AMPK與eNOS基因多形性和耐力運動表現之關聯

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(1)國立台灣師範大學體育學系碩士學位論文. AMPK 與 eNOS 基因多形性和運動表現之關連. 研究生：陳怡廷指導教授：謝伸裕. 中華民國九十八年七月中華民國臺北市.

(2) i.

(3) ii.

(4) AMPK 與 eNOS 基因多形性和耐力運動表現之關聯 2009 年 7 月. 研究生：陳怡廷指導教授：謝伸裕. 摘要運動、缺氧或肌肉收縮會導致腺苷單磷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）活化而調控細胞代謝途徑之運作。AMPK 能透過磷酸化內皮型一氧化氮合成酶 (endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 產生一氧化氮 (nitric oxide, NO) 並經由下游路徑刺激葡萄糖吸收。AMPK 或 eNOS 基因變異也可能會影響能量代謝調控，但目前與運動方面的相關研究極少數。目的：探討耐力型運動員 PRKAA2 (rs857155)、eNOS G894T 與 eNOS intron 4 a/b 基因型分佈和一般民眾是否有差異。方法：採集國內 103 位曾獲得全國性比賽前三名之耐力型運動員（游泳、划船、自行車、足球、橄欖球、網球等種類）及 200 位一般民眾之血液 DNA 檢體，以聚合酶連鎖反應-限制片段長度多形性 (PCR-RFLP) 進行 PRKAA2 (rs857155) 基因型分析；eNOS intron 4 a/b 以聚合酶連鎖反應 (PCR) 進行基因型分析；eNOS G894T 以引子展延法 (primer extension) 於變性高效能液相層析系統 (denaturing high performance liquid chromatography) 進行基因型分析。最後以 SPSS 12.0 統計套裝軟體進行 χ2-test，統計顯著定為 α = .05。結果：網球及划船運動員帶有 PRKAA2 (rs857155) C 對偶基因者顯著高於對照組。eNOS intron 4 a/b 基因型及對偶基因分佈頻率在優秀耐力型運動員 (aa/ab/bb ＝ 2.9/26.2/70.9% ； a/b ＝ 16.0/84.0%) 與對照組間 (aa/ab/bb＝1.5/15.5/83.0%；a/b＝9.3/90.8%) 有顯著差異；男性優秀耐力型運動員與對照組之 eNOS intron 4 a/b 基因型及對偶基因分佈頻率亦有明顯差異；自行車及划船運動員帶有 eNOS intron 4 a 對偶基因者顯著高於對照組。eNOS intron 4 a/b 與 eNOS G894T 之間有連鎖不平衡存在，優秀耐力型運動員帶有 a 對偶基因 (aa+ab) 與 T 對偶基因 (GT+TT) 分佈頻率顯著高於對照組。結論：eNOS intron 4 a/b 基因多形性與耐力運動表現相關聯，可能是選拔優秀耐力型運動員的候選基因。關鍵詞：葡萄糖吸收、能量代謝. i.

(5) Association of AMPK and eNOS gene polymorphisms with endurance exercise performance July, 2009. Student：Yi-Ting Chen Advisor：Shen-Yu Hsieh. Abstract AMPK can be activated by exercise, muscle contraction and hypoxia to regulate various cellular metabolic pathways. AMPK is able to stimulate glucose uptake in skeletal muscle by phosphorylating eNOS and increase NO production. Also, genetic variants of AMPK and eNOS may affect metabolic regulation. However, there were little studies connect AMPK and eNOS to exercise performance. Purpose: To investigate the difference of PRKAA2 and eNOS gene polymorphism in elite endurance athletes and healthy control group. Methods: 103 endurance athletes (swimming, rowing, cycle, soccer, rugby, and tennis) who had won third place and above in national competitions were as the experimental group. The control group was 200 healthy people drawn from Taiwanese general population. The genotype of PRKAA2 (rs857155) was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP), the genotype of eNOS intron 4 a/b was determined by polymerase chain reaction (PCR), and the genotype of eNOS G894T was determined by primer extension with denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC). Data were analyzed with SPSS software version 12.0. χ2-test was employed to evaluate the difference (α= .05). Results: The frequency of the PRKAA2 (rs857155) C allele was significantly higher in tennis and rowing athletes as compared to the controls. The distribution of eNOS intron 4 a/b genotype and allele frequencies was significantly different between the athletes (aa/ab/bb = 2.9%/26.2%/70.9%; a/b = 16.0%/84.0%) and the controls (aa/ab/bb = 1.5%/15.5%/83.0%; a/b = 9.3%/90.8%), this phenomenon was also seen in male athletes. There was also a significant difference between the cycle athletes and the controls as well as the rowing athletes and the controls, with more tennis and rowing athletes carrying the a allele. Significant linkage disequilibrium was found between eNOS intron 4 a/b and eNOS G894T. The frequency of the a allele (aa+ab) and the T allele (GT+TT) combination was significantly higher in the athletes than in the controls. Conclusion: eNOS intron 4 a/b is associated with endurance exercise performance, and it might be a candidate gene for searching elite endurance athletes. Key words: glucose uptake, energy metabolism. ii.

(6) 謝誌在台師大體育所兩年的求學生涯中，備感艱難，在實驗過程中遇到許多壓力與挫折，尤其是碩二時為了將論文完成，常常在林口與台北兩地奔波，回到家已疲憊不堪。但幸運的是，我遇到許多的貴人，才能讓我順利走出困難。首先要感謝我的指導老師-謝伸裕教授，在百忙之中仍不辭辛勞地悉心指導，並給予我莫大的發揮空間及支持，培養我獨立思考的能力。在研究期間也承蒙實驗室諸多學長、學姐照顧，尤其感謝麗玲學姐在實驗技術的指導，及實驗室的同窗柏帆、俊義總是給予我協助。感謝口試委員謝玲玲教授、謝錦城教授於論文審查，撥空悉心斧正，提供許多寶貴的意見。最後要感謝一直栽培我的父母，在這兩年來全力的支持我。謝謝在我身邊的家人與朋友，因為有你們我才能順利畢業，謝謝大家!. 怡廷 2009 年 7 月 30 日. iii.

(7) 目次中文摘要 ................................................................................................................................................ і 英文摘要 ................................................................................................................................................ і і 謝誌 ........................................................................................................................................................і і і 目次 ........................................................................................................................................... іv 表次 ........................................................................................................................................... vі 圖次 .......................................................................................................................................... vіі. 第壹章緒論 .......................................................................................................................... 1 一、問題背景 ........................................................................................................................ 1 二、研究目的 ........................................................................................................................ 3 三、研究假設 ........................................................................................................................ 3 四、名詞操作性定義 ............................................................................................................ 4 五、研究範圍 ........................................................................................................................ 4 六、研究限制 ........................................................................................................................ 4 七、研究的重要性 ................................................................................................................ 4. 第貳章相關文獻探討 ....................................................................................................... 5 一、AMPK 之分子結構與活化機制 ................................................................................... 5 二、NOS ................................................................................................................................ 6 三、AMPK 與 eNOS 之醣類代謝調控 ................................................................................ 7 四、AMPK 與 eNOS 基因多形性之相關研究 .................................................................. 10 五、本章總結 ...................................................................................................................... 13. 第参章研究方法與步驟 ................................................................................................. 14 一、受試對象 ...................................................................................................................... 14 二、實驗設計與研究變項 .................................................................................................. 15 iv.

(8) 三、實驗流程 ...................................................................................................................... 16 四、實驗方法與步驟 .......................................................................................................... 17 五、實驗儀器 ...................................................................................................................... 25 六、統計分析 ...................................................................................................................... 25. 第肆章結果 ........................................................................................................................ 26 一、PRKAA2 (rs857155) 基因多形性之分佈 .................................................................. 26 二、eNOS G894T 基因多形性之分佈 ............................................................................... 30 三、eNOS intron 4 a/b 基因多形性之分佈 ........................................................................ 33 四、PRKAA2 與 eNOS 基因多形性之合併分析.............................................................. 37. 第伍章討論與結論 .......................................................................................................... 40 一、PRKAA2 (rs857155) 基因多形性與運動表現 .......................................................... 40 二、eNOS intron 4a/b 基因多形性與運動表現 ................................................................. 42 三、eNOS G894T 基因多形性與運動表現 ....................................................................... 45 四、結論 ............................................................................................................................ 47. 參考文獻 ............................................................................................................................... 48 中文部份 .............................................................................................................................. 48 英文部分 .............................................................................................................................. 48. 附錄一、受試者告知同意書 .......................................................................................... 56 個人小傳 ............................................................................................................................... 58. v.

(9) 表次表 3-1、耐力型運動項目及人數統計.................................................................................... 14 表 3-2、PRKAA2 基因型判斷 .............................................................................................. 19 表 3-3、PCR 增幅的基因、基因多形性及其位置、引子序列、反應條件及產物的大小 20 表 3-4、eNOS intron 4 a/b 基因型判斷 ................................................................................. 24 表 4-1、運動員和對照組之 PRKAA2 (rs857155) 基因型與對偶基因分佈 ...................... 27 表 4-2、對照組 PRKAA2 (rs857155) 基因多形性之哈溫平衡檢定 .................................. 28 表 4-3、不同性別之 PRKAA2 (rs857155) 基因型與對偶基因分佈 .................................. 28 表 4-4、不同運動種類之 PRKAA2 (rs857155) 基因型與對偶基因分佈 .......................... 29 表 4-5、運動員和對照組之 eNOS G894T 基因型與對偶基因分佈 ................................... 30 表 4-6、對照組 eNOS G894T 基因多形性之哈溫平衡檢定 ............................................... 31 表 4-7、不同性別之 eNOS G894T 基因型與對偶基因分佈 ............................................... 31 表 4-8、不同運動種類之 eNOS G894T 基因型與對偶基因分佈 ...................................... 32 表 4-9、運動員和對照組之 eNOS intron 4a/b 基因型與對偶基因分佈 ............................. 34 表 4-10、對照組 eNOS intron 4 a/b 基因多形性之哈溫平衡檢定 ...................................... 34 表 4-11、不同性別之 eNOS intron 4 a/b 基因型與對偶基因分佈 ...................................... 35 表 4-12、不同運動種類之 eNOS intron 4 a/b 基因型與對偶基因分佈 .............................. 36 表 4-13、eNOS G894T 與 eNOS intron 4 a/b 基因型之合併分析 ....................................... 37 表 4-14、eNOS intron 4 a/b 與 eNOS G894T 之單體型分析 ............................................. 38 表 4-15、PRKAA2 (rs857155)與 eNOS intron 4 a/b 基因型之合併分析 ............................ 38 表 4-16、PRKAA2 (rs857155) 與 eNOS G894T 基因型之合併分析 ................................. 39 表 5-1、各種族 PRKAA2 (rs857155) 基因多形性分佈情形 .............................................. 40 表 5-2、各種族 eNOS intron 4 a/b 基因多形性分佈情形 .................................................... 42 表 5-3、各種族 eNOS G894T 基因多形性分佈情形 ........................................................... 45. vi.

(10) 圖次圖 3-1、實驗流程圖................................................................................................................ 16 圖 3-2、梯度控溫聚合酶連鎖反應器.................................................................................... 25 圖 3-3、高速離心機................................................................................................................ 25 圖 4-1、PRKAA2 ( rs857155) 基因型判定之電泳分析結果 .............................................. 26 圖 4-2、eNOS intron4a/b 基因型判定之電泳分析結果 ....................................................... 33. vii.

(11) 1. 第壹章緒論一、問題背景自從人類基因序列解碼後，關於人類「健康」與「疾病」相關基因之研究已成為生物醫學領域的熱門課題。在人類基因體序列與其功能性的發現中，不禁讓人聯想到運動場上那些表現優異的運動選手，是否先天就具有運動員的優良基因。運動能力除受後天環境的影響，基因遺傳確實決定運動員的體型、生理及生化機能等特徵 (Wolfarth 等，2005)。過去運動科學家即詴圖找出影響運動表現的因子，但早期的研究方向多集中於肌肉型態、血液指標等。隨著科技的進步以及技術的精進，運動科學逐漸朝基因的層次發展。然而，目前基因與運動表現之間的關係仍未非常清楚 (Rankinen等，2006)，因此，需要更多研究者投入相關研究。在耐力運動中，人體需要大量的能量提供肌肉收縮，能量代謝的來源以醣類及脂肪為主，然而肌肉葡萄糖吸收 (uptake) 必須透過細胞膜上的葡萄糖運輸蛋白（glucose transporter, GLUT）協助運送，而骨骼肌中最主要的是 GLUT4 蛋白（Ai, Ralston, Lauritzen, Galbo, & Ploug, 2003）。腺苷單磷酸活化蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase, AMPK) 為細胞能量狀態的感應者 (energy sensor)。研究發現 AMPK 在運動時能立即調控細胞代謝途徑，如促進葡萄糖吸收 (Hayashi, Hirshman, Kurth, Winder, & Goodyear, 1998)、增加脂肪酸氧化 (Merrill, Kurth, Hardie, & Winder, 1997).

(12) 2. 及抑制生物合成反應 (Corton, Gillespie, & Hardie, 1994; Carling & Hardie, 1989)，而在長期運動訓練之適應效應中能加強代謝相關蛋白的基因表現 (Holmes, Sparling, Olson, Winder, & Dohm, 2005)，因此，AMPK 在調節體內能量平衡有著關鍵的作用。一氧化氮 (nitric oxide, NO) 為一訊息傳導分子，其在心血管、神經、免疫、呼吸與消化系統等具有重要的調節功能。內生性 NO 的合成主要由 L-精胺酸 (L-arginine) 經一氧化氮合成酶 (nitric oxide synthase, NOS) 催化，轉變為 L-瓜胺酸 (L-citrulline) 並釋出 NO (Furchgott, & Zawadzki, 1980)。研究發現內皮型 NOS (endothelial NOS, eNOS) 與 AMPK 刺激肌肉之醣類吸收有關 (Roberts, Barnard, Scheck, & Balon, 1999)，且 eNOS 活性受 eNOS 基因多形性的影響 (Yoon, Song, Hong, & Kim, 2000)。目前已有研究發現 AMPK 基因變異可能會增加罹患第二型糖尿病的風險 (Xu 等，2005)，而 eNOS 基因多形性 (polymorphism) 也被發現與胰島素阻抗及第二型糖尿病有關 (Saunders 等，2006; Galanakis 等，2008)，因此，AMPK 及 eNOS 基因變異可能會影響能量代謝調控。對於運動員而言，醣類代謝的調控關係著比賽中是否有充足的能量供應以發揮潛能，而臺灣地區的優秀運動員是否先天即具有較佳的調控能力，仍有待研究證明，故本研究以優秀耐力型運動員及一般群眾為研究對象，探討 AMPK α2 （PRKAA2）與 eNOS 基因多形性和運動表現之關聯性。.

(13) 3. 二、研究目的（一）探討優秀耐力型運動員 PRKAA2 基因型分佈與一般民眾是否有差異。（二）探討優秀耐力型運動員 eNOS 基因型分佈與一般民眾是否有差異。. 三、研究假設（一）耐力型運動員 PRKAA2 基因型分佈與一般民眾有顯著差異，導致他們在耐力表現上佔有先天的優勢。（二）耐力型運動員 eNOS 基因型分佈與一般民眾有顯著差異，導致他們在耐力表現上佔有先天的優勢。. 四、名詞操作性定義本研究的耐力型運動員為游泳（800-1500m）、自行車（公路賽）、划船、足球、網球、橄欖球等種類，並以在全國性比賽包括全國運動會、全國中等學校運動會、全國錦標賽及代表台灣參與國際競賽獲得前三名者定義為優秀運動員。本研究的耐力型運動種類參考 Petersburg 等 (2007) 之分類，其研究依據能量消耗、週期 (cyclic) 或非週期性 (acyclic) 運動、運動特性（耐力、速度、敏捷、肌力）及運動強度（高、中、低）分為七個類別。.

(14) 4. 五、研究的範圍本研究對象為台灣地區的耐力型運動員及一般民眾. 六、研究限制由於運動員招募不易，因此本研究採用多種耐力型運動種類（游泳、自行車、划船、足球、橄欖球、網球）。. 七、研究的重要性（一）提供運動員在運動種類之選擇或型態上的建議。（二）作為國家培育優秀運動員之選才參考。.

(15) 5. 第貳章相關文獻探討本章主要分為下列四大部分進行探討：一、AMPK 之分子結構與活化機制；二、NOS；三、AMPK 與 eNOS 之醣類代謝調控；四、AMPK 與 eNOS 基因多形性之相關研究；五、本章總結。. 一、AMPK 之結構與活化機制 AMPK 是一種異三聚體蛋白 (heterotrimeric protein)，由 α、β、γ 三種次單位 (subunit) 所構成 (Rutter, Da Silva Xavier, & Leclerc, 2003)。α 次單位具有特殊的磷酸化位置 (Thr172) 及催化活性；β 次單位作為支架維持整個複合體的穩定度，並提供與 α、γ 次單位的鍵結位置(Aschenbach, Sakamoto, & Goodyear, 2004)；γ 次單位具有與 AMP 或 ATP 鍵結的功能 (Scott 等， 2004)。而這些次單位存有不同的異構物 (isoform)，如 α1、α2、β1、β2、γ1、 γ2 和 γ3 (Corton, Gillespie, Hawley, & Hardie, 1995)。當運動、缺氧或肌肉收縮等代謝壓力(metabolic stress) 導致細胞內 ATP 加速消耗或 ATP 產生受抑制時，會造成 AMP：ATP 比率提高而活化 AMPK (Hardie & Hawley, 2001)。AMPK 的活化可啟動分解代謝途徑，如葡萄糖吸收 (Hayashi 等，1998) 和脂肪酸氧化 (Merrill 等，1997)，增加 ATP 的產生；同時關閉合成代謝途徑，如脂肪酸合成 (Corton 等，1994)、肝醣合成 (Carling 等，1989)，減少 ATP 的消耗，以維持細胞內的能量平衡。其活化反應主要透過下列機制產生：.

(16) 6. 當 AMP 與 AMPK 鍵結後，AMP 會對 AMPK 產生異位調節活化 (allosteric activation)，其活化程度約可提高五倍 (Hardie, 2004)；其次，AMP 與 AMPK 的鍵結會改變 AMPK 的分子結構，有助於提升上游分子（LKB1 複合體）對 AMPK （α 次單位活化區 Thr172）的磷酸化，此活化程度可提高 100 倍以上 (Hawley 等，1996)；同時，AMP 可抑制蛋白磷酸酶 (protein phosphatase) 對 Thr172 的去磷酸化作用 (Davies, Helps, Cohen, & Hardie, 1995)。. 二、NOS 在哺乳類動物體內已發現三種不同形式的 NOS，包括神經型 NOS (neuronal NOS, nNOS)、誘發型 NOS (inducible NOS, iNOS) 及內皮型 NOS (endothelial NOS, eNOS) (Forstermann 等，1991)。iNOS 存在於多種細胞中，會被發炎反應產生的細胞素及其他毒素刺激而誘導其表現，進而產生大量 NO 達到細胞毒殺的作用 (Nathan & Hibbs, 1991)。nNOS 位於神經細胞中，其所產生的 NO 具有神經訊息傳導 (neurotransmission) 的功能。eNOS 存在於內皮細胞中，能產生微量的 NO 促使血管平滑肌舒張 (Ignarro, 1989)。 nNOS 與 eNOS 屬於持續表現型 (constitutively expressed) 的酵素，受鈣離子 (Ca2+) 濃度所調控 (Michel & Feron, 1997)。.

(17) 7. 三、AMPK、eNOS 與醣類代謝調控骨骼肌吸收葡萄糖可透過兩條訊息傳遞路徑驅動：一是胰島素訊息傳遞路徑；二是肌肉收縮誘發的非胰島素訊息傳遞路徑。研究指出 AMPK 為非胰島素訊息傳遞路徑中重要的訊息分子。Merrill 等 (1997) 將老鼠後肢浸泡於含有 AICAR（AMPK 活化劑）的溶液中，發現 AMPK 活性顯著提升，且葡萄糖吸收明顯增加。在骨骼肌離體收縮實驗也有類似發現，Hayashi 等 (1998) 給予離體肌肉電刺激收縮後，同樣顯示 AMPK 活性及葡萄糖吸收能力顯著提高。此外，在基因轉殖 (transgenic) 的研究中，發現 kinase-dead AMPK α2、AMPK α2 knockout 或 AMPK γ3 knockout 基因轉殖鼠之離體肌肉在給予 AICAR 處理後，肌肉中 GLUT4 蛋白轉位 (translocation) 與葡萄糖吸收幾乎完全被抑制 (Mu, Brozinick, Valladares, Bucan, & Birnbaum, 2001; Jorgensen 等，2004; Barnes 等，2004)。由此顯示 AMPK 在肌肉收縮刺激骨骼肌葡萄糖吸收中扮演相當重要的角色。肌肉收縮可大幅提高 eNOS 活性，進而增加 NO 合成 (Roberts, Barnar, Jasman, & Balon, 1999)。NO 具有舒張血管的功能，有助於加速血流代謝運動所產生之疲勞物質。研究發現骨骼肌 NO 的產生可調控 GLUT4 蛋白轉位促進肌肉組織吸收葡萄糖 (Roberts 等，1999)。Balon and Nadler (1997) 以 NO 產生劑 (NO donor) 處理老鼠之離體肌肉後，發現肌肉葡萄糖的運輸呈現劑量依賴性（dose-dependent）增加，且以 L-NMMA (NOS 抑制劑) 處理.

(18) 8. 後會顯著降低收縮刺激導致的葡萄糖吸收效應。此外，研究亦發現 L-NAME (NOS 抑制劑) 會完全抑制運動刺激 GLUT4 蛋白轉位 (Roberts, Barnard, Scheck, & Balon, 1997)。然而，運動促進肌肉組織吸收葡萄糖，是否能透過血液灌流量增加而提高葡萄糖吸收能力，目前研究結果仍不一致。Bradley, Kingwell, and McConell (1999) 以 7 名健康男性為研究對象，進行 30 分鐘的仰臥踏車運動，於運動中分別注入 L-NMMA 與安慰劑，比較血流速度與葡萄糖吸收能力（動靜脈間血糖濃度差×血流速度），結果顯示 L-NMMA 導致葡萄糖吸收能力下降 48%，但對於下肢血流速度並無影響。Hickner, Fisher, Ehsani, and Kohrt (1997) 在受詴者進行單腳踏車運動時注入 L-NMMA，發現 L-NMMA 會導致運動時股外側肌局部的血流速度下降。 NO 可經由活化鳥嘌呤核苷酸環化酶 (soluble guanylate cyclase, SGC)，催化鳥嘌呤核苷三磷酸鹽 (guanosine triphosphate, GTP) 轉變為環鳥嘌呤核苷單磷酸鹽 (cyclic guanosine monophospate, cGMP) (Denninger & Marletta, 1999)。研究發現NO可經由上述機制促使cGMP含量增加，進而活化PKG蛋白 (cGMP-dependent protein kinase) 刺激葡萄糖吸收。Young, Radda, and Leighton (1997) 以NO產生劑處理離體肌肉後，發現cGMP含量與葡萄糖氧化顯著提高，但加入LY-83583 (sGC 抑制劑) 後會顯著降低上述效應。許多研究顯示 AMPK 活化後會透過啟動 eNOS /NO 訊息路徑刺激葡萄.

(19) 9. 糖吸收。AMPK 能促使 eNOS 活化位置 Ser1177 磷酸化，且降低抑制部位 Thr495 磷酸化，進而提高 eNOS 活性及 NO 合成 (Chen 等，1999; Nagata, Mogi & Walsh, 2003)。Fryer 等 (2000) 將老鼠肌細胞置於含 AICAR 的培養液中，發現 AICAR 可提高 eNOS 活性及肌細胞的葡萄糖運輸，且以 L-NAME 或 LY-83583 處理後，AICAR 刺激葡萄糖吸收效應完全被抑制。Shearer 等 (2004) 給予活體老鼠 L-NAME 也發現 AICAR 刺激肌肉吸收葡萄糖能力被抑制。此外，Li 等 (2004) 將老鼠之離體心肌以 AICAR 處理後，結果發現 eNOS 磷酸化顯著提高，且給予 NO 產生劑或 cGMP 類似物 (analog) 處理後，葡萄糖吸收及 GLUT4 蛋白轉位顯著增加，但加入 L-NAME 或 LY-83583 處則會顯著降低上述效應。由上述的研究結果顯示 AMPK 能透過磷酸化 eNOS 產生 NO，經由下游的 cGMP 路徑調控葡萄糖吸收。.

(20) 10. 四、AMPK、eNOS 基因多形性之相關研究（一）AMPK 基因多形性由於 AMPK 能調節體內能量代謝平衡，且其表現對於醣類代謝有著關鍵的作用，因此，許多研究探討 AMPK 基因變異與糖尿病之關聯。Xu 等 (2005) 以 345 名肥胖患者（部分患有第二型糖尿病）及 20 名健康成人為研究對象，發現 AMPK γ2（PRKAG2）基因變異可能會影響葡萄糖及脂肪代謝。 PRKAA2 全長 63102 bp，由九個表現序列 (exon) 和 8 個插入序列 (intron) 構成。Horikoshi 等 (2006) 發現 PRKAA2 其中一個單核苷酸多形性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 位點 rs2051040 的對偶基因 A（突變型）與其它 SNPs 對偶基因所組成的單體型（AGTAAT）和第二型糖尿病相關聯，且對照組中帶有 rs2051040 對偶基因 A 者其胰島素阻抗顯著高於未帶有 rs2051040 對偶基因 A 者。而汪茂榮等（2007）探討 PRKAA2 多形性位點 rs857155 與中國重慶地區人群第二型糖尿病之關聯，發現 C 對偶基因（突變型）分佈頻率在病例組與對照組間雖未有顯著差異，但卻發現 C 對偶基因分佈頻率在病例組似乎有較高的傾向。 Costford 等 (2007) 針對 761 名肥胖者及 759 精瘦體型者的 AMPK γ3 （PRKAG3）基因進行定序，發現一個 R225W 基因位點突變，其中帶有 R225W 基因突變者的 AMPK 活性超過未帶有 R225W 基因突變者兩倍，肌.

(21) 11. 肝醣含量顯著高於 90%，肌肉三酸甘油脂濃度顯著低於 30%。此外，受詴者在血糖、血脂及糖化血色素（HbA1c）皆顯示正常，表示此突變所造成的肌肝醣含量增加並未導致功能性的損害。. (二) eNOS 基因多形性 eNOS基因位於第七對染色體長臂35-36，包含26個表現序列 (exon) 和 25個插入序列 (intron)，大小約21 kb (Naduad, Bonnardeaux, Lathrop, & Soubrier, 1994)。eNOS基因的變異可能導致eNOS結構或活性改變，進而影響NO合成 (Wang 等，1997; Yoon 等，2000 )。 eNOS 基因 intron 4 中存在一個 27 bp 變異數目重覆序列 (variable number tandem repeat, VNTR) 的多形性 (Wang 等)，27 bp 為 GAAGT CTAGA CCTGC TGC（A/G）G GGGTG AG。大的 eNOS 4b 基因型為 5 個連續 27 bp 重複序列，前 3 個重複序列的第 19 個核苷酸為 A，後 2 個重複序列的第 19 個核苷酸為 G；小的 eNOS 4a 基因型為 4 個連續 27 bp 重複序列，前 2 個重複序列的第 19 個核苷酸為 A，後 2 個重複序列的第 19 個核苷酸為 G。Galanakis 等 (2008) 指出 intron 4 a/b 基因多形性與第一型糖尿病和第二型糖尿病有關聯性，其研究發現第一型和第二型糖尿病患者帶有突變型對偶基因 a 的比率顯著高於非糖尿病患者，而且，第一型糖尿病患者基因型為 aa 或 ab 的比率也顯著高於非糖尿病患者。.

(22) 12. eNOS G894T 基因多形性位於 exon 7，其中 cDNA 894 的位置由鳥糞嘌呤 (guanine) 變成胸腺嘧啶 (thymine)，使轉譯後第 298 個胺基酸由麩胺酸 (glutamate) 變成天冬胺酸 (aspartate)，即 G→A。Tso 等 (2006) 指出 G894T 基因多形性與高血糖有關，其研究針對 256 名具有葡萄糖耐受不良 (impaired glucose tolerance, IGT) 者進行五年的血糖追蹤，結果顯示有 39.9% 受詴者仍具有葡萄糖耐受不良現象，19.9%受詴者發展為糖尿病，且這群受詴者中帶有 T 對偶基因者相較於 GG 基因型者，有較高的風險罹患高血糖。此外，Saunders 等 (2006) 的研究發現 eNOS 基因多形性與運動表現可能有關，其研究以 443 名鐵人三項運動員及 203 名健康成人為研究對象，發現 GG 基因型運動員的成績等級分配呈現顯著的線性相關，且 GG 基因型者在競賽中所花費的時間顯著高於 GT 或 TT 基因型者。.

(23) 13. 五、本章總結（一）運動或肌肉收縮會導致 AMPK 活化進而啟動 eNOS /NO 訊息路徑刺激葡萄糖吸收，有助於提供肌肉運作所需的能量。（二）AMPK、eNOS 基因變異可能會影響非運動狀態能量代謝的調控，導致胰島素阻抗及第二型糖尿病發生。（三）eNOS 基因多形性與運動表現可能有關，在 G894T 基因多形性中，帶有 T 對偶基因者似乎有較好的耐力運動表現。.

(24) 14. 第參章研究方法與步驟本章將分為下列五大部份：一、受詴對象；二、實驗設計與研究變項；三、實驗流程；四、實驗方法與步驟；五、實驗儀器；六、統計分析。一、受詴對象本研究收集 103 位（男性 46 人、女性 57 人）曾參加全國性比賽前三名的耐力型運動員，專項包含游泳（800-1500m）、自行車（公路賽）、划船、足球、橄欖球、網球等種類 (表 3-1)；對照組為臺灣各地區一般民眾 200 人（男 111 位、女 72 位），這些一般民眾都不是選手，但不確定是否有運動習慣。由於有 17 位對照組性別資料不全，因此以 183 位對照組進行男女性別分層分析。所有受詴對象在說明研究內容後，填寫受詴者告知同意書，同時同意 10 ml 血液的收集。. 表 3-1 耐力型運動種類及人數統計項目. 男性人數. 女性人數. 游泳(800-1500m) 自行車. 4 11. 6 5. 划船. 7. 10. 足球橄欖球網球. 0 17 7. 31 0 5. 總人數. 46. 57.

(25) 15. 二、實驗設計與研究變項本研究的實驗組為曾獲得全國性比賽前三名之耐力型運動員；對照組為一般民眾。以下為研究變項：自變項為優秀耐力型運動員群與一般族群；依變項為各項測詴基因之分佈頻率。.

(26) 16. 三、實驗流程優秀耐力運動員招募 (游泳、划船、足球、自行車、橄欖球、網球). 填寫受詴者告知同意書. 進行抽血. 萃取 DNA. 對照組 200 位(臺灣基因多形性分析各地區一般民眾). 統計分析圖 3-1 實驗流程圖.

(27) 17. 四、實驗方法與步驟（一）採血抽取受詴者血液檢體 8~10 ml，並置入離心管內上下搖晃均勻，以 3000 rpm 的轉速離心 5 分鐘，自受詴者血液檢體中分離出白血球。. （二）DNA 萃取 1. 由－80℃冷凍庫取出檢體後，加入蛋白質分解酵素 K (proteinase K) 30 μl，混合均勻後置入 37℃培養箱作用 24 小時。 2. 加入酚溶液 (phenol) 500 μl，震盪均勻後在室溫下以 10000 rpm 的轉速離心 15 分鐘。 3. 取上清液至另一 1.5 ml 的微離心管，加入氯仿溶液 (chloroform：Isoamyl alcohol＝24：1) 500 μl 混合均勻，在室溫下以 10000 rpm 的轉速離心 15 分鐘。 4. 取上清液至另一 1.5 ml 的微離心管，加入 1 ml 之 100%酒精均勻搖動至白色絲狀物出現後，置於－20℃冰箱 24 小時待 DNA 沉澱。 5. 在 4℃下以 10000 rpm 離心 10 分鐘。 6. 倒掉上清液後，加入 500 μl 之 75%酒精清洗沉澱物。 7. 倒掉上清液後，將 DNA 沉澱物放入真空乾燥箱內烘乾。 8. 加入適量的 TE buffer 待 DNA 完全溶解後，利用分光光度計 (spectrophotometer) 定量 DNA 濃度。.

(28) 18. （三）基因型分析 1. PRKAA2 基因型分析（1）聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) PCR 反應物所需的溶液如下：溶液. 體積. DNA (100 ng) 10×PCR buffer primer a (50ng) primer b (50ng) dNTP (200μM) Taq polymerase (1U) ddH2O. 0.2 μl 2.5 μl 0.05 μl 0.05 μl 2 μl 0.2 μl 20 μl. 總體積. 25μl. 最後將上述製備好的反應溶液放入 PCR 機器中進行反應，其引子序列、反應條件詳見表 3-3。.

(29) 19. （2）限制片段長度多形性 (restriction fragment length polymorphism, RFLP) 離心管反應物包含：溶液. 體積. PCR 產物. 25 μl. 10×buffer 100×BSA. 2.5 μl 0.25 μl. 限制酶 (TagⅠ). 0.5 μl. ddH2O. 21.75 μl. 總體積. 50 μl. 將上述製備好的反應溶液，在 65℃下作用 24 小時，反應完之產物以 6%聚丙烯醯胺膠進行電泳分析，並用溴化乙錠 (ethidium bromide) 染色，然後以自動膠體照相分析系統 (auto gel catcher) 拍照，進行基因型的判斷（表 3-2）。. 表 3-2 PRKAA2 基因型判斷基因型. 電泳結果. AA. 120 and 350 bp. AC. 120, 350 and 470 bp. CC. 470 bp.

(30) 20. 表 3-3 PCR 增幅的基因、基因多形性及其位置、引子序列、反應條件及產物的大小基因. 基因多形性. 引子序列 (5’→3’). 及位置 PRKAA2. eNOS. eNOS. rs857155 intron 6. G894T exon 7. intron 4 a/b intron 4. F : TGCACAGAGCAGATGTGAAATA R : CCATGAAAGTGAAGCTCAGAAA. F : AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA R : CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA. F : AGGCCCTATGGTAGTGCCTTT R : TCTCTTAGTGCTGTGGTCAC. 註：F : forward primer; R : reverse primer. PCR 反應溫度. 時間. 1. 95°C 2. 95°C 3. 60°C 4. 72°C 5. 72°C. 5’ 1’ 30” 40” 5’. 1. 95°C 2 .95°C 3. 59°C 4. 72°C 5. 72°C. 5’ 1’ 30” 40” 5’. 1. 95°C 2. 95°C 3. 58°C 4. 72°C 5. 72°C. 5’ 1’ 30” 50” 5’. 產物大小主要循環. (base pair) 470. 35. 248. 35. 4a:393 4b:420 40.

(31) 21. 2. eNOS G894T 基因型分析（1）聚合酶連鎖反應 PCR 反應物所需的溶液如下：溶液 DNA (100 ng) 10×PCR buffer primer a (50ng) primer b (50ng) dNTP (200μM) Taq polymerase (1U) ddH2O 總體積. 體積 0.2 μl 2.5 μl 0.025 μl 0.025 μl 2 μl 0.2 μl 20.05 μl 25μl. 最後將上述製備好的反應溶液放入 PCR 機器中進行反應，其引子序列、反應條件詳見表 3-3。.

(32) 22. （2）純化 PCR 產物利用 DNA 片段純化詴劑組純化 PCR 產物（Geneaid）。 a. 樣本置備 (sample preparation) 將 PCR 產物加入五倍等體積的 DF buffer，並震盪混合均勻。 b. DNA 結合 (DNA binding) （a）將 DF 純化管放置於離心收集管上。（b）吸取 DNA 混合液至 DF 純化管中。（c）將收集管置入離心機中，以 8000 rpm 的速度離心 30 秒。（d）倒掉收集管所離心下來的溶液，並將 DF 純化管置回收集管上。 c. 沖洗 (wash) （a）加入 500 μl 沖洗緩衝液至 DF 純化管。（b）將收集管置入離心機中，以 8000 rpm 的速度離心 30 秒。（c）倒掉收集管所離心下來的溶液，並將 DF 純化管置回收集管上。（d）再將收集管全速離心 2 分鐘。（e）將 DF 純化管置於烘箱內 30 秒左右，以烘乾 DF 純化管內的過濾紙。.

(33) 23. d. DNA 洗脫 (DNA elution) （a）將烘乾的 DF 純化管置於新的離心收集管上。（b）加入 30 μl 的洗脫緩衝液於 DF 純化管的過濾紙中央（c）待 2-3 分鐘將收集管以全速離心 2 分鐘（d）收集離心下來的 DNA. （3）引子展延法 (primer extension) 所需的反應溶液如下：溶液 purified PCR reaction buffer dNTP Primer thermo sequence DNA polymerase ddH2O 總體積. 體積 5 μl 2 μl 1 μl 0.05 μl 0.5 μl 11.45 μl 20 μl. 將上述製備好的反應溶液放入 PCR 機器中進行反應。最後將反應完成之產物利用變性高效能液相層析系統 (denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC) 進行分析。.

(34) 24. 3. eNOS intron 4 a/b 基因型分析（1）聚合酶連鎖反應 PCR 反應物所需的溶液如下：溶液. 體積. DNA (100 ng) 10×PCR buffer primer a (50ng) primer b (50ng) dNTP (200μM) Taq polymerase (1U) ddH2O. 0.2 μl 2.5 μl 0.05 μl 0.05 μl 2 μl 0.2 μl 20 μl 25μl. 總體積. 最後將上述製備好的反應溶液放入 PCR 機器中進行反應，其引子序列、反應條件詳見表 3-3。PCR 產物以 8%聚丙烯醯胺膠進行電泳分析，並用溴化乙錠 (ethidium bromide) 染色，然後以自動膠體照相分析系統 (auto gel catcher) 拍照，進行基因型的判斷（表 3-4）。. 表 3-4 eNOS intron 4 a/b 基因型判斷基因型. 電泳結果. bb. 393 bp. ab. 393 and 420 bp. aa. 420 bp.

(35) 25. 四、實驗儀器 1.梯度控溫聚合酶連鎖反應器：Eppendorf Mastercycler gradient. 圖3-2 梯度控溫聚合酶連鎖反應器 2.高速離心機：Eppendorf Centrifuge 5415C. 圖3-3 高速離心機. 五、統計分析利用 SPSS 12.0 統計套裝軟體進行資料彙整與統計分析。以 χ2-test 檢定法進行相關的統計顯著性檢定，同時設 α = .05 為顯著水準。.

(36) 26. 第肆章結果本研究之實驗結果，分為五個部分加以說明：一、PRKAA2 (rs857155) 基因多形性之分佈；二、eNOS G894T 基因多形性之分佈；三、eNOS intron 4 a/b 基因多形性之分佈；四、PRKAA2 與 eNOS 基因多形性之合併分析。. 一、PRKAA2 (rs857155) 基因多形性之分佈. PRKAA2 多形性位點 rs857155 的 PCR 擴增產物長 470 bp，經 TagⅠ限制酶作用切成兩個片段，分別為 120 bp 和 350 bp，可產生三種基因型：AA 型、AC 型和 CC 型（圖 4-1）。. 圖 4-1 PRKAA2 ( rs857155) 基因型判定之電泳分析結果.

(37) 27. 優秀耐力型運動員與對照組之 PRKAA2 多形性位點 rs857155 基因型及對偶基因分佈如表 4-1。對照組中 AA、AC 及 CC 基因型的分佈頻率分別為 34.5%、49.5%及 16.0%，符合遺傳平衡的哈溫定律 (Hardy-Weinberg law)（表 4-2），而在優秀耐力型運動員中 AA、AC 及 CC 基因型分佈頻率分別為 28.2%、55.3%及 16.5%，統計結果顯示兩組在 PRKAA2 多形性位點 rs857155 基因型分佈並無顯著差異；若將帶有 C 對偶基因合成一組 (AC+CC)，與 AA 基因型分佈頻率也無顯著差異。優秀耐力型運動員之 A 與 C 對偶基因分佈頻率為 55.8%及 44.2%，對照組之 A 與 C 對偶基因分佈頻率為 59.3 及 40.8%，統計結果顯示兩組在對偶基因分佈亦無顯著差異。. 表 4-1 運動員和對照組之 PRKAA2 (rs857155) 基因型與對偶基因分佈運動員. 對照組. N(%). N(%). AA AC CC. 29(28.2) 57(55.3) 17(16.5). 69(34.5) 99(49.5) 32(16.0). 0.520. AA AC+CC. 29(28.2) 74(71.8). 69(34.5) 131(65.5). 0.263. A. 115(55.8). 237(59.3). C. 91(44.2). 163(40.8). 組別. p值. 基因型. 對偶基因 0.418.

(38) 28. 表 4-2 對照組 PRKAA2 (rs857155) 基因多形性之哈溫平衡檢定基因型. 觀察人數. 期望人數. χ2. p值. AA AC CC. 69 99 32. 70 97 33. 0.13. 0.72. 針對性別作進一步分析時發現，優秀耐力型運動員和對照組無論在男性或女性中，PRKAA2多形性位點rs857155之基因型與對偶基因分佈頻率均無顯著差異；而將帶有C對偶基因合成一組 (AC+CC)，與AA基因型分佈頻率亦無顯著差異（表4-3）。. 表 4-3 不同性別之 PRKAA2 (rs857155) 基因型與對偶基因分佈組別. 男性運動員 N(%) 對照組 N(%). p值. 女性運動員 N(%) 對照組 N(%). p值. 基因型 AA AC CC. 11(23.9) 27(58.7) 8(17.4). 33(29.7) 61(55.0) 17(15.3). AA AC+CC. 11(23.9) 35(76.1). 33(29.7) 78(70.3). A. 49(53.3). 127(57.2). C. 43(46.7). 95(42.8). 0.755. 18(31.6) 30(52.6) 9(15.8). 28(38.9) 32(44.4) 12(16.7). 0.626. 0.460. 18(31.6) 39(68.4). 28(38.9) 44(61.1). 0.389. 66(57.9). 88(61.1). 48(42.1). 56(38.9). 對偶基因 0.521. 0.601.

(39) 29. 將不同耐力型運動種類分別與對照組相比，如表 4-4 所示，結果顯示網球運動員與對照組在 PRKAA2 多形性位點 rs857155 基因型分佈有顯著差異，且網球運動員之 C 對偶基因分佈頻率顯著高於對照組；而划船運動員之 C 對偶基因分佈頻率也顯著高於對照組 (p < .05)。. 表 4-4 不同運動種類之 PRKAA2 (rs857155) 基因型與對偶基因分佈運動種類. 基因型 AA. AC. CC. p值. 對偶基因 A. C. p值. 游泳自行車划船足球橄欖球網球. 2(20.0). 8(80.0). 0(0.0). 0.140. 12(60.0). 8(40.0). 0.947. 7(43.8) 2(11.8) 12(38.7) 5(29.4) 1(8.3). 7(43.8) 9(52.9) 16(51.6) 11(64.7) 6(50.0). 2(12.5) 6(35.3) 3(9.7) 1(5.9) 5(41.7). 0.750 0.054 0.648 0.389 0.036. 21(65.6) 13(38.2) 40(64.5) 21(61.8) 8(33.3). 11(34.4) 21(61.8) 22(35.5) 13(38.2) 16(66.7). 0.479 0.017 0.431 0.774 0.013. 對照組. 69(34.5). 99(49.5). 32(16.0). 1.000. 237(59.3) 163(40.8). 1.000.

(40) 30. 二、eNOS G894T 基因多形性之分佈優秀耐力型運動員與對照組之 eNOS G894T 基因型及對偶基因分佈如表 4-5。對照組中 GG、GT 及 TT 基因型的分佈頻率分別為 79.0%、19.0% 及 2.0%，符合遺傳平衡的哈溫定律（表 4-6）。而在優秀耐力型運動員中 GG、 GT 及 TT 基因型分佈頻率分別為 77.7%、19.4%及 2.9%，統計結果顯示兩組在 eNOS G894T 基因型分佈上並無顯著差異；若將帶有 T 對偶基因合成一組 (GT+TT)，與 GG 基因型分佈頻率也無顯著差異。優秀耐力型運動員之 G 與 T 對偶基因分佈頻率為 87.4%及 12.6%，對照組之 G 與 T 對偶基因分佈頻率為 88.5%及 11.5%，統計結果顯示兩組在對偶基因分佈亦無顯著差異。. 表 4-5 運動員和對照組之 eNOS G894T 基因型與對偶基因分佈運動員. 對照組. N(%). N(%). GG GT TT. 80(77.7) 20(19.4) 3(2.9). 158(79.0) 38(19.0) 4(2.0). 0.875. GG GT+TT. 80(77.7) 23(22.3). 158(79.0) 42(21.0). 0.789. G. 180(87.4). 354(88.5). T. 26(12.6). 46(11.5). 組別. p值. 基因型. 對偶基因 0.686.

(41) 31. 表 4-6 對照組 eNOS G894T 基因多形性之哈溫平衡檢定基因型. 觀察人數. 期望人數. χ2. p值. GG GT TT. 158 38 4. 157 41 3. 0.89. 0.35. 針對性別作進一步分析時發現，優秀耐力型運動員和對照組無論在男性或女性中，eNOS G894T基因型與對偶基因分佈頻率均無顯著差異；而將帶有T對偶基因合成一組 (GT+TT)，與GG基因型分佈頻率亦無顯著差異（表 4-7）。. 表 4-7 不同性別之 eNOS G894T 基因型與對偶基因分佈組別. 男性運動員 N(%) 對照組 N(%). p值. 女性運動員 N(%) 對照組 N(%). p值. 基因型 GG GT TT. 36(78.3) 9(19.6) 1(2.2). 88(79.3) 22(19.8) 1(0.9). GG GT+TT. 36(78.3) 10(21.7). 88(79.3) 23(20.7). G. 81(88.0). 198(89.2). T. 11(12.0). 24(10.8). 0.811. 44(77.2) 11(19.3) 2(3.5). 59(81.9) 12(16.7) 1(1.4). 0.661. 0.887. 44(77.2) 13(22.8). 59(81.9) 13(18.1). 0.504. 99(86.8). 130(90.3). 15(13.2). 14(9.7). 對偶基因 0.769. 0.512.

(42) 32. 將不同耐力型運動種類分別與對照組相比，如表 4-8 所示，結果顯示各種耐力型運動（游泳、自行車、划船、足球、橄欖球及網球）與對照組在 eNOS G894T 基因型分佈均無顯著差異；eNOS G894T 對偶基因分佈頻率在各種耐力型運動與對照組間亦無明顯不同。. 表 4-8 不同運動種類之 eNOS G894T 基因型與對偶基因分佈運動種類. 基因型 N(%) GG. GT. TT. p值. 對偶基因 N(%) G. T. p值. 游泳自行車划船足球橄欖球網球. 6(60.0). 4(40.0). 0(0.0). 0.254. 16(80.0). 4(20.0). 0.252. 14(87.5) 13(76.5) 25(80.6) 12(70.6) 10(83.3). 2(12.5) 3(17.6) 4(12.9) 5(29.4) 2(16.7). 0(0.0) 1(5.9) 2(6.5) 0(0.0) 0(0.0). 0.673 0.591 0.272 0.512 0.861. 30(93.8) 29(85.3) 54(87.10 29(85.3) 22(91.7). 2(6.3) 5(14.7) 8(12.9) 5(14.7) 2(8.3). 0.363 0.577 0.749 0.577 0.634. 對照組. 158(79.0). 38(19.0). 4(2.0). 1.000. 354(88.5) 46(11.5). 1.000.

(43) 33. 三、eNOS intron 4 a/b 基因多形性之分佈 eNOS intron 4 aa 基因型在 393 bp 處出現一條亮帶；eNOS intron 4 ab 基因型在 393 bp 及 420 處各出現一條亮帶；eNOS intron 4 bb 基因型在 420 bp 處出現一條亮帶 (圖 4-2)。. 圖 4-2 eNOS intron 4 a/b 基因型判定之電泳分析結果. 優秀耐力型運動員與對照組之 eNOS intron 4 a/b 基因型及對偶基因分佈如表 4-9。對照組中 aa、ab 及 bb 基因型分佈頻率分別為 1.5%、15.5%及 83.0%，符合遺傳平衡的哈溫定律（表 4-10），而在優秀耐力型運動員中 aa、 ab 及 bb 基因型分佈頻率分別為 2.9%、26.2%及 70.9%，統計結果顯示優秀耐力型運動員與對照組之 eNOS intron 4 a/b 基因型分佈有顯著差異；若將帶有 a 對偶基因合成一組 (aa+ab)，與 bb 基因型之分佈亦有顯著差異。優秀耐力型運動員之 a 與 b 對偶基因分佈頻率為 16.0%及 84.0%，對照組之 a.

(44) 34. 與 b 對偶基因分佈頻率為 9.3%及 90.8%，統計結果顯示優秀耐力型運動員之 a 對偶基因分佈頻率顯著高於對照組 (p < .05)。. 表 4-9 運動員和對照組之 eNOS intron 4 a/b 基因型與對偶基因分佈運動員. 對照組. N(%). N(%). aa. 3(2.9). 3(1.5). ab bb. 27(26.2) 73(70.9.). 31(15.5) 166(83.0). aa+ab bb. 30(29.1) 73(70.9.). 34(17.0) 166(83.0). a. 33(16.0). 37(9.3). b. 173(84.0). 363(90.8). 組別. p值. 基因型 0.049. 0.014. 對偶基因. 表 4-10 對照組 eNOS intron 4 a/b 基因多形性之哈溫平衡檢定基因型. 觀察人數. 期望人數. χ2. p值. aa ab bb. 166 31 3. 165 34 2. 1.18. 0.28. 0.014.

(45) 35. 針對性別作進一步分析時發現，優秀耐力型運動員和對照組無論在男性或女性中，eNOS intron 4 a/b基因型分佈頻率均無顯著差異，然而將男性優秀耐力型運動員和對照組中帶有a對偶基因合成一組 (aa+ab)，發現與bb 基因型之分佈有顯著差異；同時發現男性優秀耐力型運動員之a對偶基因分佈頻率顯著高於對照組 (p < .05)（表4-11）。. 表 4-11 不同性別之 eNOS intron 4 a/b 基因型與對偶基因分佈組別. 男性運動員 N(%) 對照組 N(%). p值. 女性運動員 N(%) 對照組 N(%). p值. 基因型 aa ab bb. 1(2.2) 13(28.3) 32(69.6). 2(1.8) 15(13.5) 94(84.7). aa+ab bb. 14(30.4) 32(69.6). 17(15.3) 94(84.7). a. 15(16.3). 19(8.6). b. 77(83.7). 203(91.4). 0.086. 2(3.5) 14(24.6) 41(71.9). 1(1.4) 14(19.4) 57(79.2). 0.544. 0.030. 16(28.1) 41(71.9). 15(20.8) 57(79.2). 0.339. 18(15.8). 16(11.1). 96(84.2). 128(88.9). 對偶基因 0.044. 0.616.

(46) 36. 將不同耐力型運動種類分別與對照組相比，如表 4-12 所示，結果顯示自行車運動員與對照組在 eNOS intron 4 a/b 基因型分佈有顯著差異，且自行車運動員之 a 對偶基因分佈頻率顯著高於對照組；而划船運動員之 a 對偶基因分佈頻率也顯著高於對照組 (p < .05)。. 表 4-12 不同運動種類之 eNOS intron 4 a/b 基因型與對偶基因分佈運動種類. 基因型 aa. ab. bb. p值. 對偶基因 a. b. p值. 游泳自行車划船足球橄欖球網球. 0(0.0). 2(20.0). 8(80.0). 0.868. 2(10.0). 18(90.0). 0.910. 2(12.5) 1(5.9) 0(0.0) 0(0.0) 0(0.0). 4(25.0) 5(29.4) 8(25.8) 5(29.4) 3(25.0). 10(62.5) 11(64.7) 23(74.2) 12(70.6) 9(75.0). 0.009 0.129 0.300 0.305 0.636. 8(25.0) 7(20.6) 8(12.9) 5(14.7) 3(12.5). 24(75.0) 27(79.4) 54(87.1) 29(85.3) 21(87.5). 0.005 0.035 0.367 0.302 0.597. 對照組. 3(1.5). 31(15.5). 166(83.0). 1.000. 37(9.3). 363(90.8). 1.000.

(47) 37. 四、PRKAA2 與 eNOS 基因多形性之合併分析分別將 eNOS G894T 帶有 T 對偶基因合成一組 (GT+TT) 及 eNOS intron 4 a/b 帶有 a 對偶基因合成一組 (aa+ab) 。在 eNOS G894T 與 eNOS intron 4 a/b 基因型之合併分析結果發現，優秀耐力型運動員與對照組間有顯著差異 (p < .05)；優秀耐力型運動員帶有 T 對偶基因 (GT+TT) 與 a 對偶基因 (aa+ab) 分佈頻率顯著高於對照組（表 4-13）。. 表 4-13 eNOS 894T 與 eNOS intron 4 a/b 基因型之合併分析 G894T. intron 4a/b. 運動員組 N(%). 對照組 N(%). p值. GG GG GT+TT GT+TT. aa+ab bb aa+ab bb. 24(23.3) 56(54.4) 6(5.8)* 17(16.5). 33(16.5) 125(62.5) 1(0.5) 41(20.5). 0.010. 註：*與對照組達顯著差異.

(48) 38. 針對eNOS intron 4 a/b與eNOS G894T進行單體型 (haplotype) 分析，如表4-15所示，結果發現eNOS intron 4 a/b與eNOS G894T之間有連鎖不平衡 (linkage disequilibrium) 現象；intron 4 a/b之b對偶基因與eNOS 894T之G對偶基因的單體型頻率為77.2%，而intron 4 a/b之a對偶基因與eNOS 894T之T對偶基因的單體型頻率為0.3%（表4-14）。. 表4-14 eNOS intron 4 a/b與eNOS G894T之單體型分析 intron 4a/b. G894T. haplotype frequency. p值. b b a a. G T G T. 0.772 0.116 0.109 0.003. 0.015. 分別將 PRKAA2 (rs857155) 帶有 C 對偶基因合成一組 (AC+CC) 及 eNOS intron 4 a/b 帶有 a 對偶基因合成一組 (aa+ab) 。在 PRKAA2 (rs857155) 與 eNOS intron 4 a/b 基因型之合併分析結果發現，優秀耐力型運動員與對照組間並無顯著差異（表 4-15）。. 表 4-15 PRKAA2 (rs857155) 與 eNOS intron 4 a/b 基因型之合併分析 rs857155. intron 4a/b. 運動員組 N(%). 對照組 N(%). p值. AA AA AC+CC AC+CC. aa+ab bb aa+ab bb. 6(5.8) 23(22.3) 24(23.3) 50(48.5). 8(4.0) 61(30.5) 26(13.0) 105(52.5). 0.082.

(49) 39. 分別將 PRKAA2 (rs857155) 帶有 C 對偶基因合成一組 (AC+CC) 及 eNOS G894T 帶有 T 對偶基因合成一組 (GT+TT)。在 PRKAA2 (rs857155) 與 eNOS G894T 基因型之合併分析結果發現，優秀耐力型運動員與對照組間並無顯著差異（表 4-16）。. 表 4-16 PRKAA2 (rs857155) 與 eNOS G894T 基因型之合併分析 rs857155. G894T. 運動員組 N(%). 對照組 N(%). p值. AA AA AC+CC AC+CC. GG GT+TT GG GT+TT. 23(22.3) 6(5.8) 57(55.3) 17(16.5). 57(28.5) 12(6.0) 101(50.5) 30(15.0). 0.708.

(50) 40. 第伍章討論與結論本章節分為以下三個部分加以探討：一、PRKAA2 (rs857155) 基因多形性與運動表現；二、eNOS intron 4 a/b 基因多形性與運動表現；三、eNOS G894T 基因多形性與運動表現。. 一、PRKAA2 (rs857155) 基因多形性與運動表現 PRKAA2 基因多形性分佈有種族之間的差異，根據人類基因組單體型圖 (Haplotype Map, HapMap) 計劃所完成之研究數據顯示 C 對偶基因分佈頻率在族群的差別分別是：日本為 62.5%；非裔美國人為 34.7%；高加索人為 56.8%；中國為 54.4%（表 5-1）。本研究顯示台灣一般族群 C 對偶基因分佈頻率為 40.8%，分佈情形與非裔美國人較為接近，其次為中國。. 表 5-1 各種族 PRKAA2 (rs857155) 基因多形性分佈情形作者. 種族. 人數. Hapmap (2009) Hapmap (2009) Hapmap (2009) Hapmap (2009) 本研究. 日本非裔美國高加索人中國台灣. 88 118 118 90 200. 基因型％. 對偶基因％. AA. AC. CC. A. C. 13.6 42.4 18.6 22.2 34.5. 47.7 45.8 49.2 46.7 49.5. 38.6 11.9 32.2 31.1 16.0. 37.5 65.3 43.2 45.6 59.3. 62.5 34.7 56.8 54.4 40.8.

(51) 41. AMPK 為細胞能量狀態的感應者，其活化可促進骨骼肌的葡萄糖吸收和脂肪酸氧化，有助於改善胰島素阻抗及維持血糖穩定 (Bergeron 等， 2001)。由於 AMPK 在調節體內能量代謝有著關鍵的作用，因此 AMPK 基因變異可能會影響能量代謝調控 (Xu 等，2005)。本研究探討 PRKAA2 多形性位點 rs857155 基因與耐力運動表現之關聯，結果發現網球運動員與對照組在基因型分佈有顯著差異，且網球運動員之 C 對偶基因分佈頻率顯著高於對照組。以能量代謝的角度，網球運動的能量來源以 ATP-PC 系統為主佔 70%，無氧糖解系統佔 20% ，有氧系統佔 10%（林正常、蔡崇濱、劉立孙、林政東、吳忠芳，2003）；網球比賽時間雖然長達 2~4 小時，但比賽節奏快速激烈，由此可看出，肌力和爆發力同樣為網球運動的致勝要素，在本研究中網球與其他耐力型運動相比亦是較趨向爆發型的運動。而在划船運動方面，本研究發現划船運動員與對照組之 PRKAA2 基因型分佈並無明顯不同，但划船運動員有較高的 C 對偶基因分佈頻率，划船比賽除了需要肌耐力，最後的衝刺階段乃為致勝的關鍵，此刻必須依靠無氧糖解系統提供大量能量以達到身體的需求。因此本研究推測 C 對偶基因可能較有利於爆發性的動作表現，未來可針對爆發型運動員作進一步確認，以釐清 PRKAA2 基因多形性與運動表現之關聯，然而，PRKAA2 多形性位點 rs857155 基因多形性是透過何種機制影響網球與划船運動表現，需要後續研究作更深入的探討。.

(52) 42. 本篇研究並未排除對照族群是否有運動習慣，可能為影響研究結果的因素之一。再者，本研究僅侷限於台灣地區一般族群，PRKAA2 基因多形性與運動表現的關聯在其他種族是否會有所不同有待進一步研究。. 二、eNOS intron 4 a/b 基因多形性與運動表現 eNOS intron 4 a/b 基因多形性分佈亦有種族之間的差異，a 對偶基因分佈頻率在族群的差別分別是：澳洲為 17.0%；日本為 10.9%；非裔美國人為 28.7%；芬蘭為 16.4%；德國為 15.0%；韓國為 12.4%；中國大陸為 7.8%（表 5-2）。本研究顯示台灣一般族群 a 對偶基因分佈頻率為 9.3%，分佈情形與中國及日本最為接近。. 表 5-2 各種族 eNOS intron 4 a/b 基因多形性分佈情形作者. 種族. Wang 等 (1996) 澳洲 Hibi 等 (1998) 日本 Hooper 等 (1999) 非裔美國 Pulkkinen 等 (2000) 芬蘭 Wolfarth 等 (2008) 德國 Park 等 (2000) 韓國 Hou 等 (2001) 中國本研究台灣. 人數 153 357 185 110 298 206 516 200. 基因型％. 對偶基因％. aa. ab. bb. a. b. 0.7 1.4 8.0 4.6 2.0 0.5 1.2 1.5. 32.7 19.0 34.0 23.6 25.0 23.8 13.8 15.5. 66.7 79.6 45.0 71.8 73.0 75.7 85.0 83.0. 17.0 10.9 28.7 16.4 15.0 12.4 7.8 9.3. 83.0 89.1 71.3 83.6 85.0 87.6 92.2 90.8.

(53) 43. eNOS 存在於內皮與上皮細胞中，透過分泌 NO 可促使平滑肌舒張，亦可促進肌肉組織吸收葡萄糖，因此 eNOS 的正常表現對於維持內皮細胞功能及醣類代謝調節很重要，故許多研究探討 eNOS 基因多形性與糖尿病的關係。Galanakis 等 (2008) 發現糖尿病患者帶有 eNOS intron 4 a 對偶基因的比率顯著高於非糖尿病患者，顯示 eNOS intron 4 a/b 基因變異可能會影響能量代謝調控。本篇研究發現 eNOS intron 4 a/b 基因多形性分佈在優秀耐力型運動員與對照組間有顯著差異，雖然在人口分佈頻率顯示優秀耐力型運動員與對照組有較低的 aa 基因型分佈頻率，但優秀耐力型運動員 aa 基因型分佈頻率仍顯著高於對照組，且優秀耐力型運動員與對照組相比有較少的 bb 基因型；而在對偶基因的分佈亦有同樣的發現，帶有 a 對偶基因者在優秀耐力型運動員比對照組為高，顯示 eNOS intron 4 a/b 基因多形性與運動表現有關聯性存在。此外，在不同種類的耐力型運動中，自行車運動員帶有 a 對偶基因及 aa 基因型分佈頻率均顯著高於對照組；划船運動員相較於對照組也有較高之 a 對偶基因分佈頻率。Wang 等 (1997) 指出 aa 基因型者其血漿中 NO 的量顯著高於 bb 和 ab 基因型者，因此本研究推論 aa 基因型者相較於其他基因型者可能會有較佳的耐力運動表現。此外，本研究發現當男性優秀耐力型運動員和對照組中帶有 a 對偶基因合成一組時 (aa+ab)，與 bb 基因型之分佈有顯著差異，男性優秀耐力型運動員之 a 對偶基因分佈頻率也顯著高於對照組，而女性並無發現此現象；.

(54) 44. 對於基因如何影響男女性的運動表現，目前尚未釐清，有研究指出女性雌激素能增加 NO 的產量 (Hisamoto 等，2001)，可能因而造成 eNOS intron 4 a/b 基因對於耐力運動表現的影響被削弱。先前研究指出 AMPK 活化後會透過啟動 eNOS / NO 訊息路徑調控醣類代謝 (Fryer 等，2000)。然而，在本篇研究中 PRKAA2 基因多形性與耐力運動表現的關聯仍未清楚，因此推測 eNOS intron 4 a/b 基因多形性與耐力運動表現的關聯可能尚有其他原因。Cleeter 等 (1994) 研究指出 NO 能與 O2 競爭，結合到細胞色素 c 氧化酶 (cytochrome c oxidase)，進而抑制粒線體的電子傳遞鍊並減少 O2 的消耗。此外，Loke 等 (2004) 研究結果發現 NOS 抑制劑會導致耗氧量提高。由於 O2 的運輸會影響肌肉的收縮能力 (Grassi 等，2000)，因此 O2 消耗量的減少不僅能提升收縮肌的效率，對於耐力運動而言也是較為有利的。.

(55) 45. 三、eNOS G894T 基因多形性與運動表現 eNOS G894T 基因多形性的分佈亦有種族間的差異，T 對偶基因分佈頻率在族群的差別分別是：日本為 8.7%；澳洲為 36.0%；英國為 31.2%；芬蘭為 30.4%；法國為 38.6%（表 5-3）。本研究顯示台灣一般族群 T 對偶基因分佈頻率 11.5%，分佈情形與日本最為接近。. 表 5-3 各種族 eNOS G894T 基因多形性分佈情形作者、年代. 種族. 人數. Hibi 等 (1998) Cai 等 (1999) Hingorani 等 (1999) Pulkkinen 等 (2000) Elbaz 等 (2000) Wolfarth 等 (2008) 本研究. 日本澳洲英國芬蘭法國德國台灣. 基因型％. 對偶基因％. GG. GT. TT. G. T. 357 158 138 110 460 298. 82.6 41.8 47.8 49.1 36.0 44. 17.4 44.3 42.0 40.9 50.8 47. 0.0 13.9 10.2 10.0 13.2 9. 91.3 64.0 68.8 69.6 61.4 67. 8.7 36.0 31.2 30.4 38.6 33. 200. 79.0. 19.0. 2.0. 88.5. 11.5. 本研究結果顯示優秀耐力型運動員與對照組在 eNOS G894T 基因型和對偶基因分佈均無顯著差異，對照 Wolfart 等 (2007) 研究以越野滑雪、冬季兩項、自行車項目等 316 位耐力型運動員與 299 位對照組為研究對象，其結果與本研究相同。而 Saunders 等 (2006) 亦發現 eNOS G894T 基因型和對偶基因分佈頻率在不同成績等級的鐵人三項運動員及控制組間並無顯著不同，但 GG 基因型者在競賽中所花費的時間顯著高於 GT 或 TT 基因型者。由於 Saunders 等研究主要以鐵人三項運動員為研究對象，而本篇研究.

(56) 46. 所採用之運動種類為游泳、划船、自行車以及橄欖球、足球及網球等，從能量系統觀點，橄欖球、足球及網球並非如鐵人三項幾乎完全由有氧系統供能 (Petersburg 等，2007)，可能為此原因造成本研究與該篇研究結果不同。從單體型分析顯示受詴對象 eNOS intron 4 a/b 與 eNOS G894T 之間有顯著的連鎖不平衡，其中 G894T 之 T 對偶基因與 intron 4 a/b 之 b 對偶基因的結合頻率遠大於與 intron 4 a/b 之 a 對偶基因的結合，同樣地，intron 4 a/b 之 a 對偶基因與 G894T 之 G 對偶基因的結合頻率遠大於與 G894T 之 T 對偶基因的結合，導致 intron 4 a/b 與 G894T 間雖然有連鎖關係，但 eNOS G894T 與運動表現之關聯並未如同 eNOS intron 4 a/b。對照 eNOS G894T 與 eNOS intron 4 a/b 基因多形性之合併分析，優秀耐力型運動員帶有 T 對偶基因 (GT+TT) 與 a 對偶基因 (aa+ab) 分佈頻率顯著高於對照組，由此可推論運動員同時擁有 T 對偶基因及 a 對偶基因將會有最好的耐力運動表現，而帶有這兩種對偶基因在台灣一般族群的分佈頻率確實較其他種族為低，因此若能找出這極少數之人，再輔以科學化訓練，定能提升台灣的運動水準。.

(57) 47. 四、結論本論文主要探討優秀耐力型運動員 PRKAA2 與 eNOS 基因型分佈與一般族群是否有差異，依據所分析之 103 位耐力型運動員及 200 位對照組，所得結論如下： 1. PRKAA2 ( rs857155) 基因或許可成為網球運動表現的指標之一。 2. eNOS intron 4 a/b 基因可作為選拔優秀耐力型運動員的候選基因。 3. eNOS intron 4 a/b 基因多形性與運動表現的關聯性可能受性別影響。 4. 運動員同時擁有 T 對偶基因及 a 對偶基因將會有最好的耐力運動表現。. 根據本研究結果，提出以下建議： 1. 增加運動員人數，提升研究信度。 2. 比較耐力型運動員與爆發型運動員 PRKAA2 (rs857155) 基因型分佈是否有所差異。 3. 探討耐力型運動員 eNOS intron 4 a/b 基因多形性與血漿 NO 濃度之關聯。.

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