以密閉式藻類毒性試驗研究 α,β-不飽和醛類之定量結構－活性關係

國 立 交 通 大 學

環 境 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

以密閉式藻類毒性詴驗研究

α,β -不飽和醛類之

定量結構－活性關係

Using a closed-system algal test to study the structure-activity

relationships of α,β-unsaturated aldehydes

研 究 生: 林 思 宏

指 導 教 授: 陳 重 元 教授

以密閉式藻類毒性詴驗研究

α,β -不飽和醛類之定量結構－活性關係

Using a closed-system algal test to study the structure-activity

relationships of α,β-unsaturated aldehydes

學生：林思宏 Student： Sz-Hung Lin

指導教授：陳重元 Adviser：Dr. Chung-Yuan Chen

國立交通大學

環境工程研究所

碩士論文

A Thesis

Submitted to Institute of Environmental Engineering

College of Engineering

National Chiao Tung University

In Partial Fulfillment of the Requirements

For a Degree of

Master of Science

In

Environmental Engineering

August 2011

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

I

以密閉式藻類毒性詴驗研究 α,β-不飽和醛類

之定量結構－活性關係

學生：林思宏 指導教授：陳重元

國立交通大學環境工程研究所

摘要

本 研 究 使 用 是 單 細 胞 綠 藻 類 - 月 芽 藻 ( Pseudokirchneriella subcapitata ) 為毒性測詴物種，以反應性物質 α,β-不飽和醛作為測詴毒物。 並以三個反應終點 ( △ DO、Final Yield、Growth Rate ) 於密閉式系統中 進行毒性測詴將此類化合物之物化特性或結構，與毒性建立統計上的關係 - QSAR 探討 α,β-不飽和醛對生物體造成毒性的作用機制。 親電性參數 Log ( 1/RC50 ) 與親脂性參數 Log Kow 對於α,β-不飽和醛 藻類毒性有良好相關性，證明 α,β-不飽和醛造成藻類毒性機制為不飽和π 鍵與藻類中親核詴劑作用 ( 如：穀胱甘肽；GSH ) ；以及 α,β-不飽和醛侵 入藻類細胞膜中造成毒性。 具反應性的 α,β-不飽和醛對於月芽藻之毒性數據可使反應性有機物建 立更完整毒性數據系統，增加反應性有機物數據庫完整性。此數據庫資料 可運用 QSAR 系統來預測其他 α,β-不飽和醛類的毒性，並且簡單而迅速的 推估出同類有機物質之毒性，不僅可節省龐大經費，亦可省下許多的時間 及人力。 關鍵字：α,β-不飽和醛類、月芽藻、QSAR、反應性有機物

Using a closed-system algal test to study the structure-activity

relationships of α,β-unsaturated aldehydes

英文摘要

Student：Sz-Hung Lin Advisor：Dr.Chung-Yuan Chen

Institute of Environmental Engineering

National Chiao Tung University

Abstract

A single-cell green algae (Pseudokirchneriella subcapitata) for the

toxicity testing species to α, β-unsaturated carbonyl compounds as a test

toxic in three reaction endpoints (Δ DO, Final Yield, Growth Rate) on

closed system for toxicity testing.

The results of QSAR in three reaction endpoints :

Log (1/EC

50

) = 0.965 + 0.968 Log(1/RC

50

) +0.169 LogK

OW

r

2

=0.806 (Δ DO), Log (1/EC

50

) = 1.200 + 1.000 Log(1/RC

50

) + 0.113

LogK

OW

r

2

=0.832 (Final Yield), Log(1/ EC

50

) = 0.985 + 0.997

Log(1/RC

50

) + 0.075 LogK

OW

r

2

=0.854(Growth Rate).

The QSAR of



- unsaturated carbonyl compounds not only predict

other



- unsaturated carbonyl compounds which untested but also

provide tools capable of the rapid screening of chemicals for potential

hazards.

Most



- unsaturated carbonyl compounds are more than 1, that the

toxicity of the reactive compounds are more intense than baseline toxicity.

Algae toxicity data on Pseudokirchneriella subcapitata of



-

unsaturated carbonyl compounds make more complete to toxicity datas of

reactive organic chemicals.

Keywords: α, β-unsaturated aldehydes,

Pseudokirchneriella subcapitata

, QSAR, reactive organic

III

致謝

二年來從一個很客氣的小朋友，變成一個嘴巴很賤的宏爺，這一切彷彿都照 這計畫進行，這段期間經歷了許多考驗，雖然中間沒有驚豔，但也是很好的經驗。 這二年我養的藻很乖，很聽話很給我面子，雖然它在上一屆很倔強，常常控 制組都不給學長姐好臉色，還好我接手以後把我跟它之間的誤會化解了，讓它變 成剛猛的猛男藻種，如今它已經交棒給下一屆飼養了，希望往後十年它還能每天 都像吃威而鋼一樣健壯，每天都能在 CONTER 上顯示翹翹的圖。 再來就是一個很衝動跟一個很緩慢的好同學，很衝動的阿芳每天都有新的 ideal 在腦中滾來滾去，唯獨腰圍卻還是依然健壯，穩如泰山，相信她那條 S 的 牛仔褲應該是衝動所造成犧牲品之一。很緩慢的祥祥，外表看似慈祥內心卻一點 也不慈祥，想跟他尬酒最好準備一個帳篷、一個枕頭跟盥洗用具，不然準備倒在 路旁看他微笑離去，相信他每次都說要揪卻遲遲讓我只看到空氣人形的 ANGLE 就是他緩慢下最好的證明，緩慢的手腳可能等到 ANGLE 老去他才能趁機而入， 但我想與其用榔頭逼他追 ANGLE，倒不如讓他自己看到哪天 ANGLE 嫁人了他 才恍攘大悟新郎不是他的冏境還來的有用(手腳請快點好嘛)。 表完了上面二位當然也是要稱讚他們對我的容忍，沒有你們二個互相照應， 我想我今天應該還在恆溫室哭哭等待著我的藻種茁壯發芽，可能還要面對葉老師 的苦毒在修一次那會讓人抓狂的地下水，或是甲水甲毒還要重考到第三次等等令 人可怕的課程。當然碩一去後龍烤肉，去過 N 次的錢櫃與好樂迪聽我美好的歌 聲以及中午一起走去吃到很膩的二餐等等都會是我研究所美好的回憶，我愛你們 二位! 最後就要說說這間很神奇的實驗室，歷經介華，庭孙，心渝，以及玉米投與 阿土伯等等人離開，以修維修過數次的 CONTER 以及每次都會寫錯我名子的 millpole 還有修一次費用就足以讓實驗室休假 TOC，這間實驗室簡直就是每天都 充滿了新的挑戰，只能說還好我畢業了，剩下的麻煩就交給小孟、筱涵、阿表去 表現了，加油了小夥子們，在談戀愛跟打球之餘，別忘了給點耐心給 LAB310 跟 311，不然你們就 QQ 了。 感謝已經畢業的學長姐，以及正在努力畢業的學姐還有我已經叫不出名子學 弟妹跟衝動的阿芳以及緩慢的祥祥，雖然我們的共同特點就是曾經都吸過老師辦 公室特有的煙味然後就沒有了，我還是很高興我進來這間實驗室，畢竟歡欣的宅 了 2 年如今我要飛越實驗室，去追我的女朋友了!! 掰掰 關鍵字：宏爺、COCO、麥當勞、壘球、帥哥

中文摘要 I 英文摘要 II 致謝 III 目錄 IV 表目錄 VI 圖目錄 VII

目錄

一、緒論... 1 1.2 研究目的... 2 1.3 研究方法及架構... 2 二、文獻回顧... 4 2.1 毒性物質-醛類及 α,β-不飽和醛類之介紹 ... 4 2.1.1 醛類之介紹... 4 2.1.2 α,β-不飽和醛之介紹 ... 4 2.1.3 醛類之物理特性... 5 2.1.4 醛類之化學反應... 5 2.1.5 -不飽和醛類之加成反應 ... 8 2.1.6 醛類來源及用途... 9 2.2 藻類毒性詴驗... 11 2.2.1 藻類毒性詴驗特性... 11 2.2.2 藻類毒性詴驗物種介紹... 11 2.2.3 藻類毒性詴驗... 12 2.2.4 藻類反應終點... 13 2.2.5 詴驗之重要參數... 14 2.2.6 揮發性有機物詴驗... 17 2.3 定量-結構反應關係 ... 18 2.3.1 QSAR 之簡介 ... 18 2.3.2 常用之 QSAR 參數 ... 19 2.3.3 QSAR 在環境毒物學上的應用 ... 21 2.4 -不飽和醛類之 QSAR 研究 ... 24 三、基本理論... 26 3.1 毒性詴驗終點... 26 3.2 常用的單一毒性模式... 27 3.3 基本生長動力學... 30 四、實驗設備與方法... 32

V 4.1 實驗設備及材料... 32 4.2 毒性詴驗藻種... 36 4.3 培養基質的配製... 36 4.4 詴驗毒物... 38 4.5 實驗前準備... 38 4.6 實驗步驟... 45 4.6.1 連續式母槽之培養... 45 4.6.2 藻類毒性詴驗... 46 4.7 RC50反應性參數值實驗 ... 47 4.8 實驗之品保及品管 (QA/QC) ... 49 五、結果與討論... 50 5.1 藻類毒性詴驗... 50 5.1.1 藻類毒性詴驗結果... 50

5.1.2 急慢毒性毒性比 ACR ( Acute to Chronic toxicity ratio )... 52

5.2 反應性參數詴驗結果 ( RC50 ) ... 56 5.3 -不飽和醛類 QSAR ... 58 5.3.1 -不飽和醛類數據整理 ... 58 5.3.2 -不飽和醛類 QSAR ( Log Kow ) ... 60 5.3.3 -不飽和醛類 QSAR ( RC50 ) ... 61 5.3.4 -不飽和醛類 QSAR ( RC50 及 Log Kow )... 62

5.3.5-不飽和醛類 QSAR ( RC50及 Log Kow ) 去除 tr,tr-2,4-nonadienal、 2,4-hexadienl ... 65 5.4 -不飽和醛類、酮類、酯類 ... 67 5.4.1-不飽和酮類、酯類之毒性數據 ... 67 5.4.2不飽和醛類、酮類、酯類比較 ... 67 5.4不飽和醛類、酮類、酯類 QSAR ... 70 5.5 希夫式鹼參數 Log ( KNH2 ) 之討論 ... 75 5.5.1 希夫式鹼參數 Log ( KNH2 )介紹 ... 75 5.5.2 醛類 7 組與希夫式鹼參數 Log ( KNH2 )之 QSAR ... 76 六、總結... 79 七、參考文獻... 80 附錄一、原始數據... 83 附錄二、統計方法... 104

表目錄

Table 2.3.1 Classification of reactive mechanism ... 23

Table 3.2.1 Weibull、Probit 與 Logit 容忍度分布模式 ... 29

Table 4.3.1 The consist of micro-algae medium ... 37

Table 4.3.2 The consist of micro-algae medium ( EDTA component ) ... 37

Table 4.4.1 Physical and chemical characteristic of unsaturated aldehydes ... 39

Table 4.5.1 The conditions of Coulter Counter ... 43

Table 5.1.1 Toxicity of α,β-unsaturated aldehydes ... 51

Table 5.1.1 The ACR values based on three endpoints ... 52

Table 5.1.2 NOEC, LOEC and EC10 based on three endpoints ... 53

Table 5.1.3 Coefficients of determination ( r2 ) for toxicity of algae and other species ... 54

Table 5.1.4 In comparsion of toxicity with other species ... 55

Table 5.2.1 Reactivity of Aldehydes for RC50 ... 56

Table 5.3.1 Data of α,β-unsaturated aldehydes for QSAR ... 59

Table 5.3.2 Result of QSAR for LogKOW of α,β-unsaturated aldehydes ... 60

Table 5.3.3 Result of QSAR for Log ( 1/RC50 ) of α,β-unsaturated aldehydes ... 61

Table 5.3.4 Result of QSAR for Log ( 1/RC50 ) & LogKOW of α,β-unsaturated aldehydes( whitout tr,tr-2,4-nonadienal and 2,4-hexadienl ) ... 66

Table 5.4.1 Data sets of α,β-unsaturated Acrylates and α,β-unsaturated Ketones ... 68

Table 5.4.2 Linear Regression of the alage Toxicity, Log ( 1/RC50 ), Log KOW for -Unsaturated Carbonyl Compounds ... 69

Table 5.4.3 Structures of 3-butyn-2-one and 3-buten-2-one ... 70

Table 5.4.4 Result of QSAR for Log ( 1/RC50 ) & LogKOW of -Unsaturated carbonyl compounds ... 72

Table 5.4.5 Result of QSAR for Log ( 1/RC50 ) & LogKOW of -Unsaturated carbonyl compounds ... 72

( without tr,tr-2,4-nonadienal、2,4-hexadienl and 3-butyn-2-one ) ... 72

Table 5.5.1 Data sets of alage toxicity and Log ( KNH2 ) ... 77

Table 5.5.2 Linear Regression of the alage Toxicity, Log ( 1/RC50 ), Log KOW for seven -Unsaturated aldehydes ... 78

Table 5.5.3 Linear Regression of the alage Toxicity ,Log ( 1/RC50 ),Log KOW, Log(KNH2)for seven -Unsaturated aldehydes... 78

VII

圖目錄

Fig 1.3.1 The flow chart of this study ... 3

Fig 2.1.1 α,β-unsaturated aldehydes ... 4

Fig 2.1.2 醛類氧化反應 ... 5 Fig 2.1.3 醛類還原反應 ... 5 Fig 2.1.4 還原成烴類 ... 6 Fig 2.1.5 還原胺化反應 ... 6 Fig 2.1.6 氰化物的加成反應 ... 6 Fig 2.1.7 胺衍生物加成 ... 7 Fig 2.1.8 醇類的加成反應 ... 7 Fig 2.1.9 Grignard 詴劑加成反應 ... 7 Fig 2.1.10 直接(1,2)加成反應... 8 Fig 2.1.11 酸催化直接(1,2)加成反應 ... 8 Fig 2.1.12 共軛(1,4)親核性加成反應... 9

Fig 2.2.1 Carbonate system and photosynthesis method for pH balance ... 14

Fig 2.3.1 Classification of toxicity mechanism in aquatic toxicity tests ... 22

Fig 3.2.1 Dose-response curve of common toxicity test ... 27

Fig 4.7.1 The flow chart of RC50 experiment ... 48

Fig 5.1.1 α,β-unsaturated aldehydes sensitivity of toxicity ... 50

Fig 5.2.1 Structures of 2,4-hexadienl、tr,tr-2,4-heptadienal and tr,tr-2,4-nonadienal 57 Fig 5.3.1 Log ( 1/EC50, Predicted ) vs Log ( 1/EC50, Observed ) for delta DO of α,β-unsaturated aldehydes ... 63

Fig 5.3.2 Log ( 1/EC50, Predicted ) vs Log ( 1/EC50, Observed ) for Final Yield of α,β-unsaturated aldehydes ... 63

Fig 5.3.3 Log ( 1/EC50, Predicted ) vs Log ( 1/EC50, Observed ) for Growth Rate of α,β-unsaturated aldehydes ... 64

Fig 5.3.4 Structure of 2,4-hexadienl and tr,tr-2,4-nonadienal ... 65

Fig 5.4.1 Log ( 1/EC50, Predicted ) vs Log ( 1/EC50, Observed ) for delta DO of -Unsaturated carbonyl compounds ... 73

Fig 5.4.2 Log ( 1/EC50, Predicted ) vs Log ( 1/EC50, Observed ) for Final Yield of -Unsaturated carbonyl compounds ... 73 Fig 5.4.3 Log ( 1/EC50, Predicted ) vs Log ( 1/EC50, Observed ) for Growth Rate of

-Unsaturated carbonyl compounds ... 74 Fig 5.5.1 Schiff base product in the reaction between primary amine and

1

一、緒論

1.1 研究緣起 日常生活中人類常暴露在各種各樣具毒性和具致癌性物質當中，α,β-不飽和羰基化合物為其中之一，其來源主要為天然代謝後產物與存在於外 界環境中之化合物。α,β-不飽和羰基結構主要由一個碳碳雙鍵(C＝C)結合 到一個羰基組(C＝O)。鄰近的碳碳雙鍵(C＝C)與羰基組(C＝O)增加了其親 電性[1]。因此，當 α,β-不飽和羰基化合物與特定的蛋白質及 DNA 作結合 時，可能會發生各種不良的影響性。此類 α,β-不飽和羰基化合物可能為醛 類，酯類，酮類，主要取決於α,β-不飽和羰基化合物結構上的排列。 人類暴露於繁多的 α,β-不飽和醛當中，因為它們普遍存在於各種食品 與香料物質當中(如 2 -己烯醛、肉桂醛、檸檬醛)或是為煙草和汽車煙霧中 的燃燒副產品[2]。因其對於電子豐富的生物性大分子具反應性，其會產生 不良的健康影響，包括一般毒性，致敏感反應，致突變性和致癌性[3, 4]。 蛋白質結合是造成器官毒性及過敏性反應的重要因素，因其可以直接損害 特定蛋白質的功能[5]。蛋白質結合反應可能為一個主要的因素，誘導其毒 性的產生，如水生毒性，呼吸道毒性，皮膚過敏性，肝細胞毒性和致突變 性[6]。 此類共價鍵為分子產生毒性影響的主要關鍵，最近的研究提出，毒性-結構的關係常利用不同的毒性反應終點來決定親電子詴劑與某些特定的 生物性親核詴劑的反應強度。外源性的親電物質與細胞內特定的親核位置 作用，此種作用型態主要是依賴於硬/軟酸鹼原理[7, 8]。一般的規則：硬親 電子詴劑偏向硬親核詴劑(如:離氨基酸的氨基、DNA)，以及軟親電子詴劑 偏向軟親核詴劑(如:穀胱甘肽)[6]。 複雜及不同結構之化學物質，由於種類繁多且數量龐大之因素，因此 無法針對所有化學物質一一進行完整之毒性分析。環境毒物學引用醫學、 製藥工業經常使用之定量-結構反應關係 ( Quantitative Structure-Activity Relatioships ; QSAR ) 可預測單一有機化學物質之毒性大小及可能造成毒 性之原因，可以簡單而迅速的推估出同類有機物質之毒性，不僅可節省龐 大經費，亦可省下許多的時間及人力。 藻類為水體生態系統的主要生產者，當水中毒性質對藻類造成毒性時 會導致生態其他消費者受到影響。其廣泛分布於水體環境中、生長週期短、 詴驗期間內帅年期或老年期對毒性物質忍耐力之差異影響亦較小，適合做 為工業廢水的生物活性指標，以及對不同種有機化學物質有不同的反應 為毒性測詴物種的理想選擇。

傳統的藻類毒性詴驗，大多是使用批次式開放性的系統來進行實驗對 於揮發性有機化學物質，會因為部分化學物質揮發，而造成毒性低估，因 此利用連續 ( Chemostat )的方式培養藻類，使藻類於槽中穩定生長 ，並取 穩定生長的藻於 BOD 瓶中進行實驗，因 BOD 瓶為密閉的系統 ，故可藉 此克服有機物揮發的問題[9, 10]。 本研究係以單細胞綠藻類 - 月芽藻 ( Pseudokirchneriella subcapitata ) 為毒性測詴物種、以反應性物質 α,β-不飽和醛作為測詴毒物，以三個反應

終點 ( delta DO、Final Yield、Growth Rate ) 於密閉式系統中進行毒性測詴 將此類化合物之物化特性或結構，與毒性建立統計上的關係- QSAR 探討 此類反應性物質對生物體造成毒性之毒性作用機制。

1.2 研究目的

1. 以密閉性藻類毒性實驗，研究 α,β-不飽和醛，以溶氧變化量 ( △DO ) 及藻類細胞密度 ( Final Yield ) 及藻類細胞生長率 ( Growth Rate ) 為

反應終點求得各毒性物質之半致死濃度 ( EC50 )，可做為毒性資料庫之 數據以利更完善的評估。 2. 將各種物化參數及親電性參數所建構之 QSAR 與藻類毒性實驗所得之 log ( 1/ EC50 ) 進行迴歸分析，以得知不同參數與毒性迴歸結果，可預 測其他同類有機物之毒性。 3. 藉由 QSAR 從統計學的角度來討論 α,β-不飽和醛毒性與作用機制之關 係，建立一個簡單的模式，使得我們得以進一步的解釋可能的作用機制 並利用利用親電性物質 α,β-不飽和醛與替代型軟/硬生物性親核詴劑之 間作用關係，描述α,β-不飽和醛對於月芽藻所造成之毒性機制。

1.3 研究方法及架構

由參考文獻中蒐集相關資料及數據，並決定實驗毒性化學物質後，再 將所選定之毒性物質之物化資料及研究文獻做進行進一步之整理，其後依 本研究室所建立之實驗及分析方法完成詴驗。 再將詴驗後所得數據以 Probit 模式分析，進而求得 EC50值及劑量反應 曲線 ( dose-response curve ) 最終再將實驗所得之結果進行更進一步之討 論並提出本研究之結論。詳細流程圖如 Fig 1.3.1

3 1. 蒐集相關資料及文獻 2. 選定實驗毒物及毒性數據 3. 物化資料收集及整理 4. 確認研究方向及目的 規劃實驗方法及步驟 TOC 定量分析揮 發性有機物濃度 α,β-不飽和醛類 月芽藻培養及實驗 步驟設計 1. 針對 Stock solution 定量 2. 求出名義濃度與實際濃 度之誤差比率 1. 不同碳數之 α,β-不飽和醛類 (C5~C10) 2. 甲基取代基之 α,β-不飽和醛 3. 單一π鍵 ( 碳 )；雙π鍵 ( 碳與碳 ) 1. 確認恆溫室內溫溼度為適當範 圍及震盪速度 2. 配置基質進行連續式藻類培養 3. 實驗時儀器及盤面光度校正工 作，使調整至合理的範圍內 進行密閉式藻類毒性詴驗 實驗數據整理及分析 1. 利用 Probit 模式計算出 EC50 2. 以藻類密閉式毒性詴驗與其他 物種進行比較 3. 建立 α,β-不飽和酮類之 QSARs 4. 從已建立資料庫之資料統整建 立更完整之 QSARs 實驗結果討論及結論

二、文獻回顧

2.1 毒性物質-醛類及

α,β-不飽和醛類之介紹

2.1.1 醛類之介紹

醛類 (Aldehydes)是有機化學中一種重要的官能基 (Functional Group) ； 以一個羰基 (C＝O) 為中心，羰基上的碳一側接氫原子，化學通式為 RCHO。醛類是醇類 (Alcohol, -OH) 氧化的產物，會再被進一步氧化成酸 (-C(＝O)OH)。 醛基是帶有極性的，氧原子是碳氧鍵中的負偶極，將碳原子的電子扯 向氧原子。根據醛基所結合的烴基的結構，醛可分為脂肪族醛和芳香醛。 脂肪族醛又可再分為飽和脂肪醛和不飽和脂肪醛。飽和脂肪醛如乙醛 (CH3-CHO)、丙醛 (CH3-CH2-CHO) 等，其中甲醛、乙醛、丙醛溶於水 C4 以 上 的 醛 由 微 溶 於 水 至 難 溶 於 水 ； 不 飽 和 脂 肪 醛 如 丙 烯 醛 (CH2=CH-CHO)。

醛類的俗名將相對應酸 (-ic acid) 以醛 (-aldehyde) 取代而得，支鏈醛

類以直鏈醛類的衍生物命名。要表示連接位置，可用希臘字母-，-，-

- 等；-碳是帶有-CHO 基的碳。醛類之 IUPAC 命名法照常法之命名之

以帶有-CHO 基的最長鏈為母結構，以相對應烷之烷 (-e) 以醛 (-al) 取代 而得。取代基之位置以號碼標出，而常以羰基碳為 C-1。應注意 IUPAC 命 名 C-2 相當於俗名之阿爾法 (alpha) 

2.1.2 α,β-不飽和醛之介紹

α,β -不飽和醛 (α,β - unsaturated aldehydes) 結構主要由一個碳碳雙鍵 (C＝C) 結合到一個羰基組 (C＝O) 的醛類，-C 為接醛基上碳之鄰近相接 的碳碳雙鍵 (C＝C) 之第一個碳，-C 為接醛基上碳之鄰近相接的碳碳雙 鍵 (C＝C) 之第二個碳。其化學結構如圖 2.1.1 所示

Fig 2.1.1 α,β-unsaturated aldehydes [11]

, (

R＝烷基鏈

)

C

O

₁

C

C

R H 2 3 4  

5

2.1.3 醛類之物理特性

室溫下，除了甲醛是氣體外，其餘醛均為液體或固體。低級醛有刺激 性氣味，而一些芳香醛和中級醛有香味，常用作化妝品和食品的原料。羰 基碳以鍵與其他三個原子連接，這些鍵利用 sp2_{軌域，故在同一帄面上。} 碳剩餘的 p 軌域與氧的 p 軌域重疊形成鍵，氧原子上還留有二對未共用 電子對，羰基帄面結構鍵角接近 1200_。 因為氧的陰電性高於碳相當多，所以碳-氧雙鍵具有極性，其中羰基上 的碳帶極性正電，為親電子性(路易士酸)，可與親核基反應；氧為極性負 電具親核性(路易士鹼)[12]。 羰基的極性使醛類成為極性化合物，因此其沸點比其分子量相近極性 化合物為高。因其僅有結合於碳的氫，故它們之間不可能有分子間氫鍵； 結果其沸點比分子量相近的醇類或羧酸類為低。可能因溶劑與溶質分子間 氫鍵之故，低級醛類可溶於水；溶解度界限約在五個碳。醛類皆可溶解於 一般有機溶劑[13]。

2.1.4 醛類之化學反應

1. 氧化反應 (Oxidation) 醛類容易被多數帄常的無機氧化劑，如氧溴硝酸氧化銀或同錯離 子氧化成縮酸。更有力的詴劑諸如鉻酸 (chromic acid) 及過錳酸鉀等。 其化學反應如圖 2.1.2 所示[13]： Fig 2.1.2 醛類氧化反應[13] 2. 還原反應(Reduction)

(1)

還原成醇類 醛類被還原成第一醇類，可以接觸氫化或利用化學還原劑如 氫化鋰鋁 (LiAlH4) 等還原之。此種還原可應用於合成其相對應的 羰基化合物來獲得某種醇類，特別是對於利用醛醇縮合的產生的 醛類有用。其化學反應如圖 2.1.3 所示[13]： Fig 2.1.3 醛類還原反應[13]

COOH

Ar

COOH

R

CHO

Ar

CHO

R



或

















或



Ag(NH3)2 + K2Cr2O7 KMnO4

C

OH

C

O

H2 + Ni,Pt, 或 Pd LiAlH4或 NaBH4然後 H+

(2)

還原成烴類

醛類可經下列二反應還原成烴類：(a)以鋅汞齊 (amalgamated zinc)與濃鹽酸作用的 Clemmensen 還原法；(b)以肼 ( hydrazine ) NH₂ 與 KOH 或第三丁醇鉀 (potassium tert-butoxide)等強鹼作用 的 Wolff -Kishner 還原法。其化學反應如圖 2.1.4 所示[13]： Fig 2.1.4 還原成烴類

(3)

還原胺化反應 甚多醛類 (RCHO)有還原胺化反應；及氨存在下的還原轉變 成胺。還原可由催化劑或利用氰氫硼酸鈉 (NaBH3CN) 完成。反 應涉及含一碳氮雙鍵 (C=N) 的中間物 (一種亞胺，RCH=NH 或 R₂C=NH) 的還原。其化學反應如圖 2.1.5 所示[13]： Fig 2.1.5 還原胺化反應 3. 氰化物的加成反應 HCN 之各元素加在醛類或同類的羰基上則產生稱為氫醇類 (cyanohy- drins) 的化合物。此反應成礦酸於羰基化合物及氰化納水 溶液的混合物中來完成。其化學反應如圖 2.1.6 [13]所示： Fig 2.1.6 氰化物的加成反應 C H H C H H C O Zn(Hg)2 濃 HCl NH2NH2 鹼 Clemmensen 還原法 用於對鹼敏感的化合物 Wolff-Kishner 還原法 用於對酸敏感的化合物

C

O

_{+ CN}

-一

一

H

+

_C

OH

CN

氰醇 Cyanohydrin

R

C

H

O

+

NH

3

R

C

NH

H

H2, Ni 或 NaBH3CN

R

NH

C

H

H

An aldehyde

An imine

一級胺

7 4. 胺衍生物加成反應 醛與胺或一級胺 (R’NH2) 反應可生成亞胺，胺親核性加到羧基上 ，接著脫去一水分子即生成亞胺。其反應如圖 2.1.7 所示[12]： Fig 2.1.7 胺衍生物加成[12] 5. 醇類的加成反應 在無水酸存在下，醇類加於醛類的羰基產生縮醛類(acetals)。此反 應將醛與過量無水醇及少量無水酸(常用氯化氫)，共置以完成之。其 化學反應如圖 2.1.8 所示[13]： Fig 2.1.8 醇類的加成反應[13] 6. Cannizzaro 詴劑的加成反應 在濃鹼的存在下，不含



氫的醛類進行自身氧化還原反應產生

醇及縮酸鹽的混合物

。此反應稱為 Cannizzaro 反應，一般係使醛與 濃氫氧化物水溶液或酒精放至於室溫另其發生反應。其化學反應如圖 2.1.9 所示[13]： Fig 2.1.9 Grignard 詴劑加成反應[13]

C

O

：NH

2

R

C OH NHR

C

N R

+ H

2

O

醛

胺，醇的中間物

亞胺

+ 2ROH

C

O

H

+

C

OR

OR

+ H

2

O

縮醛(acetal)

C

H

O

2

強鹼

COO

+

+

CH

2

OH

2.1.5



-不飽和醛類之加成反應

當-不飽和醛與親核性詴劑反應時，它們可以依兩種方式進行：它們 可能循一種簡單加成反應(simple addition)進行，即直接(1,2)加成反應，就 是親核劑直接對羰基的雙鍵進行加成反應；或者，它們也可循一種共軛加 成反應(conjugate addition)進行，即共軛(1,4)加成反應，就是親核劑對 -不飽和羰基化合物上得碳進行加成反應。

1. 直接(1,2)加成反應(nucleophilic addition reaction)

醛最常見的反應是親核性加成反應，親核詴劑加到羰基電子的碳上 生成鍵結，同時羰基的碳由 sp2_{混成軌域變為 sp}3_{，而 C=O 雙鍵的一對} 電子移至氧原子上，形成過渡狀態[12]。在過渡狀態中，碳開始獲得其 生成物所具有之四面體組態[13]。其反應如圖 2.1.10 所示： 如有酸的存在，氫離子則連接於羰基氧上，此種優先質子化能使氧 獲得電子而不接受負電荷，故降低了親核性攻擊的活化能。因此醛類 的親核性加成反應可受酸類的催化[13]。其反應如圖 2.1.11 所示： Fig 2.1.10 直接(1,2)加成反應[13] Fig 2.1.11 酸催化直接(1,2)加成反應[13]

C

R'

R

O



-Z

C

R'

R

Z

O

-C

R'

R

Z

OH

H

2

O

反應物

正在變成四面體中 部分負電荷在氧上 四面體中 負電荷在氧上

過渡狀態

生成物

C

O

R'

R

：Z

C

O

R'

R

C

OH

R'

R

：Z ⊕

C

R'

R

O



+

Z

C

R'

R

Z

OH

H

+

更易進行親核性攻擊

9 2. 共軛(1,4)親核性加成反應 (conjugate addition) 當 α,β-不飽和醛類與親核性詴劑反應時，它們可以依二種方式進 行 ：當它們循一種簡單加成反應 (simple addition) 進行時，那就是親 核詴劑直接對羰基上雙鍵進行加成反應；或者它們也可能循一種共軛加 成反應 (conjugate addition) 進行[14]。其反應如圖 2.1.12 所示： 共軛加成反應，首先會生成一可穩定共振的烯醇離子(enolate ion) 接著碳產生質子化，而得到飽和的醛。 Fig 2.1.12 共軛(1,4)親核性加成反應[12]

2.1.6 醛類來源及用途

中級分子量而不形成氫鍵的天然產物通成頗具有揮發性[15]。在花開 的植物中，這些化合物主要的任務是吸引昆蟲、蜜蜂蝴蝶，協助傳粉作用。 醛類被發現廣佈於動植物界，許多羰基化合物是香料，香劑，及酒類芬芳 氣味的來源。如：樟腦 (camphor)、香草精 (vanilla) 、桂皮醛 (cinnamon) 等[15]。 在工業上，常使用的醛類化合物有甲醛、乙醛及丙烯醛三種： 1. 甲醛(Mathenal,Formaldehyde) 甲醛為最簡單的醛類化合物，其反應性為醛類單一官能基化合物中 最高的，於工業製程中廣泛使用。尿素甲醛樹脂、三聚氰胺樹脂、苯酚 甲醛樹脂、聚氧化甲烯（polyoxymethene,甲醛和三環氧乙烷的聚合物）、 丁二醛等均是由甲醛製造的產品，其中以合成樹脂工業以 50%佔大部 分。甲醛與甲醛衍生物的 銷售價值超過 1450 億美元，佔美國與加拿大 GDP 的 1.2%。 C O C C Nu

：：

：

：

一 C O C C Nu

： ：

：

一

C

O

C

C

Nu H H3O+ -不飽和醛

C

O

C

₂

C

1

R

3 4 Nu

-：

烯醇離子 飽和醛

農業、造紙業、紡織工業、染料及醫藥分析常使用甲醛為溶劑或反 應物。甲醛是建築磚塊合成的重要原料；紡織業者則利用甲醛使布料具 有抗皺性；甲醛也是汽車製 造業關鍵原料，用來製造傳輸元件、電氣 系統、發動機缸體、門板、車軸等。此外，甲醛廣泛使用於木材加工與 家具製造業，甲醛與酚、尿素或三聚氰胺等生成熱固性酚甲醛樹脂、尿 素甲醛樹脂、三聚氰胺樹脂是常使用於合板或地毯的永久性黏著劑。甲 醛亦可當作濕強度 (wet-strength) 樹脂添加於衛生用紙製品如面紙、餐 巾紙與滾筒衛生紙等。 甲醛有毒，40%甲醛水溶液可作為殺菌劑或防腐劑，亦可使用於疫 苗製程上，用來製造滅活細菌類毒素疫苗產品。 建材常使用的甲醛樹 脂，是一種比較常見室內空氣污染物有引發過 敏與致癌的危險性。當 空氣中甲醛濃度達 0.1ppm 時，會刺激眼睛、黏膜導致流淚，吸入過量 甲醛會引起頭痛、喉嚨燒灼、呼吸困難、引發或加重哮喘症狀。因此早 在 1987 年美國環保局 (U.S.EPA) 將甲醛列為人類可能致癌物，經過研 究，1995 年世衛組織國際癌症研究機構 (International Agency for Research

on Cancer) 亦將甲醛劃分為一可能的人類致癌物，根據進一步的信息評 估與研究數據顯示，甲醛與鼻竇癌、鼻咽癌及白血病有關，在 2004 年 6 月國際癌症研 究機構將其重新分類為人類致癌物質。 2. 乙醛(Ethenal,Acetaldehyde) 乙醛主要為製造醋酸或醋酸酐、丁醛、乙酸乙烯酯、樹脂及砒啶 (pyridine)衍生物的中間物。使用於水果或魚類的保存、酒精的變性劑、 燃料組成、膠質堅固劑、皮革防霉劑以及橡膠與造紙業的溶劑等。除化 學合成外，乙醛存在於碳氫化合物的氧化物、高等植物光合作用的中間 產物、成熟的水果（少量）、暴露於空氣中的酒類等。它也是人體醣類 新陳代謝的 中間產物，因此少量存在於血液中。資料顯示，新鮮菸草 葉及其煙霧中，亦含有乙醛，與尼谷丁產生協同效應，增加青少年成癮 性。此外，汽機車內然機所排放的廢 氣亦含有乙醛。 乙醛是一種可能的致癌物質：國際癌症研究機構 (IRAC) 指出，在 動物實驗中，有充足證據顯示乙醛的致癌性。乙醛結合蛋白質，會破會 DNA 與造成肌肉異常發展。研究 818 位嚴重酗酒患者發現，他們在乙 醇脫氫酶基因上有缺陷，因此比正常人更易在上消化道與肝臟罹患癌 症。 3. 丙烯醛 (Propenal,Acrolein) 丙烯醛因具有共軛羰基與乙烯基 (vinyl group) 所以有高反應性 可用來製備聚酯樹脂(polyester resin)、聚胺基甲酸乙酯 (polyurethane)、 丙二醇、丙烯酸、丙烯腈、丙三醇等，所以廣泛用於工業製程中，如紡 織業、造紙業、橡膠業、製 藥業、塑膠業及樹脂合成等。

丙烯醛對肺有嚴重的刺激性，也可當做催淚劑，在一次世界大戰當 作生化武器使用。丙烯醛濃度達 2 ppm 對人體有立即性的傷害。2006

11 年 10 月，研究人員發現菸草煙霧中的丙烯醛與罹患肺癌有相當的關連 性。此外，他曾被作為廢水的除臭劑。

2.2 藻類毒性詴驗

2.2.1 藻類毒性詴驗特性

藻類對於水中毒性則相當敏感，較常用於急毒性之生物指標。而在水 體生物毒性詴驗中，藻類由於下列優點而被廣泛用於進行毒性之研究： 1. 藻類在水生生態系統中是主要的生產者，且其處於食物鏈底部，若其遭 受到毒性化學物質的危害，則會對水生系統之營養層級造成很大的影 響。 2. 藻類的培養以及取得較其他物種容易許多，且所需要的成本較低，並可 快速進行詴驗，可以節省更多的時間與成本。 3. 在毒性詴驗過程中，藻類生長過程可分成四個階段：遲滯期(Lag phase)、 對數生長期(Exponential phase)、穩定期(Stationary phase)及死亡期(Death phase)。在良好的培養環境下，可以迅速讓藻類到達對數生長期和穩定 期，並且持續一段較長的時間，如此便有利於實驗之進行。其他某些生 物實驗則必頇受到長期的帅年期或生命週期之限制。 4. 相對於魚類及無脊椎動物詴驗，藻類詴驗有較佳的敏感度及較優的 再現。尤其於密閉式之藻類毒性詴驗中[16]。

2.2.2 藻類毒性詴驗物種介紹

在自然水體中存在於相當多種藻類，於標準測詴方法公佈之詴驗藻種 也相當多，本實驗所使用之月芽藻(Pseudokirchneriella subcapitata)屬於綠 藻(Chlorophceae)，其特色為單細胞成群但不糾結且不移動，一般細胞體積 為 40 至 60 μm3_{且重量介於 10 至 20 pg/cell 之間。其體型成半月型，故稱} 月芽藻。此類的藻類較其他微生物詴驗來的敏感[17]，這也是本研究選取 此類藻類做實驗的主要原因之一。月芽藻一旦生長條件不適或遭受毒性物 質危害時，其顏色會由原先的綠色轉為微黃色，因此很容易於培養中觀察。

且細胞變肥厚且半月型彎曲程度會變小，以顆粒記數器觀察其粒徑的分佈 變化也可發現大粒徑的藻類分佈變多，而小顆粒的藻類分佈相對減少。實 驗藻種購自於 University of Texas, Austin。

2.2.3 藻類毒性詴驗

藻類毒性詴驗可分為批次式和連續式兩種。而目前已有的標準藻類毒 性詴驗，大都屬於批次式的詴驗方法，如 U.S.EPA 所採用的 Fresh water algae acute toxicity test 、 OECD 所採用的

Algal growth inhibition test

guideline

、ISO 所採用的 Water quality-algal growth inhibition test、APHA 所採用的 Toxicity testing with phyto-plankton 及 ASTM 所採用 Standard Guide for Conducting Static 96h toxicity tests with Microalgae 等。

批次式毒性詴驗為起初提供藻類足量的生長基質，但是在後續的實驗 過程中則不再添加任何基質，亦無藻類之代謝物質流出。在此條件之下 基質的消耗及代謝物的累積皆會降低藻類毒性詴驗之敏感性，同時也難反 應出真實水體中的情況。但由於此方法的優點為操作容易、成本低廉且可 同時處理大量之樣本，因而到目前為止仍被廣為使用。若再依據詴驗中與 外界氣體是否有接觸而進行分類，可分成開放式批次實驗與密閉式批次實 驗兩種。開放式批次實驗系統雖然可以藉由震盪與外界空氣接觸，而達到 提供碳源之目的，但若考慮揮發性有機物於實驗期間的揮發行為，則在濃 度上的控制將是一大難題。相反地，密閉式批次實驗並無毒物揮發之問題 存在，其藻類生長所需之碳源則必頇提高(基質或 headspace)。 連續式毒性詴驗為控制基質以連續方式加入系統中，較符合自然水體 的真實情況且代謝物亦同時流出，因此使得藻類保持於良好的生長環境之 中。但是由於整體系統流量不易控制，所以目前並無一套標準的詴驗方法。 連續式毒性詴驗又可分為恆濁器(Turbidostat)和恆化器(Chemostat)兩種。恆 濁器是利用光電原理來控制，當槽內細胞密度超過穩定值時，系統將流入 新鮮基質以稀釋槽內的細胞密度。恆化器是利用穩定的基質進流率，而達 到系統細胞密度的穩定。 本研究使用兼具實用性、敏感性及簡便性的藻類毒性詴驗法進行實驗 詴驗期間所需的藻類由「連續式培養方法」建立的藻液培養母槽取得，在 詴驗方面則採「批次 BOD 瓶式的藻類毒性詴驗」進行，內容描述分別如 下：

1. 連續式培養方法 (Continuous culture technique)

13 的 Pseudokirchneriella subcapitata 活化，第二為批次培養，即經過數天 活化後，將藻類加入定量的營養鹽基質的錐形瓶進行批次培養，第三為 連續式培養，即待錐形瓶中藻類的數目已達最大生長量的 80%~90%(藻 數約 2.2~2.8 ×106 _{cells / mL)時，置入於連續式培養母槽中，而營養鹽的} 供給主要由蠕動幫浦控制，也就是可由控制稀釋率(dilution rate，即 D＝ 基質流入量和反應槽體積之比值)來決定槽中細胞密度之多寡。當在低稀 釋率時，會使營養鹽濃度降低，接著細胞的毒性容忍度也跟著降低，如 此會導致細胞有較高的敏感性。當改變稀釋率則母槽約需 2~4 天即可達 到新的 steady state。為了讓藻類達到較佳的敏感性，本實驗將稀釋率設 為 0.30day -1 _{(水力停留時間為 3.3 day )來提供適量基質使藻類的生長與}

營養鹽的供給達成一動態的帄衡，讓藻類在 exponential phase 和stationary

phase可停留較久，待系統達到穩定後，即可由母槽中取出藻液進行毒性

詴驗而不會污染到母槽。

根據 Chen and Lin[18] 以連續式藻類母槽系統 (chemostat) 為基礎 進行培養藻類， chemostat 的容量為四公升，培養期間不僅有新鮮基質 流入也有代謝物的流出，此狀態與自然水體較相似，可改善了「批次式 培養(batch culture)」的缺點，即可避免加入的營養鹽完全拘限在一密閉 空間，而導致的匱乏和變質的現象和代謝物累積情形。

2. 批次藻類毒性詴驗 (Batch of toxicity tests with microalgae)

Chen and Huang [9]利用連續式的培養方法結合了 BOD 瓶 ( BOD Bottle) 發展出詴驗方法為「48 小時的批次式 BOD 瓶藻類毒性詴驗」其 主要為使用體積 300mL 的 BOD 瓶，將藻類、營養鹽和詴驗毒物加入其 內，再用蓋子密封，讓藻類暴露於毒性物質一段時間，由觀測終點量測 實驗組與無暴露控制組的抑制情形並進行比較分析。整個實驗過程中沒 有新鮮基質的加入，也沒有藻類之代謝物移出，在其優點操作簡單，時 間與成本的耗費也大幅減少，且可處理較大量的樣品數、實驗數據取得 容易，所以相對了提高實驗的再現性。 2.2.4 藻類反應終點 在藻類毒性詴驗中，若能正確的應用詴驗結果之觀測終點，即可得知 藻類受到毒物影響之生長抑制情況。一般應用的藻類生長參數為：1.細胞 密度 2.乾重 3.葉綠素 4.產氧量、ATP 及 DNA 等等。此外，藻類生長抑制 的情形也易受儀器的精密度、敏感性、偵測極限及測量時間的影響，因此 研究人員應先考慮實驗之器材及設備的可用性及性質，以減少毒性詴驗結 果所產生之誤差。 目前針對批次式培養之藻類毒性詴驗中，多以測量生物質量(biomass)

為量測終點。所謂的生物質量即是測量生物乾重及數目。Christensenet. al. [19]認為以生物質量求得的抑制率做為觀測終點較其它參數(總細胞數目、 細胞體積)為佳。但直接量測生物乾重十分費時且程序繁瑣，因此目前皆利 用電子顆粒計數器、光學顆粒計數器等量測生物乾重，而這些方法不僅簡 單、快速，所需的藻液量亦少，且與生物乾重間有良好的相關性。此外溶 氧測定也擁有成本低廉、詴驗時間短等優點。因此，本研究將以觀測藻類 細胞密度(Final yield and Growth rate)及溶氧變化(DO)，以電子顆粒計數器 測量細胞密度，溶氧測定儀測量藻液中溶氧量之變化量，並藉由 probit 模 式將實驗結果轉變成藻類生長抑制率及斜率。

2.2.5 詴驗之重要參數

在進行任何的毒性詴驗之中，其結果皆可能不盡相同，而不同的操作 參數皆可能是導致實驗結果差異的主要因素之一，因此對於各參數必頇進 行嚴格的控制並了解各參數對於藻類生長與毒性之間是否有其相關性。下 列為本研究中所考慮之參數： 1. pH 控制及碳源供給 由於藻類因進行光合作用而導致 pH 產生明顯的變化，因此於實 驗系統中若不對 pH 加以控制的話，則重復性的詴驗將難以進行。此 外，在碳源方面，由於藻類生長時首先會消耗水中之溶解性二氧化碳 (本實驗設備之曝氣幫浦和氣體鋼瓶所提供)，次者為培養基 (medium) 中的碳酸氫納(NaHCO3)，當碳源不足時則會造成藻類死亡。在 pH 控 制方面，由於預測某特定 pH 值情況之物種濃度較有其因難性，且 pH 亦會改變毒性物質於水中的型態及濃度，進而影響毒性的大小。 如 HCN 於 pH 7.8 降至 7.5 時，毒性會提高十倍左右。因此標準藻 類毒性詴驗皆傾向於固定 pH 值。Nyholm[20]提出固定藻類 pH 的方 式，如圖 2.2.5.1 所示：

Fig 2.2.1 Carbonate system and photosynthesis method for pH balance[20] ( Biomass production CO2(gas) _CO2(aqua) HCO3 -CO3 -H2CO3 )

15 不同的標準方法對於 pH 的變化皆有不同之規定，如 U.S.EPA 要 求最終之 pH 需再 8.5 之下，OECD 則規定 pH 的變化不可超過一個單 位；ISO 則要求 pH 的變化不可超過 1.5 的單位。因此控制 pH 變化的 方法大致上有下列幾種：

(1)

減少接種生物量

(2)

系統加入二氧化碳加以曝氣

(3)

維持均勻振盪

(4)

保持空氣流通

(5)

縮短整體的實驗時間 Arensberg et al. [21]利用月芽藻為詴驗物種進行藻類毒性詴驗，為 防止 pH 值的變化而將詴驗時間由三天縮短為二天。而 Lin et al.[10]於 密閉式藻類毒性詴驗中並未控制整體系統之 pH，發現當水中溶解性金 屬對於藻類的抑制率高於 20%時，系統中的 pH 變化大多皆在 1.5 個單 位以下，因此認為藻類毒性詴驗是不需要針對 pH 變化而加以控制。 本研究依據早期之藻類毒性研究方法[18]於進行毒性詴驗前，將 pH 控 制於 7.5 左右，使其減少 pH 變化所造成之可能誤差性。 2. 光照強度

Nyholm and Kälqvist[20]提到光照強度會影響藻類行光合作用，因 此在其藻類毒性詴驗的設計中如要使藻類維持在 exponential phase，則 光照需設為常數，要維持在該條件下的方法有兩種：(1) 保持較低的 生物質量(biomass)、縮小培養體積及提供充分之混合，此一方法的主 要目的是為可減少「自身遮蔽（self-shading）」所產生之影響，即排除 因光源的遠近距離使得光照強度之差異。(2) 為提供飽和的光照強度 使得藻類能吸收到一定量的光度而不會影響到生長。因此，如光照強 度為一常數時，能使藻類呈現對數生長，縮小培養體積等優點以利藻 類處於理想的環境中。

本研究依照 U.S. EPA[22]標準方法針對 Raphidocelis subcapitata 的 規定，於連續式培養和批次詴驗中所選擇的光照的強度為 4300±10% lux， 與其它標準方法 ISO、OECD、EEC 的 8000 lux 不同，採用連續 式的光照來排除光暗交替循環式的光照所導致的藻類生物質量變異的 缺點。 3. 溫度 採用 U.S. EPA[22]建議的 24±1℃，在恒溫室下培養藻類及進行實 驗，整個培養及詴驗過程中需注意恆溫室中溫度的變化，讓溫度維持 在帄均溫度變化量 1℃，以確定實驗進行溫度分布的均勻度。

4. 植種之藻液初始密度和詴驗時間 在批次式實驗中，當植入 BOD bottle 的藻液初始密度過低時，即 藻類細胞數目過少，會導致些微的細胞數量變動便可讓生長率產生大 幅度的變化，將這樣的數據輸入 probit 等模式計算出的 EC50 也會有較 大的變異性（C.V.值），反之若植入的藻液初始密度過高時將會造成實 驗後期由於藻類細胞大量增加造成代謝物累積及水中碳源耗盡而導致 pH 值升高和 EC₅₀會隨之顯著升高等問題，進而影響毒性詴驗結果之 精確度，因此決定較適當的植種數量是影響詴驗結果中很重要的因 子。 詴驗時間的長短會關係到毒性詴驗的敏感性和數據結果，如過長 的詴驗時間，會使得存在於 BOD bottle 內的營養鹽不足，使得無加毒 物的藻類也會與有加毒物的藻類發生出死亡的現象，受處理組與控制 組在最終產量的差距會逐漸縮短，此外過長的詴驗期間，也會使得毒 性的反應消失，在 Lin[10]詴驗結果發現隨著時間增加，毒性詴驗的敏 感度提高而 C.V.值減少，隨著初始植種密度減少，則敏感度提高但 C.V. 值亦提高。在兼顧兩者的考量下，本詴驗選定最佳化條件為控制 BOD bottle 內藻類初始植種密度在 1.5×104 cells/ml，詴驗時間為 48 小時。 5. 實驗培養基 實驗培養基的成份是影響微生物毒性詴驗結果的重要因子之一 [23]，而主要之影響培養基因子有 pH、硬度、螯合劑、氮、磷及一些 主要陽離子。一般為了使詴驗之環境符合自然環境之情況及讓藻類能 有效的利用微量元素，於詴驗中會額外加入一定量之螯合劑(EDTA)。 此外，氮、磷元素對於藻類生長與毒性詴驗結果影響最大。因此即針 對上述之培養基質進行分別探討： (1)氮、磷的影響 在一般的自然水體中，存在這各種不同的生長元素，其中以氮、 磷兩種元素為藻類生長的主要限制因子。Lin[10] 針對重金屬鋅及有機

物質酚進行毒性詴驗，由詴驗結果發現，當 U.S. EPA 營養基質的 HCO3

-加倍後對毒性詴驗敏感度之影響並沒有一定之趨勢，而且並不會對其 毒性反應造成太大之影響，而最直接影響藻類生長最主要的因素則為 氮或磷的濃度，此即為藻類生長的限制性因子。 在水中只有 PO43--P 形態能夠直接被藻類吸收，故於各種藻類詴 驗 方 法 中 ， 磷 皆 是 以 正 磷 酸 鹽 之 型 態 存 在 ( 如 ISO 和 OECD 是 KH2PO4，U.S.EPA 是 K2HPO4)，至於氮的形態，由於 NO3--N 及 NH4+-N

皆能被藻類吸收，在 ISO 和 OECD 用的是 NH4+ (NH4Cl)形態，U.S.EPA

17 異營菌能快速利用 NH4+-N 而快速生長，且 NO3--N 不似 NH4+-N 那麼 容易為異營菌所使用，所以一般自然環境中藻類的氮源應是硝酸態。 (2) 螯合劑 (EDTA) 的影響 一般為使詴驗之狀態符合自然環境狀況及讓藻類能有效利用微 量元素於詴驗時會在培養基中加入固定量之螯合劑，但根據文獻指出

一些螫合物如 EDTA、NTA 等與常見之二價金屬 (Cu2+_、Cd2+_、Ni2+_、

Pb2+、Zn2+_{) 所形成的親水性複合物，較之前未螫合時呈現的游離態時} 的毒性還低，因此倘若進行重金屬實驗時勢必會影響毒性詴驗之結果 [25, 26]。因此，1996 年 U.S. EPA[22]建議在培養藻類時可加入固定量 之螯合劑於培養基中，但在進行藻類毒性詴驗時，培養基中則不添加 任何螯合劑。

2.2.6 揮發性有機物詴驗

早期的標準生物詴驗方法皆以評估「水溶性」及「非揮發性」的化學 物質，尚無方法可偵測揮發性有機物的毒性[27]。其主要因素為傳統的批 次式毒性詴驗方法皆為開放式系統 (Open-system)，此一系統會提供激烈的 振盪以利藻類進行氣體交換並得到無機碳源 (CO2)。但揮發性化學物質濃 度會伴隨著詴驗期間拉長及震盪詴驗瓶之過程中逐漸消失因而低估其毒 性，相對地亦造成各個實驗室測詴的毒性結果會有所差異。 一般藻類毒性詴驗之密閉式系統，需考慮下列兩項重要的因素： (1) 為提供足夠的碳源，以避免藻類會因為碳源不足而生長受到抑制。 (2) 為確保詴驗毒性物質於詴驗期間因揮發作用而改變毒物濃度。 本詴驗方法為密閉式 BOD 瓶藻類毒性詴驗，為了改善上述的缺點不 讓揮發性物質的濃度會因為詴驗容器的上方留有未裝滿液體的空間(head space)而有揮發、濃度減少的情形，因此在本詴驗的容器 BOD 瓶會將液體 (毒物+基質) 加滿至不留空間，讓 Head Space 減至最低；在提供足夠的碳 源的部分，事先將去離子水以 CO2－N2混合氣體曝氣，一方面除去水中溶 氧，另一方面便是增加碳源，讓營養液能有足夠的碳源使藻類生長不受抑 制。

2.3 定量-結構反應關係

( Quantitative Structure-Activity Relationship；QSAR )

2.3.1 QSAR 之簡介

傳統的生物分析法可得知有機化合物對生態環境所造成之衝擊，但其 缺點為所需的時間較長，且由於大量新的化合物不斷的推陳出新，因此即 必頇建構出一套可快速預測化合物毒性的方法，以減少時間及金錢上的浪 費。 早在西元 1930~1960 年期間，就有幾位學者專家為了研究物質的化學 結構與其活性的關係，提出了 formal structure-activity relationship 的理論 之後並陸續地應用在藥物以及殺蟲劑的研究方面，一直到了西元 1970 年 才有學者提出了 Quantitative Structure-Activity Relationship ( QSAR )，並且 開始廣泛地應用在環境毒理學上的研究。簡單來說，它就是以一種物質的 化學或物理性參數，來建立一個模式，描述並預測此物種與這些參數之間 的毒性關係。環境毒理學中，QSAR 的建立即是為了預測每日所不斷產生 的新化學物質的毒性，因此為了能建構有效的 QSAR 模式則必頇注意下列 因素： 1. 應用於 QSAR 模式之參數，必頇在極小的偏差範圍之內，所建立之模 式才能有效並準確的預測毒性大小及毒性反應機制。 2. 目前為止，QSAR 模式的發展僅應用於預測單一毒性物質之毒性，對於 混合毒性之分析尚未有完整之研究。 4. QSAR 模式並非以一種模式就可以包含各種形式的化學物質。簡單而言， 針對某一種毒性物質之研究，最好能配合該毒性物質之衍生物同時進行 分析，其所建立之模式才有最佳之效果。 4. QSAR 模式所應用之毒性數據及參數，需有容易取得之便利性。此外 需針對實驗毒物之特性篩選所使用之參數；例如，該毒物為低水溶解 性，則不應將溶解度當為建立 QSAR 模式之參數。

19

McFarland[28]認為化學物質的毒性主要有下列兩種因素所造成： 1. 毒物進入生物相的穿透力。

2. 毒物和反應位置的相互作用。 以數學模式表示法如下：

Log (toxicity)-1=A[ log (penetration) ]+B[ log (interaction) ]+C

其中 penetration 最常使用的參數為 LogKow，而 interaction 則為許多

不同的親電性參數，像是 pKa 以及分子軌域能量(Ehomo 和 Elumo)參數 等。

2.3.2 常用之 QSAR 參數

參數含喻一些結構上的特性及性質，因此在定量方法上可利用生物活 性進行迴歸；一些特定物理化學性質參數值，可代表毒性物質與受測物種 之間的作用力。一般使用的 QSAR 參數大致可分為下列幾種類型： 1. 親脂性參數 (hydrophobic or lipophilicity parameter)

建立QSAR 模式最常使用的參數即為親脂性參數，這方面的參數包 括溶解度、辛醇-水分配係數 ( log Kow ) 等。因為此參數與毒性的水溶 性、薄膜的滲透性及提供配位基 (ligand) 與接受器 (receptor)的鍵結有 直接的關係。簡單而言，各類化學物質和不同生物系統的作用未必相同 但是當化學物質要進入細胞體內時，親油性的作用機制將優先考慮於化 學物質和反應位置的作用，因為疏水性物質對細胞的作用機制被認為與 被動擴散 (Passive diffusion) 有關，所以穿透細胞膜的動力是與化學物 質的疏水性有直接關係。 親脂性參數定義為一個化合物在水溶液相和非水溶液相分佈的情 況；早期對於分佈係數 (partition coefficient ; P) 的定義為與「輕」和「重」 相有關。現今對於 P 的定義為物質濃度在有機相和水溶液相帄衡時分 佈的比例。 P= C_org/C_aq 在較早時期的QSAR 模式中會使用不同的有機相和水相系統所得 到的分佈係數，但自從Hansch使用有取代基的苯甲酸正辛醇和水的分 佈係數後，正辛醇即變成分佈係數中所使用的有機相。 Russom et al.[29]指出擁有越高 log P的物質會增加物質在水中與生物(Biophases 的帄衡時間，因而增加其LC50 ratio (24h LC50 / 96h LC50)。現今已有很

間的預測起始點不同，因此導致有不同的結果，由其是對於一些溶解 度低的化學物質，預測的結果常會與實驗所得的結果有偏差[28]。 2. 電子參數 (Electronic parameter)

分子的電子性質可以用許多不同類型的參數來描述。一般這類型

的參數包括有原子電荷數 (Atomic charge) 、分子軌域能量 (Ehomo 和

E_lumo) 、未定域化 (Delocalizability) 、偶極矩 (Dipole moment) 、 Hammett 取代基常數 (Hammett sigma substituent constant; σ ) 和還原 位能 (Reduction potential)等。上述之所有參數皆描述一些基團 (group) 或取代基對電子分佈的影響，因此在 QSAR 的建立上都有應用過這些 參數。相對於描述整個分子性質的參數 (親脂性參數和莫耳折射率) ， 電子參數主要著重於一些原子或基團 (除了偶極矩)。

根據(Atkins, 1994)[30]第五版的物化課本中指出，highest occupied molecular orbital (HOMO)和lowest unoccupied molecular orbital (LUMO) 這兩個軌域會共同形成分子的「Frontier orbitals」，這個軌域對於一個 分子的化學及光學性質具有高度的關聯性。當分子之間以形成電荷轉 移方式相互作用時，HOMO 可作為分子給予電子能力的量度；而 LUMO 則可做為分子接受電子能力的量度，亦即電子是從HOMO 轉 移至LUMO，因此透過HOMO 和LUMO 來了解分子的電離能力和電 子親合力。 3. 立體 (空間) 參數 (Steric parameter) 立體效應很難去描述，因為在鍵結位置時的 3D 結構通常很難取 得。立體效應常數 Es 是在QSAR的研究中第一個被使用來描述立體效 應的參數，而其他相關參數包括總表面積 (Total surface area)、總分子 體積 (Total molecular volume) 及莫耳折射率 (molar refractivity) 等。 Di Marizo and Saenz [31]發現化學物質之分子體積與其毒性成正比，因 為在相同濃度的溶液當中，分子體積較大的化學物質佔有較大的體積分 率。

4. 分子連結參數 (molecule connectivity indices；MCIs)

最早是由 Randic [32]所提出，所代表的是化學結構上的鍵結與分 支，可將其量化的結果做為化合物的參數，此一參數並非物理或化學 性質，所以很容易利用演算法從結構式中取得。 5. 極性參數 (polarizability) 莫耳體積 (MV)、莫耳折射率 (MR) 及等張比容 (parachor；PA) 都為相關性之參數。

21

MV = MW/ ρ MW：分子量 ρ：密度 MR = MV× [n2-1/n2+2] n：折射係數

PA = MV × 1/4 ：表面張力

其中MR 被廣泛應用於QSAR，且與凡得瓦體積 ( van der waals volume)、等張比容有很好的相關性 (R=0.92 and 0.97)。 MR的計算是 經由極化性 (polarizability) 和一些基團的極性而來的，分子中極性的 部分愈大者，MR值就愈大。早期Kubinyi[33]認為在QSAR的迴歸方程 式中如果MR之係數為正，則表示取代基鍵結在極性表面;反之，如為 負值或是非線性關係則表示此鍵結的位置受到立體障礙或是一個限制 區域 (limit area)。

2.3.3 QSAR 在環境毒物學上的應用

QSAR是用來評估有機化合物毒性的工具之一，早期在QSAR的發展是 先將化合物進行分類的基礎上而建立的，亦即一個QSAR的模型只能預測 同類或具類似結構化合物的毒性。 Schultz et al. [34]認為，在毒性分析上 要建立有意義的QSAR模式，必頇將不同毒性機制的化合物加以分類。由 於QSAR無法在不同毒性機制下討論，因此在建立QSAR模式前需先將毒物 進行分類。Verharra et al.[35]首先根據毒性反應的模式來分類，其依據之標 準為毒性比例(Toxic Ratio； TR)。

毒性比例TR 的定義為：TR=ECx ( baseline ) / ECx ( experimental )，其

中ECx baseline為預測之基線毒性( baseline toxicity )，ECx , experimental為測

量之實驗值。

基線毒性可藉由QSAR來預測，而且通常以單一物化參數-log Kow來描

述，但是log Kow無法完整模擬生物薄膜的情況，所以在基線毒性中又分成

非極性 (non-polar) 和極性 (polar) 麻醉作用 (narcosis) 。當某種化合物之 毒性大於從QSAR預測非極性麻醉作用的5-10倍時，也就是5≦TR≦10，則 此化合物即被歸類為極性麻醉作用。反之，如某種化合物之TR≧10，則此 化合物即被歸類為反應性 (reactive) 或是特別反應(specifically acting)，且

當此化合物之pKa ≦6.5時，則該物質即屬於非耦合 (uncoupler) 之化合物 [36]。 Russom et al. [29]則將有機物分成圖2.3.3的毒性機制，可分為一般的 (General) 和特異的 (Specific) 兩大類型。一般性毒物是指麻醉作用在細胞 膜非特定的位置上；而特異性毒物有又可稱為反應性毒物，它會作用在細 胞的特定位置上或抑制特定的反應。

Fig 2.3.1 Classification of toxicity mechanism in aquatic toxicity tests[29]

一般性也就是麻醉性，主要可分為兩類：非極性、極性。非極性麻醉 性通常是較遲鈍的化合物，也可被稱作第一類化合物 ( class I compound ) 在QSAR分析上，與辛醇與水係數(log P)成良好線性關係，也可定義為基線 毒性 (baseline toxicity) 。 極性麻醉性之化合物通常比第一類化合物活潑， 包括了酚類與苯胺類等具有氫鍵給體(hydrogen bond donoracidity)特性的 化合物。

化合物的作用包括了極性麻醉效應 (polar narcosis)、非極性麻醉效應 (nonpolar narcosis)、磷酸呼吸非耦合(phosphoric acid respiratory uncouplers) 與親電性 (electrophilic) 或親核性 (nucleophilic) 物質等。所有的有機化合 物皆有能力產生麻醉效應，但此效應於低濃度中會被許多特異性機制的存 在而抵銷[37]。因此常被用於描述難分解化合物與細胞膜間非共價性的交 互作用 (interaction) ，其原因在於擾動了膜層(磷脂雙層)間脂質與蛋白質 的比例[38]，改變細胞膜脂質成份，進而產生毒性效應。

Hermen[39]將化學物質廣義分成四大類：Class I inert chemicals、Class II less inert chemicals、Class III reactive chemicals、Class IV specifically acting chemicals。

Lipnick[40]將反應性有機物分為四類 (表2.3.1)，分別為反應性親電型 毒性(Electrophilie toxicity)、反應性前親電型毒性 (Pro-electrophilie toxicity) 反 應 性 具 氰 基 型 毒 性 (Cyanogenic toxicity) 和 反 應 性 多 機 制 型 毒 性 (Multiple toxicity)。

23

Table 2.3.1 Classification of reactive mechanism [43]

1. Excess toxicity of electrophile nonelectrolytes

Nucleophilic substitution: allylic and propargylic activation Nucleophilic substitution: benzylic activated

Nucleophilic substitution: α-halo-(C＝X, C≡X)

Acid anhydrides

Strained three-membered heterocyclic ring Michael-type addition

Schiff base formation

2. Proelectrophile noneelectrolytes and excess toxicity

Alcohol dehydrogenase activation Monooxygenase activation

Glutathione transferase activation

3. Cyanogenic noneelectrolytes and excess toxicity

Cyanide release via cyanohydrin-like toxicant Cyanide release via monooxygenase activation

2.4



-不飽和醛類之 QSAR 研究

-不飽和醛類 QSAR 研究物種多樣，如 Schultz 於 2005 年[11]發表利

用纖毛蟲 ( Tetrahymena pyriformis ) 來研究-不飽和化合物之 QSAR，

其中包含了 14 種-不飽和醛類，其餘-不飽和化合物為酮類及酯類。

研究中表示-不飽和醛類利用親脂性參數 Log K_ow 及電性參數羰基上碳

與氧之間部份電荷差值 ( QC2-QO1 ) 來與纖毛蟲毒性數據進行回歸，如下所

示：

Log ( IGC₅₀-1 ) = 0.279 ( log K_ow ) -140.7 ( Q_C2 - Q_O1 ) + 70.3 n =14; r2= 0.868 Log ( IGC50-1 )：纖毛蟲毒性倒數後取對數；(單位：mM ) ； n : 樣品數 r2：相關性係數帄方 由以上回歸式可發現，親脂性參數 Log Kow及羰基上碳與氧之間部份 電荷差值( QC2-QO1 )此二項物化參數對於纖毛蟲毒性上回歸相關性佳 ( r2= 0.868 )，表示-不飽和醛類其毒性作用機制為毒物侵入纖毛蟲細胞膜產 生毒性以及醛類羰基( C=O )上反應性與纖毛蟲體內親核性物質作用產生 毒性。 另外 Yarbrough 與 Schultz 於 2007[41]發表了一篇有關於-不飽和化 合物對於替代型親核詴劑 ( 穀胱甘肽；GSH ) 之間反應性與纖毛蟲毒性上 之關係，於裡面 41 種化合中包含了 7 種-不飽和醛類，其回歸方程如下： Log ( IGC50-1 )：纖毛蟲毒性倒數後取對數；(單位：mM ) ； n : 樣品數 r2：相關性係數帄方 由以上回歸式可發現其親電性參數 ( Log RC50- 1 )對於含有不飽和鍵化 合物纖毛蟲毒性數據之間回歸相關性佳 ( r2 = 0.846 ) ，表示對於含有不飽 和鍵之化合物，其對於纖毛蟲毒性作用機制可能為不飽和鍵與纖毛蟲體內 親核性物質 ( 如穀胱甘肽；GSH ) 反應後，造成纖毛蟲毒性產生。

Log ( IGC₅₀-1 ) = 0.936 ( log RC₅₀- 1) +0.508 n = 41; r2= 0.846

25

除 了 纖 毛 蟲 研 究 外 ， Chan K. [7] 於 2008 年 利 用 老 鼠 肝 細 胞 毒 性 ( hepatocyte Toxicity )來研究-不飽和醛類之QSAR，其選用了11種

-不飽和醛類。利用硬親電性參數Log ( KNH2 )與老鼠肝細胞毒性回歸其回歸 方程如下： Log ( LC50 )：老鼠肝細胞毒性取對數；(單位：uM ) ； n : 樣品數 r2：相關性係數帄方 其中親電性參數 Log ( KNH2 ) 為測定醛類羰基( C=O )與替代型硬親核 詴劑 (丁胺；Butylamine ) 之間反應能力為二階反應速率常數 ( KNH2 ) ， 將其作用結果利用 Log ( KNH2 ) 表示；單位為 ( M −1 min−1 )。若此數值越 高表示其醛類越容易與生物體內硬親核詴劑作用產生希夫式鹼的形成 ( Schiff-base formation )，造成生物體致癌性、皮膚過敏性，肝細胞毒性和 致突變性等產生。 由以上回歸式可發現，硬親電性參數 Log ( KNH2 ) 與老鼠肝毒性數據 之相關性不差 ( r2 = 0.742 )，表示造成造成老鼠肝細胞毒性的作用機制，可 能為醛類羰基( C=O ) 與老鼠肝細胞作用產生希夫式鹼 ( Schiff-base )，使 得老鼠肝細胞產生病變。 -不飽和醛類 QSAR 廣泛研究於不同物種上 ( 如：纖毛蟲、或老鼠 肝細胞等 )，對於藻類毒性上的研究仍就缺乏，因此以密閉性藻類毒性實 驗研究 α,β-不飽和醛類之 QSAR，以溶氧變化量 ( △DO ) 及藻類細胞密

度 ( Final Yield ) 及藻類細胞生長率 ( Growth Rate ) 作為詴驗終點求得

各毒性物質之半致死濃度 ( EC50 )，可做為毒性資料庫之數據以利更完善

的評估。

Log ( LC₅₀ ) = 2.181 – 0.332 log K_NH2 n = 11; r2= 0.742

三、基本理論

3.1 毒性詴驗終點

藻類毒性詴驗終點可分為兩種：(一)利用含有藻類溶液的溶氧濃度變

化(Delta DO，ΔDO)，討論有機物毒性對藻類光合作用的影響 (二)利用藻 細胞顆粒數的變化，討論有機物毒性對藻類 growth rate 和 final yield 的影 響。以下說明各種抑制率的算法： 1. 以溶氧濃度變化為觀測終點時，毒物對藻類ΔDO 的抑制率算法： c t ΔDO ΔDO 1 = DO on rate Inhibition   ΔDOt：為有添加毒物的處理組藻類於四十八小時後的溶氧變化值 ΔDOc：為無添加毒物的控制組藻類於四十八小時後的溶氧變化值 2. 本研究進行藻類毒性詴驗初期的植種藻細胞數為 15000 cells/ml，因此 以藻細胞顆粒數的變化為觀測終點時，毒物對藻類 growth rate 的抑制 率算法：              15000 N ln 15000 N ln 1 = rate growth on rate Inhibition c t Nt：表示有添加毒物的處理組藻細胞顆粒數 Nc：表示無添加毒物的控制組藻細胞顆粒數 3. 本研究主要針對有機物毒性對藻類 final yield 的影響，在不同濃度下 有機物對藻類 final yield 的抑制率算法如下： 15000 15000 1 = rate growth on rate Inhibition    c t N N Nt:表示有添加毒物的處理組藻細胞顆粒數 Nc:表示無添加毒物的控制組藻細胞顆粒數

27

3.2 常用的單一毒性模式

受測詴生物受到毒性物質作用時，所受影響或死亡之百分率，會隨著 毒性物質濃度成 S 型曲線關係，稱為濃度反應關係，若已知毒物進入生物 體內的量，則可稱為劑量反應關係(Dose-response curve)，其中 x 軸為有機 物濃度，而 y 軸為反應百分比。在毒性詴驗過程中，受測生物受毒性影響 造成 50%抑制或死亡，則稱為 EC50 ( Effect Concentration 50% ) 或 LC50 ( Lethal Concentration 50%)。 生物體受毒性物質影響的劑量反應關係如圖 3.2.1 所示。虛線與實線 分別代表受測生物體 A 與 B 的劑量反應曲線，可以看出虛線的斜率大於 實線的斜率，表示生物體 A 對毒性物質的容忍範圍較小，亦說明了生物體 A 對毒物濃度的變化較敏感：微量的濃度變化即可導致抑制率的明顯改變 。而在抑制率為 0.5 處，延伸至兩曲線所對應的毒性物質濃度，即為毒性 物對生物體所造成的半至死濃度( EC50 )。

由於欲從原來數據直接求得 EC50 並不容易，通常必頇藉由數學關係 式將 S 型轉為以便求取，這也必頇藉由數學轉換模式以便求取，此種數學 轉換模式便稱為劑量反應關係模式， 一般常用的劑量反應關係模式分為 Probit、Weibull 與 Logit 三種，而表 3.2.1 針對 Weibull、Probit 與 Logit 三種模式的容忍度分布公式。下列為常用模式之解釋：

1. Probit：為最常用的劑量-反應(dose-response)模式，其假設生物對毒性 物質的容忍度分布為常態分布(Log-normal distribution)，因此以常態分 佈函數來表示毒物對生物抑制率 P 對毒物濃度(劑量)Z 的濃度(劑量)反 應曲線。在 Probit 轉換式中，毒性物質之 S 型濃度反應曲線先轉換成 NED(Normal Equivalent Deviation)scale 之直線，其中 50 %抑制率(P)對 應至 NED scale 上時為 0，而 84.1﹪則對應為 1，而 NED scale 的座標 值加上 5 即為 Probit 座標之概率單位 Y 值（Y＝NED + 5），當 Y＝5 時表示一半的測詴生物受到毒性物質抑制，此時對應的毒物濃度就是 EC50。Probit 單位與反應率與毒性物質劑量間之轉換關係如下： BlogZ A Y 

]

2

5

Y

0.5[1

P











 





erf

其中 Y 為 Probit 單位，A、B 為劑量-反應曲線之截距與斜率，Z 為 毒性物質劑量濃度（單位：mg/l），P 為測詴物種對毒性物質之反應率

（如死亡率等，單位：%），erf 為 error fuction。

2. Weibull：為機率-反應機制基礎 ( Mechanistic - Probability basis ) 模式 發展根據毒性物質分子與受測詴生物之受體分子間化學鍵關係所推演 而來，logit 模式相同皆假設毒性物質會在生物體內受體產生化反應。 3. Logit： 由人口成長研究所發展而出的另一種模式，描述毒性反應中

的某種酵素反應( Enzyme Reaction），適用於自催化( autocatalysis ) 之 化學反應