 20 的合成路徑 去tert-Butyl保護基時通常是將化合物 29 溶於TFA中，加入 2% d.d H2O，這對於一般沒有-SH官能基時，此反應的產率可以很高，但對 於同時去掉兩個tert-Butyl保護基化合物 29 卻只有大約 10%的產率， 不論增加TFA的當量或是拉長反應時間，都無法達到很高的產率，直至參考文獻中除了加入TFA外，還要另外加入Et3Si才大大地增加產率，並縮短反應時間。如流程(2-16)。 將化合物 29 溶於TFA中加入 2% d.d H2O ，此時溶液為淡黃色，之後再加入約五當量的Et3Si，可觀察溶液顏色變為透明無色，以TLC 片觀察起始物的點消失後即用迴旋濃縮機抽乾TFA，以NaHCO3中和至pH約為 7 後，通Reverse phase HPLC，以冷凍乾燥機將溶劑抽乾後可得白色粉狀化合物20，產率約為 60%。 比較化合物Li-O-Asp對α(2→3)唾液酸轉移酶之IC50約為 12 μM，而我合成出化合物 20 發現多了-SH基團在其尾端不僅可以增加抑制 α(2→3) 唾液酸轉移酶的活性 IC50約為 7.5 μM ，在乳癌細胞（MDA-MB-231 cell ）活性測試中也可增加其殺死乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）的能力(約 23% 抑制效果)，所以除了將之與麩胺基硫（Glutathione）的接上外，還要進而改變石膽酸（Lithocholic

acid）所接出胺基酸 (Glu、D-Asp) ，甚至可以試將石膽酸（Lithocholic

acid）上之羧基（-COOH）換為酯基（-COOCH3），增加藥物穿越

(45)

接下來要先合成具有麩胺基硫（Glutathione）的骨架才能進而與化合物19 反應而得到我們想要的目標產物。 N S S N H2N H N COOH N H COOH O SH O H2N H N COOH N H COOH O S O S N MeOH / d.d H2O 30 Glutathione 70% 流程(2-17): 化合物 30 的合成路徑 將麩胺基硫（Glutathione）溶於d.d H2O中，慢慢以滴管加入 2,2’-dithiodipyridine / MeOH，此時可觀察溶液顏色由透明轉換成鮮黃色，反應進行的很快，在無氧狀態室溫下約放置一小時，用迴旋濃縮機抽乾後，以Reverse phase HPLC純化，然後用冷凍乾燥機將溶劑抽乾後，即可得到白色固狀化合物 30，產率約為 70%。如流程(2-17)。 S N _N H COOH O H H2N COOH O S _N MeOH / d.d H2O 80% O OH 20 O H N OH O O O SH O OH 31 O H N OH O O O S N _N H COOH O H H2N COOH O S 30 流程(2-18): 化合物 31 的合成路徑 最後一步再將化合物 19 溶於MeOH / d.d H2O中，加入化合物 30 反應約一小時後結束反應，將溶劑以迴旋濃縮機抽乾後，以pH確定為中性時，再用Reverse phase HPLC純化分離出化合物 31，產率約為 80%。如流程(2-18)。

接下來試將石膽酸（Lithocholic acid）上的羧基（-COOH）換為

(46)

HO O O HO OH O TMS-Cl MeOH 85% Lithocholic acid 32 流程(2-19): 化合物 32 的合成路徑

將石膽酸（Lithocholic acid）溶於 MeOH 中，在 0 ℃下加入

TMS-Cl，反應約六個小時，用 TLC 片觀察無起始物殘留，用迴旋濃縮機抽乾。以管柱層析純化後可得化合物 32，產率約 85％。如流程 (2-19)。 HO O O 32 O H N Fmoc O O O DMAP, DCC, DCM Ot_Bu O Fmoc-Glu(Ot_Bu)OH 38 DMAP, DCC, DCM O H N Fmoc OtBu O O O O 33 90% 92% Fmoc-Asp(Ot_Bu)OH 流程(2-20): 化合物 33 及 38 的合成路徑 再將化合物 32 溶於DCM中，個別加入Fmoc-Asp(Ot_Bu)-OH、 Fmoc-Glu(Ot_{Bu)-OH，以DMAP和DCC/DCM為反應試劑，攪拌約一個} 小時用TLC片觀察無起始物殘留，用濾紙過濾掉白色沉澱物後，濾液以迴旋濃縮機抽乾。以管柱層析純化後可得化合物33 產率約 90％。 化合物38 產率約為 92%。如流程(2-20)。

(47)

O H N Fmoc O O O OtBu O 38 O H N Fmoc OtBu O O O O 33 DBU, DCM O H2N O O O OtBu O 39 O H2N Ot_Bu O O O O 34 93% 90% 流程(2-21): 化合物 34 及 39 的合成路徑 分別將化合物 33、38 溶於DCM中，加入DBU去除Fmoc-保護基形 成-NH2，經由快速管柱層析純化後分別得到化合物 34、39。化合物 34 產率約 93%。化合物 39 產率約 90%。如流程(2-21)。 O H₂N O O O OtBu O 39 O H2N Ot_Bu O O O O HSCH2CH2COOH EDC, HOBT, DMF O H N O O O Ot_Bu O O 34 75% 78% O O O H N OtBu O O O SH SH 35 40 流程(2-22): 化合物 35 及 40 的合成路徑

(48)

分別將化合物 34、39 溶於DMF中，3-mercaptopropionic acid，以 EDC和 HOBT為偶合試劑，反應約 12 小時，以TLC片觀察到有產物產生後抽乾DMF，以NaHCO 和DCM萃取，再用Na SO3 2 4除水後抽乾。經由管柱層析純化得到化合物 35 產率為 75%。化合物 40 產率為 78%。如流程(2-22)。 TFA 2% d.d H2O 60% 69% Et3Si O H N O O O OtBu O O O O O H N OtBu O O O SH SH 35 40 O H N O O O OH O O O O O H N OH O O O SH SH 36 41 流程(2-23): 化合物 36 及 41 的合成路 分別將化合物 35、40 溶於TFA中加入 2% d.d H2O ，此時溶液為淡黃色，之後再加入約五當量的Et3Si，可觀察溶液顏色變為透明無色，以TLC片觀察起始物的點消失後即用迴旋濃縮機抽乾TFA，以

NaHCO3中和至pH約為 7 後，通過Reverse phase HPLC，以冷凍乾燥

機將溶劑抽乾後可得白色粉狀化合物 36 產率約為 60%。化合物 41

(49)

MeOH/d.d H2O 80% 85% O H N O O O OH O O O O O H N OH O O O SH SH 36 41 30 O H N O O O OH O O O O H N OH O O O O 37 42 S N _N H COOH O H H2N COOH O S S N _N H COOH O H H2N COOH O S 流程(2-24): 化合物 37 及 42 的合成路徑 最後一步再將化合物 36、41 分別溶於MeOH / d.d H2O中，加入化合物 30 反應約一小時後結束反應，將溶劑以迴旋濃縮機抽乾後，以 pH確定為中性時，再用Reverse phase HPLC純化分離出化合物 37 產 率約為80%。化合物 42 產率約為 85%。如流程(2-24)。 在分別得到化合物36、41 後，測試抑制乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）

的生物活性，卻發現當石膽酸（Lithocholic acid）上的羧基 (-COOH)

換為酯基（-COOCH3）保護時，對於毒殺乳癌細胞（MDA-MB-231

cell）的能力有降低的趨勢：化合物 36 只有 3 % 抑制效果；化合物 41 有 17 % 抑制效果。所以由此可驗證石膽酸（Lithocholic acid）上 的羧基（-COOH）對於毒殺乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）的能力有影響。並由實驗結果數據中可以比較出石膽酸（Lithocholic acid）接上Glutamate amino acid (Glu)的抑制效果比接上Asparate amino acid (Asp)胺基酸還要好，所以想要再合成石膽酸（Lithocholic acid）

接上Glutamate amino acid (Glu) ，而且兩端都為未保護的羧基

（-COOH），以期望會比化合物 19 對於抑制乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）有更好的效果。

(50)

以 tert-Butyl 的保護基進行保護，做了化合物 46，並做抑制乳癌細胞 （MDA-MB-231 cell）生物活性，有 19 % 抑制效果。如流程(2-25)。 O H N Fmoc O Ot_Bu O DBU, DCM MeOH/d.d H2O HSCH₂CH₂COOH _TFA 2% d.d H₂O Ot_Bu O O H₂N O O Ot_Bu O O H N O O Ot_Bu O S N N H COOH O H H2N COOH O O H N O OH O OH O S Ot_Bu _Ot_Bu Et₃Si 43 44 45 46 47 DMAP, DCC, DCM Fmoc-Glu(OtBu)OH 25 78% 82% 57% EDC, HOBT, DMF 50% 79% 30 O O SH O H N O O OH O OH O SH 流程(2-25): 化合物 46 及 47 的合成路徑 和先前所合出化合物 19 合成步驟一樣，只是將石膽酸（Lithocholic

acid）所接的Asparate amino acid (Asp) 換成Glutamate amino acid

(Glu)，同樣在去兩個tert-butyl保護時要加入Et3Si，以增加化合物 46

產率。如流程(2-25)。

將所得到的化合物 46 經 Reverse phase HPLC 純化後，做抑制乳癌

細胞（MDA-MB-231 cell）生物活性測試，卻發現抑制效果也大約只

(51)

2.2 結論與未來展望

總括以上生物實驗數據結果可以了解，在石膽酸（Lithocholic acid）上尾端的羧基（-COOH）對於乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）抑制效果有很大的影響，而將石膽酸（Lithocholic acid）另一尾端多了-SH 官能基可以提升石膽酸（Lithocholic acid）衍生物對於乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）生長抑制效果。所以未來希望能在進一步合成

石膽酸（Lithocholic acid）兩端都為羧基（-COOH）的D-Asp amino acid

化合物，以期望對於乳癌細胞（MDA-MB-231 cell）生長抑制有更好的效果。而我也進一步合成出可利用人類穀氧還蛋白（human glutaredoxin）還原機制釋放抗癌藥物於細胞當中的化合物31、37、42 及 47，其可 行性及對藥物釋放的成效，尚待生物實驗測試，在未來會陸續完成，以期望達到更好的藥物釋放並減低副作用之產生。。

(52)

2.3 生物活性測試表

α2,3(N)-sialyltransferase 生物活性測試由本實驗張凱宣學長代測 MDA-MB-231 cell 生物活性測試由本實驗室任雅罄學姐代測 Inhibition of MDA-MB-231 cell at 20μM Inhibition of α2,3(N)-sialy ltransferase 名名稱稱結結構構 1 19 9 ~25% IC O H N OH O O O SH OH O ₅₀~7.5 μM 3 36 6 _O ~3% - O O H N OH O O O SH 4 41 1 ~17% - O H N O O O OH O O SH 4 46 6 ~20% O H N O O OH O

(53)

四、實驗與光譜數據

1、實驗儀器

A、核磁共振光譜儀

（ Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer）； Bruker AMX-400、AVANCE-400、AVANCE-500 將樣品溶於Deuterium-solvent (D-solvent)中，利用所測得的1H、 13_{C光譜判斷化合物之結構與純度；另外使用HMQC、HMBC和} COSY等二維光譜來輔證結構的判定。化學位移單位為ppm（δ），偶合常數單位為Hz，並以D-solvent為內標。1H光譜在 400 MHz或是500 MHz下測得，其D-solvent內標為：CDCl3，δ 7.24；CD3OD， δ 3.31；D2O，δ 4.80。 C光譜在 100 MHz或是 125 MHz下測得其13

D-solvent內標為：CDCl3，δ 77.00；CD3OD，δ 49.15。s代表singlet， d代表doublet，t代表triplet，q代表quartet，m代表multiplet，dd代表 doublet of doublet。

B、低解析及高解析質譜

（Low Resolution Mass Spectroscopy ＆ High Resolution Mass Spectroscopy）

樣品送測於中央研究院化學研究所質譜儀中心。樣品通常選擇 FAB（Fast Atom Bombardment），快速原子撞擊的離子化方法； LR-MASS 及 HR-MASS 之儀器是 JMS-700 double focusing mass spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan)，加速的電壓是 10 kV 使用氙（Xe）槍為撞擊源，基質是用 NBA（3-nitrobenzyl alcohol）； LR-MASS 及 HR-MASS 之解析度分別是 3000 （ 5% valley definition）及 8000（5% valley definition）。

(54)

C 、高效能液相層析儀

（ high performance liquid chromatorgraphy）；

Waters 2487 ( dual λ absorbance detector )、 Waters 1525 ( binary HPLC pump )、

Vydac 214SP510 C18 ( 5μm，10 × 250 mm )、 Waters Symmetry® C18 ( 5μm，3.9 × 150 mm )

利用各種不同特性的管柱 ( column )，依產物的極性大小去分

離純化。主要是偵測紫外光220 nm 波長吸收。

D、薄片層析（

Thin Layer Chromatography, TLC）

薄片層析是使用Merck（1.0554.0001） aluminium sheet Si 60 F254 TLC片。以紫外光及沾染顯色劑ninhydrin後加熱觀察TLC片上的變化。甲、ninhydrin 顯色劑的配置方法將 0.3 克的 ninhydrin 溶於 100 毫升 n-butanol 中，再加入 3 毫 升acetic acid，混合均勻即可。針對胺基酸和蛋白質之 α-胺基及羧基進行反應並藉由加熱在TLC 片上呈現顏色的變化加以鑑別。

E、冷凍乾燥機（Speed vac）；

Savant SC110（speeded vacuum）、

Savant RVT400（refrigerated vapor trap）利用低溫低壓將冰昇華，達到除水之目的。

(55)

2.實驗藥品

藥品分子式 CAS# C Acetic acid 2H O4 2 64-19-7 Allyl alcohol C3H O 107-18-6 6 Allyl bromide C3H Br 106-95-6 5 C Acetic anhydride 4H O6 3 108-24-7 Acetonitrile C2H N 75-05-8 3 Allyl alcohol C3H O 107-18-6 6 3-Butyn-1-ol C4H O 927-74-2 6 tert-Butanol C4H O 75-65-0 10 3-Chloro-1-ethynyl benzene C8H Cl 5 766-83-6 Chloroform CHCl3 67-66-3 Chlorotrimethyl silane；TMS-Cl C3H ClSi 75-77-4 9

chlorotrimethyl silane C3H ClSi 75-77-4 9

Cesium carbonate CCs O2 3 534-17-8 1,8-Diazobicyclo [5.4.0]undec-7-ene；DBU C9H N16 2 6674-22-2 1-(3-Dimethylaminopropy l)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride；EDC C18H N17 3‧HCl 25952-53-8 C Dimedone 8H O12 2 126-81-8 Dichloromethane CH Cl2 2 75-09-2 Diethyl 1,3-acetone dicarboxylate C9H O14 5 105-50-0

(56)

Dimethylformamide； DMF C3H NO 68-12-2 7 1,4-Dioxane C4H O8 2 123-91-1 Di-tert-butyl C10H O18 5 24424-99-5 1,2-Di(pyridin-2-yl)disulf ane C10H N8 2S2 2127-03-9 N,N-Diisopropylethyl amine；DiPEA C8H N 7087-68-5 19 4-Dimethylamino pyridine；DMAP C7H N10 2 1122-58-3 1-Ethynyl-4-phenoxy-ben zene C6H OC H5 6 4C≡C H 4200-06-0 1-Ethynyl-2-trifluorometh ylbenzene HC≡CC6H4CF3 _704-41-6 Ether C4H O 60-29-7 10 Ethyl acetate；EtOAc C4H O8 2 141-78-6 9-Fluorenylmethyl chloroformate；Fmoc-Cl C15H ClO11 2 28920-43-6 C Fmoc-Glu(OBut)-OH 24H NO27 6 71989-18-9 Fmoc-Asp(OBut)-OH C23H NO25 6 71989-14-5 1-Hydroxybenzo triazole；HOBt C6H N5 3O 2592-95-2 Hydrochloric acid ClH 7647-01-0 H-Asp-OH C4H NO7 4 56-84-8 Hexane C6H14 110-54-3 3-Mercaptopropanoic acid C3H O6 2S 107-96-0 Methyl alcohol；MeOH CH O 67-56-1 4

(57)

2-(Prop-2-ynyloxy)isoind

oline-1,3-dione C11H NO7 3 4616-63-1

Pyridine C5H N 110-86-1 5

Sodium azide N3Na 26628-22-8

Sulfuric acid H2SO4 7664-93-9

Sodium hydroxide HNaO 1310-73-2

Sodium methoxide CH NaO 124-41-4 3

I2Sm Samarium(II) iodide 32248-43-4 Tetrahydrofuran；THF C4H O 109-99-9 8 Tetrakis(triphenylphosphin e)palladium(0) C72H60P4Pd 14221-01-3 Tributyltin hydride C12H28Sn 688-73-3 C Triethylsilane 6H16Si 617-86-7 Triethylamine；Et3N C6H N 121-44-8 15 Trifluoroacetic acid；TFA C2HF3O2 76-05-1 Triphenylmethanol C19H O 16 76-84-6 Triphenylphosphine；PPh3 C18H15P 603-35-0

(58)

3.實驗步驟及光譜數據

1. 化合物 5 和 6 的合成

: O O O H H _O O O O N3 O O O H H _O O O O N3 5 6 將podophyllotoxin (500.0 mg, 1.2 mmol)溶於CH₂Cl 和HN / CHCl₂ ₃ 3 中，在-15 ℃下慢慢滴加BF OEt (0.2 mL)在-15 ℃₃ 2 下攪拌一小時後，以TLC片上看到起始物消失，再加入pyridine(0.2 mL) ，以水和 CH Cl 萃取，Na SO_{2 2} ₂ ₄除水後迴旋濃縮。利用管柱層析純化，EtOAc / Hexane = 3 / 7 到 6 / 4 作為沖提液，得到化合物 5 和 6，產率分別為 81 %和 13 %。TLC (EtOAc / Hexane = 1/1) : 化合物 5 Rf = 0.45。化合物6 R = 0.53。 f 化合物5 1_{H NMR（CDCl} 3, 400 MHz）： δ6.78 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 6.33 (s, 2H), 6.00(d, J = 6.5 Hz, 2H), 4.75 (d, J =3.4 Hz, 1H), 4.61 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.30-4.26 (m, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.72 (s, 6H), 3.18 (dd, J = 4.9 Hz, J = 13.7 Hz, 1H), 2.95-2.87 (m, 1H) 13_{C NMR（CDCl} 3, 100 MHz）： δ173.7, 152.3, 148.6, 147.0, 137.0, 134.8, 131.8, 126.6, 110.7, 108.4, 107.9, 101.5, 77.2, 67.2, 60.3, 59.2, 55.9, 43.4, 40.8, 36.5 +

HRMS（FAB） calculated for C22H21N3O7 (M) , 439.1387; found, 439.1380

(59)

化合物6 1_{H NMR（CDCl} 3, 100 MHz）： δ7.04 (s, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.35 (s, 2H), 6.02(d, J = 10 Hz , 2H), 4.65-4.61 (m, 2H), 4.32 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.08 (t, J = 9.9 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.73 (s, 6H), 2.96-2.91 (m,, 1H), 2.86 (dd, J = 4.9 Hz, J = 13.8 Hz, 1H) 13_{C NMR（CDCl} 3, 100 MHz）： δ174.5, 153.7, 148.3, 146.9, 137.4, 134.6, 131.5, 126.3, 110.4, 108.5, 107.5, 101.6, 77.2, 67.3, 60.5, 59.1, 55.4, 43.4, 40.5, 36.8 +

HRMS（FAB） calculated for C22H21N3O7 (M) , 439.1383; found, 439.1382

2. 化合物 7 的合成:

O O O H H O O O O N N N OH 7 將化合物 5 (30 mg, 0.068 mmol)溶於THF / d.d H2O (1：1)中，並加

入3-butyn-1-ol acid，再加入 5.0 mg CuSO 5H4 2O和 10.0 mg sodium ascorbate催化反應三小時，等溶液成黃色混濁，以TLC片觀察到有產

物產生，以水和DCM萃取三次，收集有機層，並用Na2SO4除水之後

迴旋濃縮。利用管柱層析純化產物，EtOAc / Hexane = 8 / 2 到EA沖提

液，得到化合物7，產率為 65 %。TLC (EtOAc / Hexane = 6 / 4) : 化

(60)

1_{H NMR（CDCl} 3, 400 MHz）： δ7.44 (s, 1H), 6.83 (d, J = 9.1 Hz, 2H), 6.5 (s, 2H), 6.26(s, 1H), 6.21 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 4.94 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 4.58 (s, 1H), 4.13 (s, 2H), 4.00 (s, 3H), 3.95 (s,, 6H), 3.47-3.43 (m, 2H), 3.26-3.21 (m, 1H), 3.11-3.04 (m, 2H) +

HRMS（FAB） calculated for C26H28N3O8 (M + H) , 510.1878; found, 510.1876

3. 化合物 9 的合成:

O O O H H _O O O O HN SH O 9 將化合物 5 (87.8 mg, 0.20 mmol)溶於t-BuOH和THF中，在室溫氮 氣反應條件下緩緩加入SmI (0.1 M, 4 mL)₂ ，反應 10 分鐘，觀察到溶液顏色由藍色變成黃色，由TLC判定化合物 5 反應完後迴旋濃縮抽乾。加入水和EtOAc(1：6) 後過濾，以EtOH沖洗沉澱物，再用NaHCO₃ 萃取並用MgSO₄除水後抽乾。以快速管柱層析法純化，EtOAc /

Hexane = 5 / 5 到EA為沖提液，得到化合物 8，產率 70 %。TLC (EtOAc / Hexane = 5 / 5) : 化合物 8 Rf = 0.1。再將化合物 8 (50 mg, 0.12 mmol) 溶於無水DMF中，加入 3-mercaptopropanoic acid (10.53 μL, 0.12 mmol)，以EDC (18.78 mg, 0.12 mmol)和HOBT (16.34 mg, 0.12 mmol)

為偶合試劑，在室溫和氮氣反應條件下反應約 12 個小時，以TLC片

(61)

得到化合物9 產率約 79 %。TLC (EtOAc / Hexane = 8 / 2) : 化合物 9 Rf = 0.1。 1_{H NMR（CDCl} 3, 400 MHz）： δ6.78 (s, 1H), 6.53 (s, 1H), 6.28 (s, 2H), 5.99 (d, J = 8 Hz, 2H), 5.85 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.28-5.25 (m, 1H), 4.59 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 4.44 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 3.92 (t, J = 8.8 Hz, 1H), 3.8 (s, 3H), 3.75 (s, 6H), 2.96-2.91(m, 1H), 2.89-2.83 (m, 3H), 2.61-2.49 (m, 2H) +

HRMS（FAB） calculated for C25H28NSO8 (M+H ) , 502.1529; found, 502.1536

5. 化合物 10 的合成:

Cl O O O O O O O N N N 10 將化合物 5 (10.0 mg, 0.020 mmol)溶於THF / H₂O (1：1)中，並加入

3-chloro-1-ethynyl benzene(3.4 mg, 0.025 mmol) ，再加入 5.0 mg

CuSO 5H₄ ₂O和 10.0 mg sodium ascorbate催化反應三小時，等溶液成

黃色混濁，以TLC片觀察到有產物產生，以水和DCM萃取收集有機

層，並用Na SO₂ ₄除水之後迴旋濃縮。利用管柱層析純化，EtOAc /

Hexane = 3 / 7 到 6 / 4 為沖提液，得到化合物 10 產率約 77 %。TLC (EtOAc / Hexane = 5 / 5) : 化合物 10 R = 0.5。 f