2010 年第廿一屆國際生物奧林匹亞競賽一實驗試題(3)

(1)

一實驗試題 (3)

中華民國生物奧林匹亞競賽代表團

實驗三:遺傳學與細胞學

總分﹒ 50 分可用時間: 90 分鐘第一大題植物與昆蟲的共同演化( 35 分) 本試卷包含兩大題第一部分敢動子與基因表現之調控研究 (20 分) 第二部分描述並比較基因型與表現型的關像(1 5 分) 【材料與儀器】個人設備列表 I. 螢光分光光度計

2.

9 支微量離心管，內含 SOuL 分別已經標識不同植物來源之萃取液。每一種各有兩支。 (2X9=18 支)。透明的微量離心管適用於蛋白質濃度測定，深色的微量離心管適用於螢光測定。標籤處理標籤處理

WT-O

Plant WT

+

distilled water

Plant WT

+

IμM

hormone H

WT-I

WT-IOO

Plant WT

+

100μM

hormone H

植物(激素 H)

dA-I

Plant dA

+

IμM

hormone H

dA-IOO

Plant dA

+

100μM

hormone H

dAB-I

Plant dAB

+

IμM

hormone H

dAB-IOO

Plant dAB

+

100μM

hormone H

dABC-I

Plant dABC

+

jμM

hormone H

dABC-IOO

Plant dABC

+

100μM

hormone H

3. 一支 15 mL 塑膠管內裝 12 mL 的 Bardford 溶液 (Bardford 溶液可以用來測定蛋白質濃度)

4

一支微量離心管內裝人 I mL 的 I

mM

MUG 溶液 (MUG 是一種螢光受質，可以

用來測量 GUS 的活性)

(2)

54-2010 年第廿一屆國際生物奧林匹亞競賽一實驗試題(3)

5. 一支 15 mL 塑膠管內裝 12 mL 的 GUS 終止液 (GUS 是一種 glueronidase

酵素，可將 MUG 轉化成 MU)

6.

2 支 DNA 片段大小標記管(標記 M' 各有 50μL)

,

8 支含有 EeoRI 處理過的 DNA 片段(標記為 PI~P8 '各有 50μL)

7

有 2 支微量離心管分別標記為 GUS BL 與 Pro BL 。 8. 三支微量吸管(兩隻可調整刻度，分別為 10-100μL 與 100-1000μL 。一支為固定刻度， 20μL) 9. 黃色微量吸管頭 i 盒(可供 10-100μL 與固定刻度 20μL 微量吸管使用) 10. 藍色微量吸管頭 l 盒(可供 100-1000μL 微量吸管使用)

I

I.

DNA 電泳設備。內含 1% 瓊脂膠體，與 IX TAE 電泳緩衝液。如果膠體有破裂不全，舉手告訴你的助教。 12. 微量吸管放置架。 13 橡膠手套。 14.25 支比色管用於螢光分光光度計用。 15. 計算機、計時器、膠帶、裝有冰塊的冰桶、微量離心管管架、綠色卡片共同儀器列表 I. 含有 UV 光的膠體分析設備微量吸管使用法固定刻處可圖撞到處 1 2 3 4 德磁盧 Display 調度顯示 Plunger 于藍縛 n~“tor 吸管頭退出用 10-100μL 100-1000μL 20μL

faed

n~older Iii管國連披處調整模式﹒利用推桿順時針或逆時針旋轉調整所需要的體積。可於刻度顯示處看到所需刻度。每支微量吸管適用的體積被標記在刻度處顯示下方，請注意要超過適用範間。

(3)

Display

window

AQOB

使用方法: I) 確實將吸管頭與微量吸管連接緊密，將推桿壓到第一段處。 2) 將吸管頭移到液面下約 2-4mm 處。輕輕放開推桿，讓他回到待機處。 3) 將吸管頭移到所要添加的試管中，先將推桿壓到第一段，再用力壓到第二段處，直到液體完全離開吸管頭為止。 4) 將吸管頭移開，利用吸管退出用按鈕將吸管頭退出。螢光分光光度計操作說明(測量 MU 噎光與蛋白質測量 1595 om 吸光值])

A: Cuvette holder for protein measurement

蛋白質測量a

B: Cuvette holder for fluorescence of

MU

measurement

MU 聾先測量a

FCT: Function key

功龍鐘

BL:

Bl

ank key

空白.

TS: Test sample key

測量鐘

PWR Power key

闖闖重要事項:不要觸碰到比色管的光路徑。

1

)壓下電源闖關【 PWR( e»】，敢動機器。顯示螢幕會在嗶聲後顯示。 2) 為了要進行歸零，要將空白的比色管插人正確的位置(蛋白質濃度在左邊 A 處 'GUS 活性測量在右邊 B 處)。使用比色管的狀態會顯示在螢幕上(前為 A' ?為 B) 注意:歸零所使用的樣本分別放在不同的微量吸管中。 GUS BL 為 GUS 活性測定歸零用， ProBL 為蛋白質濃度歸零用。 3) 壓下空白鍵 (BL) ，此時螢幕會顯示 U 符號，耐心等待，直到數字出現為 0.0 為止。 4) 為了要測量樣本，移出空白的比色管，插人待測的樣本比色管。(蛋白質濃度在左邊 A 處， GUS 活性測量在右邊 B 處)。壓下測量鍵 (TS) 。此時螢幕會顯示，符號，耐心等待，直到數字出現為J止。 5) 欲關機時，持續按下開關鍵 (PWR) ，直到嗶聲出現即可。 DNA 膠體電泳操作說明 I) 使用固定刻度微量吸管 (20μL) 添加樣本。 “ 56

(4)

-2010 年第廿一屆國際生物奧林匹亞競賽一實驗試題(3) 2) 確認開關( e»是在 OFF' (如下圓)後。關上蓋子。

O

FF

3) 如下園，將伏特 (VOLTAGE) 調整到 HALF (左邊) 4) 按下操作開關開始遷移 5) 如下園，按下開關，開始電泳。

L

6) 本實驗中，當電泳時間達到 30 分鐘時，即可將電源關閉。第一部分使用己融合 GUS 報導基因之 X 基因進行激素對基因表現的影響，並分析歐動子中激素反應單元的特性 (20 分) 植物對於激素的反應是依靠激素反應基因進行。在基因的敢動子位置，一段被稱為 CIS -單元的 DNA 序列會反應基因表現的調控時間與表現量。基因調控受制於該區

(5)

域是否受到激素反應轉錄因子的活化或抑制。本試題單元，將檢視阿拉伯芥中的激素，透過基因反應途徑對 X 基因的調控。為找出歐動子中激素反應之區域以了解 X 基因受激素調控之模式，吾人把 X 基因的歐動子位置分別區分成 A-C 三種(其中分別代表三種功能型式，增強者，沉默者與最少表現者的敢動子) 如下圖所示，能表現 GUS

(/3

-glucuronidase) 報導基因之 X 基因植人不同的基因轉植植物阿拉伯芥中，來代表上述的三種不同功能。當 X 基因被活忙時， GUS 便能被表現出

來。而 GUS 又可以將 MUS 轉化成 MU' 此時利用螢光分光光度計檢測 MU 的螢光量便

可得知 X 基因的活性。帶有四種不同方式構築之報導基囚的基因轉植阿拉伯芥問題 1 (3 分) 第一個實驗有兩種目的: (I) 找出含有激素反應 c旬，單元的歐動子區域，

(2)

研究不同濃度的激素 H 對 X 基因表現的影響。所有的轉植基因植物(WT，

dA

,

dAB 與 dABC) 己分別處理過濃度為 l μM 或 100μM 的激素 Ho 並萃取植物萃取物用以評估 GUS 的表現量， (萃取物處理方式參考材料與方法的表格) 利用下節敘述的方法，分別測量 50μL 植物萃取物的螢光吸光值與 595

om

的吸光值。根據測量的結果，分別計算每個萃取物中的MU 的含量 (nillole M U/50μL 植物萃取液) ，蛋白質濃度 (μg/50μL 植物萃取物)與 GUS 活性 (omole MU/μg protein/min) 。並將結果記錄於答案紙的<表一〉中，並依序回答Q I. I ， Q I. 2 與 Q 1. 3 。測量螢光與 MU 的含量

1

)-1 打開螢光分光光度計開關，取出 500μL 標記為 GUS BL 的樣本進行螢光歸零。 1)-2 各取一支新的微量離心管，依序分別加人 50μL 標記為 WT-O 【 WT-O 為第一管，其他管順序則依表中順序添加】與材料表格中所列經激素處理過

58

(6)

-2010 年第廿一屆函際生物奧林匹亞競賽一實驗試題 (3) 後的基因轉植植物萃取液，加人 50μL 的 1

mM

MUG 溶液。輕彈離心管辟，且且退盒上述兩種溶液。混合好的的樣本置於冰上保存，直到所有樣本處理完畢後，再進行下一步驟。

1

)-3 在室溫下培養上述混合樣本，反應時間為 10 分鐘，必須精準。

1

)-4 加人 900μL 的終止液 (1M 碳酸鋪在 GUS 萃取液中)【 WT-O 為第一管，其他管順序則依表中順序添加】。輕彈離心管壁，且且還盒上述兩種溶液。

1

)-5 分別自上述混合溶液中各取出 500μL' 以螢光分光光度計測量螢光含量。

1

)-6 利用下列公式計算 MU 的含量。將螢光讀數記錄於答案紙中的〈表一>，並用它來計算 MU 的含量。每個數值分別代表 50μL 植物萃取物所產生的 MU 量。

Y

=

0.04 X

+

2.5

y:植物萃取液中 MU 的產生量 (nmoles 50μL 植物萃取液) X: 步聽 1 )-5 中所測得的螢光量。以 595 nm 吸光值測量蛋白質含量 2)-1 打開螢光分光光度計開關，取出 500μL 標記為 Pro BL 的樣本進行歸零。 2)-2 各取一支新的微量離心管，分別依序加入50μL 標記為 WT-O 或是材料表格中所列經激素處理過後的基因轉植植物萃取液，加人950μL 的 Bradford 溶液。輕彈離心管壁，且且還盒上述兩種溶液。將混合好的的樣本於室溫下反應 5 分鐘。 2)-3 分別自上述混合溶液種各取出 500μL' 以螢光分光光度計測量 595 om 的吸光值。 2)-4 利用下列公式計算蛋白質的含量。將595 nm 吸光值記錄於答案紙中的〈表一>，並用它來計算蛋白質的含量。每個數值分別代表50μL 植物萃取物蛋白質含量。

Y

=

98X

+

2.8

y:混合物中蛋白質的含量 (μg/50μL 植物萃取液) X: 步驟 2)-3 中所測得的 595 nm 吸光值。 GUS 活性計算

3)-1

此酵素反應時間為 10 分鐘(參考步驟 1)-3 )。利用<表一〉中所記錄的結

果，計算 GUS 活性，單位為 nmole MU/μg protein/min 。注意<衰一〉分數為 9 分。

(7)

問題1. 1 (4 分) 根據〈表一>的結果，在問題1. 1 的表格中，正確處打勾( v")。注意:刺激反應 :x 基因表現量達 3 倍或以上。無反應 :x 基因表現量 3 倍以下。問題1. 2 (6 分) 根據問題1. 1 的結論，推論出 cis- 單元 (A-C) ，分別隸屬於何種調控功能(增強者，沉默者與最少表現者)。在問題 1.2 的表格中，正確處打勾( v")。問題1. 3 (1 分) 100μM 濃度的激素 H 處理下 ·x 基因的表現調控為何?根據〈表一>的發現，決定激素 H 的作用模式。在問題1. 3 的表格中，正確處打勾( v")。第二部分基因型與表現型相關分析，並利用哈溫定率計算基因池中的基因頻率。 (15 分) 植物對於激素的反應是依靠激素反應基因進行。在基因的歐動子位置，一段被稱為 cis -單元的 DNA 序列會反應基因表現的調控時間與表現量。基因調控受制於該區域是否受到激素反應轉錄因子的活化或抑制。問題 2 y 基因會表現一轉蛋白調節植物生長。下圖為基因體 DNA 中 Y 基因的區域，其中含有一個點突變。

1.0 kb

0.6 kb

揖

區

因

基

4.Y

J 制|圖

n

。

nM-e

VE V'

e

n

e

G

0.4 kb

GGATTC

Point mutation

點突變

GAA TTC

(EcoRI

recognition site)

EcoRI 種單位置

(8)

60-2010 年第廿一屆國際生物奧林匹亞競賽一實驗試題 (3)

現有 8 種可能為同型合子 (YYandyy) 或異型合子 (Yy) 基因型之植物，分別表現出野生型與矮莖型之表型 (Y: 野生型對偶基因， y: 突變型對偶基因。並未特指出 Y 或 y 是顯性或隱性)。為了分析這些植物的基因型，利用 PCR 技術放大 Y 基因 l

kb 片段。這些片段分別以 EcoRI 限制臨切割，因為 EcoRI 會認識 GAATTC 序

列並切割，且在此片段中並沒有起其它的 EcoRI 切點。利用下列步聽，進行電泳並分析 EcoRI 切割 PCR 產物的實驗。利用電泳進行 Y 基因的基因型轍測注意:全程都要戴上手套操作!!! (I) 全部共有 10 支樣本，分別裝在微量離心管中。兩支 DNA 大小片段標記管

(M)

， 8 支分別來自不同植物，並含有 EcoRI 處理過的 PCR 產物樣本(分別標記為 P

I

~P8) 。由左邊開始，依序加人樣本 M ， P 卜P8 ， M 。每個樣本各取出 20μL ，利用固定刻度微量吸管，依照上面的順序，分別加入已經準備好的瓊脂膠體中的樣本槽中。注意每個樣本都要換新的微量吸管頭。注意: DNA 大小片段標記分別為 0 .4， 0.6 與1. 0

kb

0 DNA 注人緩衝液與 DNA 染料已經在每個微量試管中添加完畢。 (2) 參考 DNA 電泳操作步駝，將蓋子裝上電泳槽，打開開關，開始進行電泳。注意:電泳開始時，請注意輸出 (output) 的指示燈是亮的，同時要有氣泡在白金電極處生成。 (3) 電泳時間為 30 分鐘，電壓為 HALF 。注意:電泳開始時，請注意輸出 (output) 的指示燈是亮的，同時要有氣泡在白金電極處生成。注意:電泳進行時，請回答第二大題!!! (4) 電泳完成後，關掉開關。舉起綠色卡片請求協助進行膠體拍照。注意:助教會帶來一個膠體移轉盒，要確認你的學生編號要在盒子上。 (5) 當你收到你的膠體照片，利用膠帶將它貼在答案紙 Q2.1 位置上。並將 Pl~P8 的位置標示清楚。 (6) 在答案紙問題 2.2 有出現與 DNA 大小片段標記相同位置正確處打勾(

v")

問題 2.1 (3 分) 在答案紙問題 2.1 處貼上電泳照片。並標示出 Pl~P8 的位置。

(9)

問題 2.2 (4 分)

分別確認每種植物基因 Y 的 DNA 片段大小，與基因型 (YY， Yy 或 yy) 。在答案紙問題 2.2 中正確處打勾( v'")。問題 2.3 (2 分) 根據問題 2.2 基因型與表現型的說明，推論突變的特性。答案紙問題 2.3 中正確處打勾 (v'") 。問題 2 .4 (2 分) 將植物 l 與植物 3 進行雜交(根據問題 2.2) ，子代中矮莖的比例為若干?將正確答案填人答案紙中。問題 2.5 (3 分) 問題 2.2 中的 8 種植物代表一種族群，如果這個族群產生 10 ， 000 子代，則異型合子而且是矮莖的子代比例為若干? (前題是這個族群是在哈溫平衡狀態) 第二大題觀察固定過的裸麥花粉囊中減數分裂細胞( 15 分) 【材料，器械與工真】

l

光學顯微鏡，物鏡倍率分別為 4X ，

lOX

,

40X ，與 100X 各 l

2

裝有固定過的裸麥花粉龔小瓶 2 個 3. 探針 l 組

4

載玻片與蓋玻片各 5 個 5. 直徑 7 公分濾紙 3 張 6. 攝子 l 支、磁磚 l 個、 6 公分培養血 l 個、酷酸洋紅溶液附滴管 l 支、鉛支、橡皮擦 l 個、拋棄式塑膠滴管 l 支、紅色卡片 l 張【背景說明】利用光學顯微鏡觀察裸麥花粉囊中的減數分裂細胞。花粉囊是減數分裂中的特定階段。花粉囊已經保存在 70% 酒精中。【必需品-回顧】利用顯微鏡觀察減數分裂中的花粉細胞。利用問題 3.2 的範間內，繪出在 400X 放大倍率下的減數分裂細胞。

-

(10)

62-2010 年第廿一屆國際生物奧林匹亞競賽一實驗試題(3) 【步歸】 I) 實驗進行前，先確認瓶中裝有 2 個花粉囊檢體。 2) 自托盤中取出磁磚，將載玻片放在上方。 3) 在 100X 的放大倍率下，找到至少 1 個正在進行減數分裂的細胞。將倍率換到 400X' 觀察並繪製 1 個減數分裂細胞，確認該細胞在視野的正中央，觀察結果並繪製在問題 3.2 的範圍內。當你繪製完成後，舉起你的紅色卡 H ，助教會過來幫你拍照。 (1)

e

Invertthe 叮且1 ∞n凶訂立ngtwo preserved anthE!l"s2·3 位meso

Then,gently pour thevi且linω

a small petri dish.

來回翻轉 2-3 次含有

花樹聾的小海﹒之後

將它們倒入培養血中 (5)

va

Squash the anther with

diss“位n~needles for 1-2 minTake out debris (such as anther wall cells) with forceps by touching it

onωthefilter paper.

~~de主食

Take one anther out of

pert.idisb with forceps and put it on a slide gloss.

取出 1 個花粉轟﹒放在單破片上 (6) 海紙 filter paper

三斗

蓋玻片

L-.

co

竺

lip ~

一(:I:

Put one drop ofacetοcarmrne

solutiononωtheanther. 吸取 1 滴醋酸洋紅﹒

滴在花粉蠹上 (8)

:over the squashed cells with a∞，versl.ip

Put a filter paperonω

the slide glass∞vered

with a cover slip

Gently press the filter paper Observe your slide down with your thumb. specimen under

the microscope. 利用拇指輕壓蓋玻片蓋上蓋玻片後﹒再放上通緝﹒過紙要蓋過蓋破片

於顯微鏡下觀

察結果利用探針來自擠壓在輸車制 1-2 分鐘﹒ 移除雜貨(利用自矗子夾出﹒並宣於濾輯上) 觀察由定過的裸參花粉囊中減數分裂細胞之實驗;炙手呈【注意事項】 l.步聽 (I) 中，如果花粉聽沒有倒出來，將溶液裝回瓶中，利用拋棄式塑膠滴管將花粉囊吸出。

2

注意，不要在步聽 (2) 時將花粉囊捏破。 3. 步聽 (3) 時可以使用濾紙將過多的 70% 酒精吸除。 4. 步聽 (7) 時，不要壓得太猛，不然會將細胞壓破，不然就是壓破蓋玻片。

(11)

5. 每個人有兩個花粉囊，如果第一個沒有做的很好，得到好的影像，重複上述步聽再操作一次。注意，你的實驗有時間限制。問題 3 (2 分) 回答下列問題。 *特別注意:你將會在顯微鏡下看到兩種細胞型態，圈起來的是減數分裂細胞，其他的是花粉囊壁細胞。

4α)X

圖問題 3 :顯微鏡下觀察到的減數分裂細胞範例。問題 3.1 (1 分) 在花粉囊中哪些細胞會進行減數分裂?在答案紙中正確處打勾(v")。問題 3.2 (8 分) 將倍率換到 400X' 觀察並繪製 1 個減數分裂細胞，圖上不要做任何的標記。重要事項:拍照時，必須確認該細胞在視野的正中央。

-

(12)

64-2010 年第廿一屆國際生物奧林匹亞競賽一實驗試題(3) 問題 3.3 (4 分) 你觀察到的細胞位於減數分裂週期的哪個階段?在答案紙中正確處打勾 (vi，> 。問題 3.4 (2 分) 你觀察到的細胞在減數分裂週期中， DNA 含量為若平?花粉囊壁細胞的 DNA 含量為若干?在答案紙中正確處打勾(，/)。 (待續)