臺灣黃杞Engelhardtia roxburghiana Wallich之化學成分研究; Studies on the Chemical Constituents of Engelhardtia roxburghiana Wallich

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(1)第一章緒言. 黃杞屬 (Engelhardtia) 為一分布廣泛之胡桃科 (Juglandaceae) 植物，分布於福建、臺灣、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州、雲南等地，印度、緬甸、越南、泰國亦有分布。而臺灣產之黃杞屬 (Engelhardtia)植物依臺灣植物誌(Flora of Taiwan)所載僅有臺灣黃杞 (Engelhardtia roxburghiana Wallich)一種[1-2]。臺灣黃杞(E. roxburghiana) 生長在臺灣全島低至中海拔之山區森林中，其樹皮具有行氣，化濕，健脾，導滯，消食之功效。民間剝取其粗幹皮部，整片曬乾或切片曬乾使用。主治脾胃濕滯，胸腹脹悶，濕熱泄瀉，疝氣腹痛；葉可清熱，止痛。主治感冒發熱，疝氣腹痛[3-4]，樹皮及葉能毒魚[4-5]。. 根據美國伊利諾大學 Napralert 資料庫在 2002 年以前所做的統計，目前尚無臺灣黃杞英文學名之相關資料。而據文獻報導本科植物具有抑制醛糖還原酶、抗腫瘤、鎮痛消炎、抑菌及生物毒性等作用[6]，值得進一步分離追蹤其活性成分。. 經由國家衛生研究院細胞毒殺活性試驗，發現臺灣黃杞樹皮部之甲醇抽出物及各種有機溶媒萃取層中，以正己烷層及氯仿層對 NUGC-3 及 HONE-1 兩種癌細胞具有明顯抑制作用；而在莖部之甲醇抽出物及各種有機溶媒萃取層中，以正己烷層及氯仿層對 NUGC-3 癌細胞具有明顯抑制作用；而在 DPPH 自由基清除能力之試驗中，結果發現臺灣黃杞樹皮部之甲醇萃取物、氯仿、乙酸乙酯層及正丁醇層具有顯著的抗氧化活性。. 1.

(2) 因此本研究以細胞毒性及抗氧化能力作為活性指標，進行臺灣黃杞化學成分之分離，將臺灣黃杞之乾燥樹皮部以甲醇浸泡抽取後，取甲醇抽出物以不同極性的溶媒萃取，經減壓濃縮至乾後，再將各萃取層成分分別以管柱層析法分離，經由再結晶法純化並利用紅外光譜、紫外光譜、質譜及核磁共振等光譜分析法，進行結構鑑定，最後得到七個化合物及一個混合物，分別為 β-sitosterol, tetracosanoic acid, betulinic acid, 5-hydroxy-2-methoxy-1,4-naphthoquinone, mixture of betulinic acid and ursolic acid, β-sitosterol 3-O-glucoside, astilbin, kaempferol 3-O-rhamnoside。. 盼望藉由臺灣產藥用植物臺灣黃杞的化學成分研究，來確定其成分種類，進而瞭解臺灣黃杞在醫療上的功效及民間用途使用的正確性，以提高臺灣本土藥用植物之利用價值。並期望本研究所分離的化合物，能對往後研究本藥用植物者，提供一些具有價值的參考。. 2.

(3) 第二章總論第一節. 臺灣黃杞之藥用植物學考察. 一、臺灣黃杞之植物學分類[7]. 被子植物門 Angiospermae 雙子葉綱 Dicotyledoneae 離瓣花亞綱 Choripetalae 單花被類 Monochlamydeae 胡桃目 Juglandales 胡桃科 Juglandaceae 黃杞屬 Engelhardtia. 二、胡桃科(Juglandaceae) 黃杞屬(Engelhardtia)植物之特徵[1] 芽裸露。偶數羽狀複葉；小葉 2 至 5 對。數支雄花序簇生或排成圓錐狀；雄花被片 4 裂或退化，雄蕊 3 至 15 枚。雌花序為一長葇荑花序；雌花被片 4 裂；柱頭 2 或 4。小堅果具翅 3 裂。臺灣有 1 種。. 3.

(4) 三、黃杞屬(Engelhardtia) 植物檢索表[2]. 1.偶數羽狀複葉；小葉 2 至 5 對，明顯有柄.....1. Engelhardia（黃杞屬） 1.奇數羽狀複葉；小葉 7 至 15 對，無或幾無柄。 2.小葉長橢圓形，長橢圓狀卵形或橢圓形.........2. Juglans（核桃屬） 3.小葉卵狀或長橢圓狀披針形..........................3. Platycarya（化香屬）. 四、臺灣黃杞(Engelhardtia roxburghiana Wallich)之植物形態[1-2]. 喬木高達 10 m。小葉全緣，小葉柄長 0.5-1.0 cm。雌花序頂生，單生或與數個雄花序排成圓錐花序。小堅果球形，直徑約 3 mm。生長在全島低至中海拔之山區森林中。. 4.

(5) 1.. blanch with staminate catkins;. 2. frutescence;. 3. pistillate flower;. 4.. staminate flower;. 5. stamen;. 6. section of pistillate flower;. 7.. nut with 3-lobed bract;. 8. nut.. Figure 2-1. 臺灣黃杞(Engelhardtia roxburghiana Wallich)植物型態特徵圖[2]. 5.

(6) 五、臺灣黃杞之基原、分布與功用[3-8]：. 1.學名：Engelhardtia roxburghiana Wallich 2.科名：胡桃科 Juglandaceae 3.別名：杞樹，黃久、黃果，黃櫸、黃古木、土厚朴。 4.分布：福建、臺灣、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州、雲南等地。 5.藥性：味微苦、辛，性平。 6.效用：樹皮部可行氣，化濕，導滯。主治脾胃濕滯，烷腹脹悶，泄瀉。而葉部可清熱，止痛。主治感冒發熱，疝氣腹痛。 7.用法用量： (1)治黃疸病：黃杞樹皮 2-3 錢。水煎服。 (2)治脾胃濕滯，濕熱泄瀉：黃杞樹皮 2-3 錢或葉 4-5 錢，水煎服。 (3)治感冒發熱：黃杞葉 4-5 錢，水煎服。. 6.

(7) 第二節臺灣黃杞 Napralert 及相關文獻考察有關黃杞屬(Engelhardtia)全屬之植物成分及藥理文獻，據 2002 年美國伊利諾大學 Narpralert Database Profiles on Engelhardtia 在 2002 年以前所做的統計，依民俗用法(ethnomedical usage)、抽出物之生物活性(biological activities)及分離之成分(presense of compounds)等三項歸類整理如下：. 一、黃杞屬(Engelhardtia)植物之民俗用法報導方面：黃杞屬之民俗用法報導方面，在臺灣民間用法為剝取其粗幹皮部，整片曬乾或切片曬乾使用。主治脾胃濕滯，胸腹脹悶，濕熱泄瀉，疝氣腹痛；葉可清熱，止痛。主治感冒發熱，疝氣腹痛；樹皮及葉能毒魚[4-5]。黃杞之乾燥葉，在中國大陸民間常用來泡成甜茶（sweet tea）喝，可預防高血壓，並有降血脂作用[9,10,13-14]；在印度民間則是取樹皮部來治療內傷（internal injury）[15]。. 7.

(8) 二、黃杞屬(Engelhardtia)植物之生物活性研究方面：在中國大陸方面的研究，黄杞葉部萃取物可以抑制組織胺游離，且黄杞葉部總黄酮對小鼠具有一定的活血化瘀、降血脂、降血糖和增强免疫力的作用[11-13]。而在 Napralert 資料庫則報導黃杞屬之生物活性，具有抗痙攣作用（spasmolytic activity）、刺激毛髮生長的作用（hair stimulant effect）、抗病毒（antiviral activity）、降血壓活性（hypotensive activity）、抗腫瘤活性（antitumor activity）、全身毒性反應（toxic effect, general）[16-19]。. 黃杞植物之成分研究方面，目前尚未有臺灣黃杞(E. roxburghiana) 這一種植物之相關資料。. 由上述整理發現，臺灣黃杞(E. roxburghiana)之民俗用法、生物活性及成分研究方面仍相當有限，而根據 Narpralert 文獻報導，本屬其他植物則具有抗腫瘤活性、抗痙攣、抗病毒、降血壓等之報導，因此具有值得進一步研究及開發的潛力。. 8.

(9) 三、黃杞屬(Engelhardtia)植物之成分研究方面：[11,14,20-27] 1. Steroids: β-sitosterol 2. Benzenoids: gallic acid 3. Flavonoids: astibin (dihydroquercetin 3-α-L-rhamnopyranoside) neoastilbin isoastilbin huangqioside E phlorizin (phloretin 2’-β-D-glucoside ) gallocatechin 4. Flavonol： quercitrin (quercetin 3-L-rhamnoside ) engelhardtia flavonoid triglycoside engelhardtia quercetin glycoside. 5. Chromone： eucryphin （詳見 Table 2-3）. 9.

(10) Table 2-1 Ethnomedical information on Engelhardtia Species Used part Area Ethnomedical usage E. chrysolepis dried leaf China Used as a sweet tea . Leaves are said to taste sweet. bark India Used to cure internal injuries. E. spicata. Ref. [14] [15]. Table 2-2 Biological activities for extracts of Engelhardtia Species E. acerifolia. Used part Area aerial parts India. part not specified E. colebrookiana stem bark E. chrysolepis. Biological activities Ref. spasmolytic activity (A) [16]. Japan. hair stimulant effect (A) [17]. India. antiviral activity (A). [18]. hypotensive activity (A) dried entire Not stated antitumor activity (W) [19] plant toxic effect, general (A) (A: active, S: strong, W: weak, I: inactive) E. spicata. 10.

(11) Table 2-3: Presence of compounds in Engelhardtia Species. Used Area Isolated compounds part leaf China astilbin, isoastilbin, E. chrysolepis neoastilbin huangqioside E, Japan astilbin China eucryphin quercitrin E. colebrookiana leaf India engelhardtia flavonoid triglycoside engelhardtia quercetin glycoside E. serrata. stem China gallic acid bark (-):gallocatechin. Type. Flavonoid [14, 20-24] Flavonoid Chromone Flavonol Flavonol [25-26]. Flavonol Benzenoid [11, 27] Flavonoid. phlorizin. Flavonoid. β-sitosterol. Steroid. 11. Ref..

(12) 第三章實驗部分第一節實驗試劑與儀器. 一、溶媒、試藥與層析材料：. 1.溶媒 (1)正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、苯、乙醚、正丁醇等溶媒（以上購自 Merck）。 (2)乙醇為臺灣省菸酒公賣局之 95%酒精。 (3) 測核磁共振 (NMR) 光譜所用之溶媒 CDCl3 (Deuterated chloroform) 、 CD3OD-d4 (Deuterated methanol) 、 DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide ）、 Pyridine-d5 等均為光譜級（以上購自 Merck）。. 2.顯色劑 (1) 10 % Sulfuric acid spray reagent。 (2) Anisaldehyde / sulfuric acid spray reagent。 (3) Vanillin / sulfuric acid spray reagent。. 3.薄層層析(Thin Layer Chromatography) TLC plate：Kieselgel 60 F254 silica gel pre-coated aluminum plate，厚度 0.2 mm (Merck)。. 12.

(13) 4.管柱色層層析(Column Chromatography) 以 Pyrex 或 Merck 公司生產之不同型號管柱。填充物質：Kieselgel 60 70-230 mesh (Merck), Kieselgel 60. 230-400. mesh (Merck), Sephadex LH-20 (Pharmacia), Diaion HP-20。. 5.試藥醋酸、硫酸、硝酸、氫氧化銨、無水硫酸鈉、茴香醛、香莢蘭醛及溴化鉀等均為試藥級（以上購自 Merck 公司）。. 13.

(14) 二、實驗儀器：. 1.迴轉式濃縮機：Rotavapor R-114 (Büchi)。. 2.烘箱：Chanel Drying Oven OV602。. 3.電子乾燥箱：用於保存 TLC 片、NMR 溶媒及紅外線譜用之 KBr。. 4.電子天平：Mettler AJ100 and Metter Toledo PB 602。. 5.電熱板：Coroning Model PC-320。. 6.超音波震盪器： (1) Bandelin Sonorex Super PK1028BH (2) AquusonicTM Model 150D。. 7.玻璃展開槽：Merck 120 mm × 150 mm 及 220 mm × 70 mm。. 8.紫外線燈： CAMAG Universal UV lamp，波長 254 nm 及 366 nm。. 9.微量熔點測定器： Yanaco MP-500，其溫度計未經校正。. 14.

(15) 10.紅外線分光光譜儀 (Infared Spectrophotometer) 使用 Nicolet Impact 400 FT-IR Spectrophotometer 測定，固體以乾的 KBr 粉未混合均勻，加壓成透明薄片測定之，光譜單位為波數(cm-1) （中國醫藥大學）。. 11.質譜儀(MS) (1) VG Platform II Mass Spectrometer，離子化電壓為 70 eV（中國醫藥大學） (2) JOEL JMS-SX/SX 102A Tandem Mass Spectrometer（中興大學）。. 12.核磁共振光譜儀 (1) Bruker DPX-200 FT-NMR（中國醫藥大學）。 (2) Bruker AMX-400 FT-NMR（中國醫藥大學）。 (3) Varian VXR-600 FT-NMR （中興大學）。 Internal standard 為 Tetramethy Silane (TMS)，化學位移(Chemical shift)以 δ 表示，單位 ppm，以 J 表示偶合常數(coupling constant)，單位 Hz 峰線訊號以“s”表示單峰(singlet)，“d”表示雙重峰(doublet)， “t”表示三重峰(triplet)，“q”表示四重峰(quartlet)，“m”表示多重峰 (multiplet)，“br”表示寬峰(broad)。. 15.

(16) 第二節實驗藥材來源及其抽提與分離. 一、植物採集及前處理：. 植物臺灣黃杞(Engelhardtia roxburghiana Wallich)於民國九十一年十月在南投縣魚池鄉五城村採得。經中國醫藥大學技正邱年永老師鑑定，確認為胡桃科 ( Juglandaceae ) 之臺灣黃杞 (Engelhardtia roxburghiana Wallich)後，先將樹皮部與其他部位分開處理後，進行成分分離實驗之研究。. Figure 3-1 臺灣黃杞(Engelhardtia roxburghiana Wallich)植物圖[5]. 16.

(17) 二、提取與分離：. 陰乾後之臺灣黃杞樹皮部約 3.12 公斤。將粗幹皮部切片並用甲醇於室溫下浸泡一週後，經過濾取濾液減壓濃縮，殘渣再經甲醇浸泡，如此反覆浸泡抽取 3 次，得到樹皮部的甲醇粗抽物約 490.2 公克 (Fr. M)，抽出率約為 15.7 %。將樹皮部的甲醇粗抽物，加入蒸餾水形成懸浮液。再以正己烷分配分離正己烷層合併減壓濃縮至乾後得正己烷層(Fr. H)共 7.4 公克，以氯仿層和水層分配分離出氯仿層(Fr. C)共 16.6 公克，以乙酸乙酯和水層分配分離出乙酸乙酯層(Fr. E)減壓濃縮後為 50.8 公克，以正丁醇和水層分配分離出正丁醇層(Fr. B)減壓濃縮後為 256.2 公克，最後剩餘水層(Fr. W)為 159 公克。而在臺灣黃杞莖部的提取方面，則是委託本實驗室盧冠宏學長代為進行。陰乾後之莖部約 0.5 公斤。將莖部切段並用甲醇於室溫下浸泡一週後，經過濾取濾液減壓濃縮，殘渣再經甲醇浸泡，如此反覆浸泡抽取 3 次，得到莖部的甲醇粗抽物約 48.1 公克(Fr. M)，抽出率約為 9.6 %。將莖部的甲醇粗抽物，加入蒸餾水形成懸浮液。再以正己烷分配分離正己烷層合併減壓濃縮至乾後得正己烷層(Fr. H)共 0.6 公克，以氯仿層和水層分配分離出氯仿層(Fr. C)共 3.3 公克，以乙酸乙酯和水層分配分離出乙酸乙酯層(Fr. E)減壓濃縮後為 10.3 公克，以正丁醇和水層分配分離出正丁醇層(Fr. B)減壓濃縮後為 16.5 公克，最後剩餘水層(Fr. W)為 17.4 公克。. 17.

(18) 成分分離：利用管柱色層層析法(column chromatography)，以 silica gel (70-230 mesh 及 230-400 mesh), Sephadex LH-20, Diaion HP-20 充填在玻璃管柱內為固定相，經不同溶媒梯度沖提管柱，並利用再結晶法純化化合物，結果分離得到七個化合物及一個混合物：. 1.正己烷層(Fr. H)： β-sitosterol (H-1) tetracosanoic acid (H-2)) 2.氯仿層(Fr. C)： betulinic acid (C-1) 2-methoxyjuglone（5-hydroxy-2-methoxy-1,4-naphthoquinone） (C-2) mixture of betulinic acid and ursolic acid (C-3) β-sitosterol 3-O-glucoside (C-4) 3.乙酸乙酯層(Fr. E)： astilbin（dihydroquercetin 3-O-rhamnoside） (E-1) kaempferol 3-O-rhamnoside (E-2). 18.

(19) 三、實驗抽提流程圖： Cortex of Engelhardtia roxburghiana Wallich (3.12kg) Extracted with MeOH and evaporated (490.2 g) Suspended in H2O Extracted with n-Hexane n-Hexane layer. H2O layer. Evaporated. Extracted with CHCl3. (Fr. H) 7.4 g CHCl3 layer H-1. H2O layer. Evaporated. Extracted with EtOAc. H-2 (Fr. C) 16.6 g EtOAc layer C-1. H2O layer. Evaporated. C-2. (Fr. E). C-3. 50.8 g. C-4 n-BuOH layer EA-1. Evaporated. H2O layer Evaporated. EA-2 (Fr. B). (Fr. W). 256.2g. 159g W-1, W-2. Figure 3-2. 臺灣黃杞 Engelhardtia roxburghiana Wallich 樹皮部之抽提流程圖. 19.

(20) Stem of Engelhardtia roxburghiana Wallich (0.5 kg) Extracted with MeOH and evaporated (48.1 g) Suspended in H2O Extracted with n-Hexane n-Hexane layer. H2O layer. Evaporated. Extracted with CHCl3. (Fr. H) 0.6 g CHCl3 layer. H2O layer. Evaporated. Extracted with EtOAc. (Fr. C) 3.3 g EtOAc layer. H2O layer. Evaporated (Fr. E) 10.3 g. n-BuOH layer Evaporated. H2O layer Evaporated. (Fr. B). (Fr. W). 16.5 g. 17.4 g. Figure 3-3 臺灣黃杞 Engelhardtia roxburghiana Wallich 莖部之抽提流程圖. 20.

(21) 第三節. 臺灣黃杞之藥理活性評估. 一、細胞毒殺活性試驗[28-29]：. 此部分實驗委託國家衛生研究院代為進行細胞毒殺活性測試，利用 MTS 分析法，將人類癌細胞植入 96 孔培養皿中。經過一夜的適應，在每孔中加入置於無胎牛血清、最終濃度為 50 µg/ml 之待測物。三天後，由 MTS 還原試劑決定細胞存活能力。Actinomycin D 10 µM 及 0.1 % DMSO 為正對照組及控制組，其結果與 DMSO 相比，換算成百分比。. MTS： 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimethyl-thiazolyl)-3-(4-sulfophenyl) tetrazolium. 培養人類腫瘤細胞： NUGC（胃癌細胞）、HONE-1（鼻咽癌細胞）在 Dulbecco’s modified eagle’s 培養基培養。（5 % CO2 濕式培養基，維持在 37℃，外加 10 % 胎牛血清和非必需胺基酸）。. 21.

(22) 二、抗氧化活性實驗：參考 Shyu YS (2002)[30-34]等之方法，以 DPPH 自由基清除能力之試驗，測試植物萃取物(crude extract)之抗氧化活性。DPPH 為一相對安定的自由基，熔點為 137℃，其甲醇溶液為紫蘿蘭色(violet)在 517 nm 下有強吸光，當 DPPH 自由基與抗氧化劑反應時，將會降低吸光值。因而藉此判斷抗氧化劑清除 DPPH 自由基的能力，其吸光值愈低，表示試樣清除 DPPH 自由基的能力愈強。. DPPH: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl NO 2. .. N. O2N. N. NO 2. DPPH + AH → DPPH2 + A violet. decolorized (yellow). DPPH 自由基的甲醇溶液會隨著 pH 值的不同及時間長短而有所變化，DPPH 自由基甲醇溶液在 pH 5.0-6.5 比較穩定而有適當的吸收，在鹼性時則不穩定。此外，DPPH 自由基的甲醇溶液會隨時間的增長而逐漸劣化，故實驗時需新鮮配製。. 22.

(23) 依 Shyu YS (2002) [30-34]等之實驗方法及步驟： 1. 先檢測 DPPH (75 µM)甲醇溶液在可見光 517 nm 之吸收值(A0)。 2. 將臺灣黃杞甲醇萃取物(Fr. M)、正己烷層(Fr. H)、氯仿層(Fr. C)、乙酸乙酯層(Fr. E)，正丁醇層(Fr. B)、水層(Fr. W)等萃取層，分別配製出 50, 100, 200, 250, 500 µg/mL 等五種濃度之樣品(sample)兩組。接著在 10 mL 的試管中加入各樣品 0.3 mL 再加入 0.2 mL 之甲醇。 3. 此時將樣品分成兩組，一組為空白實驗，一組則加入 2.5 mL 的 DPPH (75 µM)甲醇溶液至總體積為 3 mL。將兩組溶液置於室溫反應 90 分鐘，之後分別將各組使用可見光 517 nm (A517)吸收波長測定吸光度，並記錄之。 4. 將各測得之吸光值代入下列公式換算成自由基清除能力 (Scavenging effect)：. Scavenging effect (%) =. [A0 − (A − Ab)] × 100% A0. A0:. A517 of DPPH without sample. A:. A517 of sample and DPPH. Ab:. A517 of sample without DPPH. 23.

(24) 第四章. 結. 果. 第一節臺灣黃杞各成分之物理性質及光譜數據【一】H-1: β-sitosterol. 1. 白色粉末（以氯仿-甲醇再結晶） 2. 熔點：123-124℃ 3. TLC：Rf = 0.6 (CHCl3) 4. 10% H2SO4 spray：藍紫色(110℃) 5. IR νmax(KBr) cm-1：3420, 2935, 2850, 1699, 1446, 1373, 1049。 6. MS ( m/z % ; EI 70 eV)： 414 (M+, 51.66). 271 (1.69). 255 (18.46). 213 (25.56). 159 (26.03). 145 (41.66). 105 (59.98). 95 (38.63). 81 (69.60). 69 (64). 55 (91.69). 7. 1H-NMR (in CDCl3, 200 MHz) ppm： 5.36. (1H, d, H-6). 3.52. (1H, m, H-3). 0.94. (3H, s, H-19). 0.84. (6H, m, H-26, H-27). 0.68. (3H, s, H-18). 24.

(25) 8. 13C-NMR (in CDCl3, 50MHz) ppm： 140.6 (C-5). 121.4 (C-6). 71.4 (C-3). 56.5 (C-14). 55.6 (C-17). 49.6 (C-9). 45.4 (C-24). 41.9 (C-4). 41.9 (C-13). 39.4 (C-12). 37.0 (C-1). 36.5 (C-10). 35.9 (C-20). 31.5 (C-7). 31.5 (C-8). 31.5 (C-2). 28.9 (C-25). 28.9 (C-16). 25.7 (C-23). 33.5 (C-22). 23.7 (C-15). 22.7 (C-28). 20.8 (C-11). 19.8 (C-26). 20.8 (C-19). 18.7 (C-27). 18.7 (C-21). 11.6 (C-29). 11.6 (C-18). 9.DEPT (π/4, 2π/4, 3π/4, in CDCl3, 50 MHz) ppm： CH3 : 19.8, 19.4, 19.0, 18.7, 11.9, 11.8 CH2 : 42.3, 39.7, 37.2, 33.9, 31.6, 29.1,26.0, 24.3, 23.0, 21.0 CH : 121.7, 71.8, 56.7, 56.0, 50.1, 45.8, 36.1, 31.9, 29.1. 25.

(26) 【二】H-2: tetracosanoic acid. 1. 白色粉末狀（以氯仿-甲醇再結晶） 2. 熔點：60-61℃ 3. TLC：Rf = 0.5 (CHCl3：EtOAc=9：1) 4. 10% H2SO4 spray：灰黑色(110℃) 5. IR νmax(KBr) cm-1：2916, 2849, 1724, 1468。 6. MS ( m/z % ; EI 70 eV)： 368 (M+, 16). 354 (2). 340 (4). 326 (3). 199 (1). 185 (4). 171 (2). 129 (15). 101 (4) 73 (79). 97 (19). 85 (21). 60 (85). 57 (100). 83 (37). 7. 1H-NMR (in CDCl3, 200 MHz) ppm： 2.36. (2H, t, J = 8 Hz, H-2). 1.63. (2H, m, H-3). 1.25. (40H, s, br). 0.89. (3H, t, J = 8 Hz, H-24). 8. 13C-NMR (in CDCl3, 50 MHz) ppm： 177.6 (C-1). 33.6 (C-2). 31.8 (C-22). 24.5 (C-3). 22.4 (C-23). 13.9 (C-24). 26. 29.4 (C-4-21).

(27) 【三】C-1: betulinic acid 1. 無色結晶（以氯仿-甲醇再結晶） 2. 熔點：283-285℃ 3. TLC：Rf = 0.48 (CHCl3：EtOAc = 7：1) 4. Vanillin/硫酸乙醇溶液：紅色→紫紅色→褐色(110℃) 5. IR νmax(KBr) cm-1：3438, 3072, 2945, 1704, 1643, 1446, 1375, 883。. 6. MS ( m/z % ; EI 70 eV)： 456 (M+, 13). 438 (45). 248 (13). 220 (10). 207 (32). 203 (20). 189 (100). 175 (30). 135 (37). 121 (32). 107 (29). 105 (22). 95 (30). 81 (33). 7. 1H-NMR (in CDCl3, 200 MHz) ppm： 4.73. (1H, br. s, H-29). 4.61. (1H, br. s, H-29). 3.39. (1H, m, H-3). 1.98. (3H, s, H-30). 0.82、0.99、1.08、1.15、1.21 (3H each, s, 5×CH3). 27.

(28) 8. 13C-NMR (in CDCl3, 50 MHz) ppm： 181.3 (C-28). 150.2 (C-20). 109.4 (C-29). 76.2 (C-3). 56.1 (C-17). 50.0 (C-5). 49.0 (C-9). 48.8 (C-19). 46.7 (C-18). 42.3 (C-14). 40.6 (C-8). 38.1 (C-4). 37.2 (C-1). 37.0 (C-13). 36.8 (C-10). 33.9 (C-7). 33.0 (C-22). 31.9 (C-21). 30.3 (C-16). 29.4 (C-23). 29.4 (C-2). 28.0 (C-15). 25.2 (C-12). 21.8 (C-11). 20.4 (C-30). 19.1 (C-6). 17.9 (C-25). 15.8 (C-26). 15.6 (C-24). 14.5 (C-27). 9. DEPT (π/4, 2π/4, 3π/4, in CDCl3, 50 MHz) ppm： CH3 : 28.2, 22.0, 19.3, 15.9, 15.8, 14.7 CH2 : 109.6, 37.0, 34.1, 33.2, 32.1, 30.5, 29.6, 25.4, 20.6, 18.1 CH : 76.2, 50.2, 49.2, 49.0, 46.9, 38.3. 28.

(29) 【四】C-2: 2-methoxyjuglone （5-hydroxy-2-methoxy-1,4-naphthoquinone）. 1. 橘黃色針晶（以甲醇再結晶） 2. 熔點：149-151℃ 3. TLC：Rf = 0.4 (n-Hexane：CHCl3=1：4) 4. 10% H2SO4 spray：黃色(110℃) 5. IR νmax(KBr) cm-1：3075, 2918, 1678 , 1634, 1596, 1470, 1372。 6. MS ( m/z % ; EI 70 eV)： 204.2 (M+, 100) 149 (7). 189 (17). 175 (21). 174 (31). 118 (15). 105 (24). 63 (11). 7. 1H-NMR (in CDCl3, 200 MHz) ppm： 12.23. (1H, s, OH). 7.69. (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8). 7.61. (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-7). 7.28. (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6). 6.11. (1H, s, H-3). 3.93. (3H, s, OCH3). 29.

(30) 8. 13C-NMR (in CDCl3, 50 MHz) ppm： 179.1 (C-1). 190.5 (C-4). 100.1 (C-2). 160.8 (C-5). 109.2 (C-3). 119.3 (C-6). 113.9 (C-10). 135.2 (C-7). 130.8 (C-9). 124.9 (C-8). 56.4 (C-11). 9. DEPT (π/4, 2π/4, 3π/4, in CDCl3, 50 MHz) ppm： CH3 : 56.4 CH : 135.2, 124.9, 119.3, 109.2. 30.

(31) 【五】C-3: mixture of betulinic acid and ursolic acid. 1. 白色粉末狀（以氯仿-甲醇再結晶） 2. 熔點：285-290℃ 3. TLC：Rf = 0.4 (CHCl3：EtOAc = 7：1) 4. Vanillin/硫酸乙醇溶液：紅色→紫紅色→褐色(110℃) 5. IR νmax(KBr) cm-1：3443, 2935, 2864, 1739, 1684, 1454, 1366, 1241。 6. MS ( m/z % ; EI 70 eV)： 456 (M+). 438 (36). 423 (16). 248 (100). 219 (11). 207 (2). 189 (59). 175 (20). 133 (40). 119 (22). 107 (20). 105 (22). 95 (19). 81 (22). 7. 1H-NMR (in CDCl3, 200 MHz) ppm： 4.73. (1H, br. s, H-29). 4.61. (1H, br. s, H-29). 3.49. (1H, m, H-3). 1.89. (3H, s, H-30). 0.94、1.03、1.08、1.13、1.15 (3H each, s, 5×CH3). 31.

(32) 8. 13C-NMR (in CDCl3, 50 MHz) ppm： 170. 6 (C-28). 150.2 (C-20). 109.4 (C-29). 80.7 (C-3). 78.1 (C-3). 125.4 (C-12). 138.3 (C-13). 56.2 (C-17). 55.0 (C-5). 50.0 (C-9). 49.0 (C-19). 47.2 (C-18). 42.3 (C-14). 40.6 (C-8). 39.3 (C-4). 38.7 (C-1). 38.1 (C-13). 37.4 (C-10). 33.8 (C-7). 31.9 (C-22). 30.3 (C-21). 29.4 (C-16). 27.8 (C-23). 27.8 (C-2). 27.5 (C-15). 25.2 (C-12). 20.9 (C-11). 19.1 (C-30). 17.8 (C-6). 15.9 (C-25). 15.6 (C-26). 15.2 (C-24). 14.6 (C-27) 9. DEPT (π/4, 2π/4, 3π/4, in CDCl3, 50 MHz) ppm： CH3 : 28.0, 19.3, 18.0,16.1, 15.9, 15.3, 15.2, 14.5 CH2 : 109.3, 40.0, 38.7, 35.6, 34.3, 29.8, 27.4, 25.1, 20.9, 18.3 CH : 78.7, 80.9, 125.6, 55.3, 50.4, 48.3, 47.9, 38.0. 32.

(33) 【六】C-4: β-sitosterol 3-O-glucoside 1. 白色粉末（以甲醇再結晶） 2. 熔點：300℃以上 3. TLC：Rf = 0.45 (CHCl3：MeOH = 9：1) 4. 10% H2SO4 spray：藍紫色(110℃) 5. IR νmax(KBr) cm-1：3410, 2960, 2870, 1647, 1446, 1078, 1024。 6. MS ( m/z % ; FAB)： 599 (M++ Na). 397 (13). 395 (5). 307 (21). 289 (11). 176 (7). 154 (100). 136 (74). 91 (34). 77 (24). 7. 1H-NMR (in Pyridine-d5, 200 MHz) ppm： 5.36. (br, s, H-6). 5.05. (2H, d, H-1’). 4.56, 4.34, 4.31, 4.29, 4.28 (5H, m, glu-H) 4.08. (1H, m, H-3). 1.08. (3H, s, H-19). 1.02. (3H, d, H-21). 0.69. (3H, s, H-18). 33.

(34) 8. 13C-NMR (in Pyridine-d5, 50 MHz) ppm： 140. 4 (C-5). 121.5 (C-6). 102.0 (C-1’). 79.2 (C-3). 77.8 (C-3’). 74.7 (C-5’). 71.1 (C-4’). 62.2 (C-2’). 60.0 (C-6’). 56.4 (C-14). 55.8 (C-17). 53.4 (C-9). 49.9 (C-24). 49.1 (C-13). 45.6 (C-12). 45.6 (C-4). 43.4 (C-1). 42.0 (C-10). 39.5 (C-20). 39.5 (C-7). 38.8 (C-8). 37.0 (C-2). 35.9 (C-16). 35.9 (C-25). 33.2 (C-23). 32.7 (C-22). 31.7 (C-15). 28.1 (C-28). 25.8 (C-11). 24.1 (C-26). 22.9 (C-19). 22.9 (C-27). 20.8 (C-21). 18.9 (C-18). 13.8 (C-29). 9. DEPT (π/4, 2π/4, 3π/4, in Pyridine-d5, 50 MHz) ppm： CH3 : 23.4, 22.9, 22.6, 22.4, 15.5, 15.5 CH2 : 65.5, 43.6, 42.4, 41.1, 37.7, 35.7, 35.7, 32.9, 32.0, 28.1, 26.8, 24.9, 23.5 CH :. 125.8, 104.9, 82.9, 80.4, 79.8, 77.4, 74.0, 60.6, 59.9, 54.0, 49.7, 39.9, 33.4, 29.8. 34.

(35) 【七】E-1: astilbin 1. 淡黃色針晶（以甲醇再結晶） 2. 熔點：179-181℃ 3. TLC：Rf = 0.45 (EtOAc：CHCl3= 9：1) 4. 10% H2SO4 spray：黃色(110℃) 5. IR νmax(KBr) cm-1：3446, 2927, 1646, 1608, 1558, 1361, 1087, 813。 6. MS ( m/z % ; FAB)： 451 (M+H)+. 305 (M+H)+-146. 289 (14). 286 (5). 176 (4). 154 (100). 136 (69). 107 (22). 77 (17). 65 (6). 89 (18). 7. 1H-NMR (in DMSO-d6, 200 MHz) ppm： 7.29. (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2’). 7.73. (1H, dd, J = 8.8, 2.1 Hz, H-6’). 6.89. (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5’). 6.37. (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8). 6.17. (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6). 5.20. (1H, dd, J = 10 Hz, H-3). 4.64. (1H, dd, J = 10 Hz, H-2). 3.06-3.96. (m, sugar-H). 1.04. (1H, d, J = 6.0 Hz, H-6’’). 35.

(36) 8. 13C-NMR (in DMSO-d6, 50 MHz) ppm： 194.2 (C-4). 163.7 (C-5). 167.3 (C-7). 144.8 (C-3’). 145.7 (C-4’). 82.2 (C-2). 76.9 (C-3). 96.0 (C-6). 94.9 (C-8). 162.4 (C-9). 100.8 (C-10). 127.0 (C-1’). 113.9 (C-2’). 114.9 (C-5’). 118.9 (C-6’). 100.5 (C-1’’). 70.5 (C-2’’). 70.1 (C-3’’). 71.6 (C-4’’). 68.9 (C-5’’). 16.3 (C-6’’). 9. DEPT (π/4, 2π/4, 3π/4, in DMSO-d6, 50 MHz) ppm： CH3 : 18.0 CH : 81.9, 76.3, 95.8, 94.3, 114.5, 115.3, 119.3, 100.7, 70.7, 70.5, 71.5, 69.4. 36.

(37) 【八】E-2: kaempferol 3-O-rhamnoside. 1. 黃色粉末（以甲醇再結晶） 2. 熔點：172-174℃ 3. TLC：Rf = 0.5 (EtOAc：CHCl3= 9：1) 4. 10% H2SO4 spray：黃色(110℃) 5. IR νmax(KBr) cm-1：3307, 2927, 1660, 1614, 1496, 1456, 1363, 1060。 6. MS ( m/z % ; FAB)： 435 (M+H)+. 289 (M+H)+-146. 286 (57). 176 (16). 167 (13). 154 (100). 149 (43). 136 (82). 133 (51). 126 (33). 112 (64). 105 (64). 77 (38). 69 (58). 57 (86). 51 (11). 7. 1H-NMR (in DMSO-d6, 200 MHz) ppm： 7.74. (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2’ and H-6’). 6.90. (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3’ and H-5’). 6.36. (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8). 6.16. (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6). 3.09-3.96 (m, sugar-H) 0.78. (1H, d, J = 6.0 Hz, H-6’’). 37.

(38) 8. 13C-NMR (in DMSO-d6, 50 MHz) ppm： 177.8 (C-4). 161.4 (C-5). 164.9 (C-7). 134.3 (C-3). 160.1 (C-4’). 156.7 (C-2). 94.0 (C-6). 99.0 (C-8). 157.4 (C-9). 104.1 (C-10). 120.7 (C-1’). 130.8 (C-2’). 130.8 (C-6’). 115.6 (C-3’). 115.6 (C-5’). 101.9 (C-1’’). 70.5 (C-2’’). 70.8 (C-3’’). 71.3 (C-4’’). 70.3 (C-5’’). 17.5 (C-6’’) 9. DEPT (π/4, 2π/4, 3π/4, in DMSO- d6, 50 MHz) ppm： CH3 : 17.8 CH : 94.0, 99.0, 130.9, 115.8, 102.1, 71.5, 70.9, 70.7, 70.5. 38.

(39) 第二節. 臺灣黃杞之藥理活性試驗結果. 一、細胞毒殺活性試驗：. 將臺灣黃杞甲醇萃取物(Fr. M)以不同溶媒分別萃取後，分成正己烷層(Fr. H)、氯仿層(Fr. C)、乙酸乙酯層(Fr. E)，正丁醇層(Fr. B)、水層(Fr. w)及沈澱物(Fr. P)等。以 MTS 分析法試驗臺灣黃杞各萃取層之細胞毒殺活性，結果發現臺灣黃杞樹皮部之甲醇抽出物及各種有機溶媒萃取層中，以正己烷層及氯仿層對 NUGC-3 及 HONE-1 兩種癌細胞具有明顯抑制作用；而在莖部之甲醇抽出物及各種有機溶媒萃取層中，以正己烷層及氯仿層對 NUGC-3 癌細胞具有明顯抑制作用。此部分結果委託國家衛生研究院代為測試。（詳見 Table 4-1, Table 4-2）. Table 4-1 臺灣黃杞樹皮部各層對細胞毒殺活性測試結果 Cell Line. NUGC-3 50 µg/mL. HONE-1 50 µg/mL. Fr. M Fr. H Fr. C Fr. E Fr. B Fr. W Fr. P. 88% ＜1% 1% 85% ＞100% ＞100% ＞100%. 86% 27% 6% ＞100% 96% ＞100% 93%. Plant. Engelhardtia roxburghiana. (1) Sample conc.: 50 µg/mL； (2) 以%表 cell 之存活率，小於 50%表示有效。. 39.

(40) Table 4-2 臺灣黃杞莖部各層對細胞毒殺活性測試結果 Cell Line. NUGC-3 50 µg/mL. HONE-1 50 µg/mL. Fr. M Fr. H Fr. C Fr. E Fr. B Fr. W Fr. P. 88% 1% ＜1% 99% 98% 101% 99%. 51% 87% 75% 88% 89% 87% 90%. Plant. Engelhardtia roxburghiana. (1) Sample conc.: 50 µg/mL； (2) 以%表 cell 之存活率，小於 50%表示有效。. 40.

(41) 二、抗氧化活性試驗：依 Shyu YS (2002)等之方法，以 DPPH 自由基清除能力之試驗，測試臺灣黃杞樹皮部甲醇萃取物(Fr. M)、正己烷層(Fr. H)、氯仿層(Fr.. C)、乙酸乙酯層(Fr. E)，正丁醇層(Fr. B)、水層(Fr. W)等萃取層，結果發現臺灣黃杞樹皮部之甲醇萃取物、乙酸乙酯層、正丁醇層、水層及沉澱物具有顯著的抗氧化活性。. 本實驗以 Quercetin 及 Vit. E (α-tocopherol)為正對照組。（詳見. Table 4-3, Figure 4-1）. Table 4-3 Scavenging effect (%) of the fractions of Engelhardtia roxburghiana. Sample conc. 50 µg/mL. 100 µg/mL 200 µg/mL 250 µg/mL 500 µg/mL. Fraction Fr. M. 66.77. 84.55. 97.06. 97.14. 99.81. Fr. H. 44.67. 49.28. 50.00. 52.60. 63.77. Fr. C. 56.19. 63.69. 80.57. 89.10. 99.66. Fr. E. 72.17. 91.82. 94.31. 95.11. 98.39. Fr. B. 75.37. 95.99. 97.91. 98.44. 99.10. Fr. W. 48.72. 55.64. 66.69. 76.45. 93.13. *Quercertin. 93.65. 94.30. 94.42. 94.69. 97.16. *Vit. E. 76.26. 93.95. 94.44. 94.86. 97.17. 41.

(42) 100. Scavenging (%). 80. 60. Quercertin Vit.E MeOH n-Hexane CHCl3. 40. EtOAc BuOH H2O. 20. 0 0. 100. 200. 300. 400. 500. Concentration (µg/ml). Figure 4-1 Scavenging effect (%) of the fractions of E. roxburghiana. 42.

(43) 第五章. 第一節. 討. 論. 臺灣黃杞化學成分之結構鑑定. 【一】H-1: β-sitosterol 29. 28 21. 19. 18 2 3 HO. 1 4. 10. 11 9. 12. 20. 22. 17. 23. 24. 25. 26. 27. 13 16. 14 15. 8 7. 5 6. 化合物 H-1 於正己烷層中得到，為白色粉末，以氯仿—甲醇再結晶，熔點 123-124℃，可溶於氯仿，其 TLC 片經溶媒(n-Hexane：CHCl3. = 5：1)展開後，Rf 值為 0.45，噴 10% H2SO4 溶液，加熱後呈由紅色變為紫色，再變為墨綠色。. IR 圖譜(Chart 1)顯示在 3420 cm-1 有-OH 基特性吸收，2935 cm-1 及 2850 cm-1 為飽和碳氫鍵伸縮振動之特性吸收，1446 cm-1 為 CH2 的之特性吸收。. 43.

(44) MS 圖譜(Chart 2) M+ ( m/z %)顯示分子離子峰為 414，其裂片斷裂型式與 β-sitosterol 相同，推測分子式為 C29H50O。 1. H-NMR 圖譜(Chart 3)顯示 δ 5.36 (1H, d, H-6)為雙鍵上 H-6 之質. 子訊號，δ 3.52 (1H, m, H-3)為 C-3 連接-OH 基之次甲基的質子訊號，. δ 0.68-2.28 (m)為植物固醇特有訊號。 13. C-NMR 圖譜(Chart 4)顯示δ 140.60 (C-5), 121.45 (C-6)分別為環. 上雙鍵 C-5 及 C-6 之碳原子訊號，δ 71.44 (C-3)為帶有-OH 基的 C-3 之碳原子訊號。. DEPT 圖譜(Chart 5)中顯示有六個碳原子訊號是屬於 CH3，分別為δ 19.5 (C-26), 19.1 (C-19), 18.7 (C-27), 18.5 (C-21), 11.7 (C-29), 11.6. (C-18)。有十一個碳原子訊號屬於 CH2，分別為 δ 42.0 (C-4), 39.5 (C-12), 37.0 (C-1), 31.4 (C-2), 31.6 (C-7), 28.9 (C-16), 24.0 (C-15), 22.8 (C-28), 20.8 (C-11), 33.7 (C-22), 25.8 (C-23)。有九個碳原子屬於 CH，分別為δ 121.4 (C-6), 71.5 (C-3), 56.5 (C-14), 55.8 (C-17), 50.6 (C-9),. 45.6 (C-24), 36.2 (C-20), 31.6 (C-8), 28.9 (C-25)。其餘的三個碳原子訊號屬於四級碳，分別為δ 140.5 (C-5)、δ 36.5 (C-10)及δ 42.3 (C-13)。（詳見 Table 5-1）. 44.

(45) Table 5-1 化合物 H-1 碳譜數據與文獻 No. of C C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14 C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 C-21 C-22 C-23 C-24 C-25 C-26 C-27 C-28 C-29. δc of H-1 37.0 31.4 71.4 42.0 140.6 121.4 31.6 31.6 49.6 36.5 20.8 39.5 42.3 56.5 24.0 28.9 55.6 11.6 19.1 35.9 18.5 33.7 25.8 45.6 28.9 19.5 18.7 22.8 11.7. [35,36]. β-sitosterol 碳譜數據比對表. δc of literature data 37.3 31.7 71.8 42.3 140.8 121.7 31.9 31.9 50.2 36.5 21.1 39.8 42.3 56.8 24.3 28.2 56.1 11.9 19.8 36.2 18.8 34.0 26.1 45.9 29.2 19.4 19.0 23.1 12.0. 綜合以上光譜資料與文獻[35-36]比對，推定此合物為 β-sitosterol。. 45.

(46) 【二】H-2: tetracosanoic acid. O. HO. 化合物 H-2 於正己烷層中得到，為白色固體粉末，以氯仿-甲醇再結晶，熔點 60-61℃，可溶於正己烷、氯仿，其 TLC 片經溶媒(CHCl3：. EtOAc=9：1) 展開後，Rf 值為 0.5，噴 10% H2SO4 溶液，加熱後呈灰黑色。. IR 圖譜(Chart 6)顯示 2915 cm-1 及 2848 cm-1 為飽和碳氫的特性吸收， 1724 cm-1 為 carbonyl group 的特性吸收，1467 cm-1 為-CH3 基。. MS 圖譜(Chart 7) M+ (m/z %)顯示分子量為 368，推測分子式為 C24H48O2。 1. H-NMR 圖譜(Chart 8)顯示 δ 2.36 (2H, t)為 H-2 的吸收訊號，δ. 1.25 (44H, s, br)為長鏈 methylene (-CH2-)的吸收訊號，δ 0.87 (3H, t)為長鏈末端甲基之吸收訊號。 13. C-NMR 圖譜(Chart 9)顯示 δ 177.5 為 carboxyl carbon 的吸收訊. 號，δ 22.4~33.6 為長鏈 methylene (-CH2-)的吸收訊號，δ 13.8 為長鏈末端甲基之吸收訊號。綜合上述資料與文獻值 [37-38] 比對，確認此化合物之結構為. tetracosanoic acid。 46.

(47) 【三】C-1 : betulinic acid 29. 30. 25. 20. 19. 17. 26. 10 3 HO 24. 8. COOH. 28. 14 27. 4 23. 化合物 C-1 於氯仿層中得到，為無色結晶，以氯仿-甲醇再結晶，熔點 283-285℃，可溶於 pyridine，TLC 片以溶媒(CHCl3：EtOAc=7：. 1)展開後，Rf 值為 0.48，噴 vanillin/硫酸乙醇溶液，加熱後呈色變化為紅色→紫紅色→褐色，推測可能為三萜類化合物。. IR 圖譜(Chart 10)顯示在 3438 cm-1 為 OH 的特性吸收，1704 cm-1 為 carbonyl group 的特性吸收，1446 cm-1 為 CH2 的特性吸收，1375 cm-1 為 CH3 的特性吸收。. MS 圖譜(Chart 11) M+ ( m/z %)顯示分子量為 456，推測分子式為 C30H48O3。（詳見 Figure 5-1）. 47.

(48) 12 11. 10. 2. OH. 20. 18. 21. COOH. +. COOH 14. 9. H2C. 17. 13. 8. 3. 19. 16. m/z 248. 15. 5 4. 7. CH2+. 6. m/z 456 OH. m/z 207. Figure 5-1 betulinic acid 之質譜(MS)斷裂方式 1. H-NMR 圖譜(Chart 12)顯示 δ 0.82, 0.84, 0.93, 1.07, 1.20, 1.98 (s). 分別為六個四級碳上甲基之質子訊號，δ 4.61, 4.73 (2H, br. s)為雙鍵上. H-29 之質子訊號；δ 3.39 (1H, s)為 C-3 連接-OH 之次甲基的質子訊號。 13. C-NMR 圖譜(Chart 13)及 DEPT 圖譜(Chart 14)中顯示 δ 150.2,. 109.4 分別為環外雙鍵 C-20, C-29 之碳原子訊號；δ 76.24 為接-OH 基 C-3 之碳原子訊號。δ 181.3 為 COOH 上 C-28 之碳原子訊號。（詳見 Table 5-2）. 48.

(49) Table 5-2: 化合物 C-1 碳譜數據與文獻[39-41] betulinic acid 碳譜數據比對表. No. of C C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 C-11 C-12 C-13 C-14 C-15 C-16 C-17 C-18 C-19 C-20 C-21 C-22 C-23 C-24 C-25 C-26 C-27 C-28 C-29 C-30. δc of literature data 39.3 28.3 78.1 39.5 55.9 18.8 34.8 41.1 50.9 37.5 21.2 26.1 38.6 42.8 31.2 32.9 56.6 47.8 49.8 151.3 30.2 37.6 28.6 16.3 16.4 16.4 14.9 178.9 109.9 19.4. δc of C-1 38.1 28.0 76.2 40.6 50.0 19.1 33.9 40.6 48.8 37.2 21.8 25.2 38.1 42.2 31.9 33.0 56.1 46.7 49.0 150.2 30.3 38.1 28.0 17.9 15.7 15.6 14.5 181.3 109.4 20.4. 綜合以上光譜資料與文獻[39-41]比對，推定此合物為 betulinic acid。. 49.

(50) 【四】C-2: 2-methoxyjuglone （5-hydroxy-2-methoxy-1,4-naphthoquinone）. O. 7 6. 8. 1. 5. 4. OH. O. 2. O. CH3. 3. 化合物 C-2 氯仿層中得到，為橘黃色針晶，以甲醇再結晶，熔點. 149-151℃，可溶於氯仿、甲醇，其 TLC 片經溶媒(n-Hexane：CHCl3 = 1：4)展開後，Rf 值為 0.4，噴 10% H2SO4 溶液，加熱後呈黃色。 IR 圖譜(Chart 15)顯示 3420 cm-1 有-OH 基的吸收訊號，1678 cm-1 有 carbonyl group 的特性吸收，1596, 1470, 1443cm-1 有芳香環之共軛雙鍵特性吸收。. MS 圖譜(Chart 16) M+ ( m/z %)顯示分子量為 204.2，推測分子式為 C11H8O4。 1. H-NMR 圖譜(Chart 17)顯示 δ 12.23 (1H, s, OH)為 C-5 連接-OH. 的訊號。δ 7.69 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8), 7.61 (1H, dd, J =8.0 and 2.0 Hz,. H-7), 7.28 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6)為 Vicinal Naphthalene Hs 的原子訊號。另外，δ 3.93 (3H, s, OCH3)為甲氧基之訊號。. 50.

(51) 13. C-NMR 圖譜(Chart 18)中顯示共有十一個碳原子吸收訊號，其. 中δ 179.1, δ 190.5 為 1,4-naphthoquinone 上 carbonyl group 的碳原子吸收訊號，δ 160.8 為 C-5 上接 hydroxyl group 之碳原子吸收訊號，δ 56.4 為 C-2 上甲氧基之碳原子訊號。由 13C-NMR 圖譜(Chart 18) DEPT 圖譜(Chart 19)中顯示共有十一個碳原子吸收訊號，其中有一個碳原子訊號是屬於 CH3，為δ 56.4 (2-. OCH3)。有四個碳原子訊號屬於 CH，分別為 δ 135.4 (C-7), 125.1 (C-8), 119.5 (C-6), 109.4 (C-3)。其餘的六個碳原子訊號屬於四級碳，分別為 δ 160.8 (C-5), 190.5 (C-4), 179.1 (C-1), 100.1 (C-2), 130.8 (C-9), 113.9 (C-10)。另外，δ 56.4 為 C-2 上之-OCH3 基之吸收訊號。綜合上述資料與文獻 [43-45] 比對，確認此化合物之結構為. 2-methoxyjuglone（5-hydroxy-2-methoxy-1,4-naphthoquinone）。. 51.

(52) 【五】C-3: mixture of betulinic acid and ursolic acid 29. 30. 20. 29 30. 19. 13 25. 17. 26 14. 10 3 HO. 8. 26. 25. COOH. 17. 27. COOH. 28. 28. 3. 4. 10. 8 27. 4. HO 24. 23. 23. 24. 混合物 C-3 於氯仿層中得到，為白色固體粉末，以氯仿-甲醇再結晶，熔點 285-290 ℃，可溶於 pyridine， TLC 片以溶媒 (CHCl3 ：. EtOAc=7：1)展開後，Rf 值為 0.4，噴 vanillin/硫酸乙醇溶液，加熱後呈色變化為紅色→紫紅色→褐色，推測可能為三萜類化合物。. IR 圖譜(Chart 20)顯示在 3442 cm-1 為 OH 的特性吸收，1738 cm-1 為 carbonyl group 的特性吸收，1454 cm-1 為 CH2 的特性吸收，1366 cm-1 為 CH3 的特性吸收。. MS 圖譜(Chart 21) M+ ( m/z %)顯示分子量為 456，推測分子式為 C30H48O3。. 52.

(53) 1. H-NMR 圖譜(Chart 22)顯示 δ 0.76, 0.79, 0.85, 0.94, 1.20, 1.88 (s). 分別為六個四級碳上甲基之質子訊號，δ 4.60, 4.73 (2H, br. S)為雙鍵上 H-29 之質子訊號；δ 3.49 (1H, m)為 C-3 連接-OH 之次甲基的質子訊號；5.17 (1H, s)為環上雙鍵 H-12 之質子訊號，2.12 (dd)則為 H-18 的質子訊號。 13. C-NMR 圖譜(Chart 23)顯示 δ 150.1, 109.3 分別為環外雙鍵 C-20,. C-29 之碳原子訊號；δ 78.14, 80.71 為帶有-OH 基 C-3 之碳原子訊號； δ 170.6 為 carbonyl group 之碳原子訊號；δ 138.3, 125.4 分別為環上雙鍵碳原子訊號。. 綜合以上光譜資料並與文獻[42,46-48]比對，推測其結構應為 mixture. of betulinic acid and ursolic acid。. 53.

(54) 【六】C-4: β-sitosterol-3-O-glucoside 29 28 22. 21 19 12 13. 18. 5'. 23. 25. 14. 16. 27. 15. 8. 10. 3. O. OH. 7. 5. O 4'. 9. 2. 6'CH2OH. 20 17. 11 1. 26 24. 4. 6. 1'. H HO 3'. 2'. OH. 化合物 C-4 於氯仿層中得到，為白色粉末，以氯仿、甲醇再結晶，熔點 300℃以上，可溶於 pyridine，其 TLC 片經溶媒(CHCl3：MeOH=. 7：1)展開後，Rf 值為 0. 5，噴 10% H2SO4 溶液，加熱後呈藍紫色。 IR 圖譜(Chart 25)顯示在 3410 cm-1 有-OH 基特性吸收，1647 cm-1 及 1446 cm-1 有 CH2 及 CH3 彎角振動之特性吸收，1078, 1024 cm-1 為醚基(C-O-C)之特性吸收。. FAB-MS 圖譜(Chart 26) M+ ( m/z %)顯示 599 (M+ +Na)為分子離子峰，推測分子量為 576，分子式為 C35H60O6。. 54.

(55) 1. H-NMR 圖譜(Chart 27)顯示 δ 5.36 (1H, br)為雙鍵上 H-6 之質子. 訊號；δ 5. 05 (2H, d)為 glucose 上 H-1’之質子訊號；δ 0.61-2.31 (m)為植物固醇特有訊號，δ 3.95-4.53(m)為糖基上質子的吸收訊號。 13. C-NMR 圖譜(Chart 28)顯示δ 140.4 (C-5), 121.5 (C-6)分別為環. 上雙鍵 C-5 及 C-6 之碳原子訊號，δ 79.2 (C-3)為帶有-OH 基的 C-3 之碳原子訊號，δ 102.0, 77.8, 74.7, 71.1, 62.2, 59.9 為 glucose 上之碳原子訊號。綜合以上光譜資料經與文獻 [40] 比對推測其結構應為. β-sitosterol-3-O-glucoside。. 55.

(56) 【七】E-1: astilbin （dihydroquercetin 3-O-rhamnoside）. OH OH. 2' HO. O. 5'. 2. 7. 3. 4. 5 OH. 6' O. O. OH. O. 1''. CH3. OH. OH. 化合物 E-1 乙酸乙酯層中得到，為淡黃色針晶，以甲醇再結晶，熔點 179-181℃，可溶於甲醇，其 TLC 片經溶媒(EtOAc：CHCl3 = 9：. 1)展開後，Rf 值為 0.45，噴 10% H2SO4 溶液，加熱後呈黃色。 IR 圖譜(Chart 30)顯示在 3446 cm-1 為-OH 基之特性吸收， 1646 cm-1 為 carbonyl group 之特性吸收，1608 , 1558 cm-1 為芳香環共軛雙鍵的特性吸收。由 FAB-MS 圖譜(Chart 31)分析測得分子量為 m/z 451 [M+H]+，其斷片碎片 305 [M+H-146]+顯示具有五碳糖基團， FAB-MS 分析其分子式為 C21H22O11[58]。. 56.

(57) 1. H-NMR 圖譜(Chart 32)顯示在 δ 4.64 (dd, J=10Hz）、δ 5.20 (d,. J=10 Hz）為 C-ring 上 H-2, H-3 之訊號；δ 6.17 (d, J=2.0 Hz), 6.37(d, J=2.0 Hz)分別為 A 環上 H-6, H-8 的質子訊號，且彼此間相互遠程偶合形成雙峰；δ 6.89 (d, J = 8.8 Hz), 7.73 ( dd, J = 8.8 and 2.1 Hz), 7.29. ( d, J = 2.1 Hz)為一組 ABX 型式之訊號，將其歸屬為 B-ring 上 H-5’, H-6’, H-2’的質子訊號，其中 H-6’分別與 H-5’有產生鄰位偶合( J = 8.8 Hz)，而與 H-2’產生遠程偶合( d, J = 2.1 Hz)，符合 5, 7, 3’, 4’取代 flavonol 之結構特徵，推測具有 dihydroquercetin 之基本骨架。另外， δ 1.04 （d, J=6.0 Hz, H-6’’)及 δ 3.06-3.96 (m)為糖基上質子的吸收訊號。 13. C-NMR 圖譜(Chart 33)中顯示 δ 194.2 (C-4)為黃酮類之 carbonyl. carbon 吸收訊號，δ163.7 (C-5), 167.3 (C-7), 144.8 (C-3’), 145.6 (C-4’)，分別為帶有-OH 基之 C-5, 7, 3’, 4’的吸收訊號。δ 82.2 (C-2), 76.9 (C-3) 為 C-ring 上碳之吸收訊號。由 13C-NMR 及 DEPT 圖譜(Chart 33, Chart 34)中顯示 1 個甲基. (CH3)，12 個三級碳(CH)及 8 個四級碳(C)等 21 個碳原子訊號。. 57.

(58) Table 5-3:化合物 E-1 碳譜數據與文獻[49-50,54]astilbin 碳譜數據比對表 δc of E-1 δc of literature data 82.2 81.48 76.9 75.6 194.2 194.3 163.7 163.4 95.97 96.06 167.3 167.23 94.85 95.11 162.38 162.14 100.75 100.68 B 環上的碳 C-1’~C-6’ C-1’ 127.0 126.97 C-2’ 113.94 114.72 C-3’ 144.83 145.10 C-4’ 145.67 145.90 C-5’ 114.93 115.31 C-6’ 118.93 118.88 C 環接鼠李糖 C-1’’~C-6’’ C-1’’ (anomeric carbon) 100.48 100.02 C-2’’ 70.50 70.39 C-3’’ 70.13 70.10 C-4’’ 71.59 71.62 C-5’’ 68.90 68.95 C-6’’ 16.28 17.73 No. of C C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10. 綜合上述資料並與文獻 [49-50,54] 比對，推測此化合物結構應為. astilbin（dihydroquercetin 3-O-rhamnoside）。. 58.

(59) 【八】E-2: kaempferol 3-O-rhamnoside 3'. OH. 2' HO. O. 5' 2. 7 4. 3 O. 5 OH. 6'. O. OH. O. 1''. CH3. OH. OH. 化合物 E-2 乙酸乙酯層中得到，為黃色粉末，以甲醇再結晶，熔點 172-174℃，可溶於甲醇，其 TLC 片經溶媒(EtOAc：CHCl3 = 9：. 1)展開後，Rf 值為 0.5，噴 10% H2SO4 溶液，加熱後呈黃色。 IR 圖譜(Chart 35)顯示在 3307 cm-1 為-OH 基之特性吸收， 1660 cm-1 為 carbonyl group 之特性吸收，1614 , 1496 cm-1 為芳香環共軛雙鍵的特性吸收。由 FAB-MS 圖譜(Chart 36)分析測得分子量為 m/z 435 [M+H]+，其斷片碎片 289 [M+H-146]+顯示具有五碳糖基團， FAB-MS 分析其分子式為 C21H21O10[58]。. 59.

(60) 1. H-NMR 圖譜(Chart 37)顯示在 δ 6.16 (d, J=2.0 Hz)、 6.36 (d,. J=2.0 Hz)分別為 A 環上 H-6, H-8 的質子訊號，且彼此間相互遠程偶合形成雙峰；δ 7.74 ( d, J = 8.8 Hz, H-2’ and H-6’)及 δ 6.90 (d, J = 8.8. Hz, H-3’ and H-5’)有偶合關係，分別為 B-ring 上 H-2’, H-6’及 H-3’, H-5’之吸收訊號，為一對 A2X2 型式之芳香族訊號，符合 5, 7, 4’取代 flavonol 類之結構特徵，推測具有 kaempferol 骨架。另外，δ 0.78 (d, J=6.0 Hz, H-6’’)及 δ 3.09-3.96 (m)為糖基上質子的吸收訊號。 13. C-NMR 圖譜(Chart 38)中顯示 δ 177.8 (C-4)為黃酮類(flavonoids). 之 carbonyl carbon 吸收訊號，δ161.4 (C-5)，164.9 (C-7)，160.1 (C-4’)，分別為帶有-OH 基之 C-5, 7, 4’的吸收訊號。δ 130.8 (C-2’), 130.8 (C-6’) 及 115.6 (C-3’), 115.6 (C-5’)為 B-ring 上碳之吸收訊號。δ 99.0 (C-6),. 94.0 (C-8)為 A-ring 上碳之吸收訊號。另外，δ 156.7 (C-2), 134.3 (C-3) 為 C-ring 上碳之吸收訊號。由 13C-NMR 及 DEPT 圖譜(Chart 39, Chart 40)中顯示 1 個一級碳. (CH3)，11 個三級碳(CH)及 9 個四級碳(C)等 21 個碳原子訊號。. 60.

(61) Table 5-4:化合物 E-2 碳譜數據與文獻[49-50]kaempferol 3-O-rhamnoside 碳譜數據比對表. δc of E-2 δc of literature data 156.7 156.16 134.3 133.17 177.79 177.38 161.42 161.19 99.04 98.77 164.94 164.52 94.00 93.68 157.73 156. 41 104.10 103.84 B 環上的碳 C-1’~C-6’ C-1’ 120.70 120.89 C-2’ 130.75 130.84 C-3’ 115.57 115.07 C-4’ 160.15 159.91 C-5’ 115.57 115.07 C-6’ 130.75 130.84 C 環接鼠李糖 C-1’’~C-6’’ C-1’’(anomeric carbon) 101.88 102.5 C-2’’ 70.5 71.6 C-3’’ 70.8 72.3 C-4’’ 71.3 73.2 C-5’’ 70.3 71.4 C-6’’ 17.5 17.8 No. of C C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10. 綜合上述資料並與文獻 [49-50] 比對，推測此化合物結構應為. kaempferol 3-O-rhamnoside。. 61.

(62) 第二節. 臺灣黃杞之藥理活性試驗討論. 一、細胞毒殺活性試驗 Table 4-1、Table 4-2 顯示，以 MTS 分析法試驗臺灣黃杞各萃取層之細胞毒殺活性，結果發現臺灣黃杞樹皮部之甲醇抽出物及各種有機溶媒萃取層中，以正己烷層及氯仿層對 NUGC-3 及 HONE-1 兩種癌細胞具有明顯抑制作用；而在莖部之甲醇抽出物及各種有機溶媒萃取層中，以正己烷層及氯仿層對 NUGC-3 癌細胞具有明顯抑制作用。由此推測臺灣黃杞之細胞毒殺活性成分可能屬於中低極性之物質。而本研究由臺灣黃杞樹皮部之氯仿層分離所得之萘醌類化合物，. 2-methoxyjuglone，據文獻報導其對於人類肺癌(A549)及大腸癌細胞 (HT-29)具有抑制作用[44-45]，顯示以活性引導成分分離之方式確實可行。. 二、抗氧化活性實驗. 依 Shyu YS (2002)等之方法，以 DPPH 自由基清除能力之試驗，測試臺灣黃杞樹皮部各萃取層，發現臺灣黃杞樹皮部之甲醇粗抽物、正丁醇層、乙酸乙酯層及氯仿層、具有顯著的抗氧化活性。顯示黃杞之化學成分中含有具抗氧化能力之活性成分。因此以抗氧化能力為活性指標，由乙酸乙酯層中得到二個具有抗氧化活性之黃酮類化合物，. astilbin, kaempferol 3-O-rhamnoside，顯示以活性引導分離之方式相當可行，而其他各萃取層之活性成分仍有待進一步追蹤。. 62.

(63) 第六章. 結. 論. 臺灣黃杞 (Engelhardtia roxburghiana Wallich)之樹皮部經乾燥、萃取後，以細胞毒殺活性及抗氧化能力為活性指標，使用管柱層析分離並再結晶純化，結果由正己烷層、氯仿層、乙酸乙酯層中共得到七個化合物及一個混合物：. 1. Steroid： β-sitosterol (H-1), β-sitosterol 3-O-glucoside (C-4). 2. Fatty acid： tetracosanoic acid (H-2) 3. Triterpene： betulinic acid (C-1) mixture of betulinic acid and ursolic acid (C-3) 4. 1,4-naphthaquinone： 5-hydroxy-2-methoxy-1,4-naphthaquinone (C-2) 5. Flavonoids： astilbin (dihydroquercetin 3-O-rhamnoside) (E-1) kaempferol 3-O-rhamnoside (E-2) 其中，β-sitosterol 3-O-glucoside（固醇類），tetracosanoic acid（脂肪酸），betulinic acid，mixture of betulinic acid and ursolic acid（三萜，kaempferol 3-O-rhamnoside（黃酮類），2-methoxyjuglone（萘醌類）類）化合物皆為黃杞屬首次發現之成分。. 據文獻記載萘醌類化合物，2-methoxyjuglone 對於人類肺癌(A549) 及大腸癌細胞(HT-29)具有抑制作用[44-45]。黃酮類化合物 astilbin，具 63.

(64) 有抗氧化、改善實驗性肝損傷及抑制醛糖還原酶的作用 [51-57,59-60] ；. kaempferol 3-O-rhamnoside. [56,59-60]. 則具有抗氧化的作用。以上皆為活. 性成分，顯示以活性引導成分分離的實驗方法相當可行。. 臺灣黃杞為臺灣之常見民間藥，樹皮有行氣，化濕，健脾，導滯，消食之效。治黃疸病，小兒疳積，妊娠嘔吐。葉有清熱，解毒，止痛之效。治脾胃濕滯，胸腹脹悶，濕熱瀉泄，疝氣腹痛，感冒發熱。而本研究分離所得之活性成分，若針對固有民間用法，再進一步進行藥理活性確認，將使臺灣黃杞的使用上更具意義，並有助於本土藥用植物的開發。. 64.

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