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N-(羥基苯)多羥基苯醯胺化合物在抑制過氧化氫及酪胺酸酶活性能力之研究

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Academic year: 2021

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N-(羥基苯)多羥基苯醯胺化合物在抑制過氧化氫及酪胺酸酶活性能力之研究

張嘉苓1、楊朝成2 1敏惠醫護管理專科學校 美容保健科 2嘉南藥理科技大學 化粧品應用與管理系 Email:chialing25@yahoo.com.tw

摘 要

本實驗透過簡單的合成步驟合成一系列多酚醯胺類化合物(1~40),將不穩定的亞胺類結構,改為較具穩定 性、極性、高化性、且不受pH 值影響的醯胺類結構,再將所合成出來的多酚醯胺化合物透過抑制酪胺酸酶酵 素活性及過氧化氫的活性測試,進而篩選出具有抗氧化功效的多酚醯胺類化合物。其抗氧化能力以超微弱冷 光技術BJL 評估,藉以測試清除過氧化氫活性能力,並與 Trolox(水溶性維他命 E)做比較;而對於抑制黑色素 生成之效果,透過抑制酪胺酸酶活性的測試,並與L-Ascorbic acid(維生素 C)和 Kojic Acid(麴酸)做比較。研 究結果發現,多酚醯胺化合物的抑制能力好壞主要取決於苯環上羥基的取代數目,羥基數越多其抑制過氧化 氫及酪胺酸酶酵素的能力越好

關鍵詞:多酚醯胺、過氧化氫、酪胺酸酶酵素、活性

1. 前 言

人體在代謝過程中,往往需要靠著氧的參與來維持生物體內的正常運作,在這過程當中,就會產生許多 的活性氧物質ROS (Reactive oxygen species),也就是所謂的自由基。而造成人體老化的成因非常之多,其中 又分為外在因素及內在因素,而這些因素都跟自由基有關[1]。過量的過氧自由基會阻礙人體酵素活性的下降、 DNA 退化、細胞膜受損及多醣類的代謝異常等傷害與光老化現象[2],進而破壞免疫系統的正常運作,導致各 種細胞的病變。雖然生物體內本身就存在著保護系統以維護體內各部位之正常運作,如人體本身存在一套可 消除過量自由基的酵素型抗氧化保護系統,以避免人體過量產生自由基現象,如過氧化物歧化酵素(Superoxide dismutase,簡稱為 SOD)、過氧化氫酵素(Catalase)、穀胱甘汰過氧化酵素(Glutathione peroxidase)、過氧化酵 素(Peroxidase)等,讓體內的自由基維持在一種動態的平衡中來達到對細胞 DNA 的保護作用[3],以及非酵素 型抗氧化保護系統如藉由外界補充具有抗氧化物質如:glutathione、Vitamin A、Vitamin C、Vitamin E、 flavonoids、Zn、及輔酶 Q10 等物質,以輔助體內抗氧化系統,來避免這些氧化所帶來的病變產生。 此外,皮膚是人體的最大器官,也是與外界接觸的部位,然而長期暴露在自由基中,皮膚上的脂質就會 與氧反應,而產生脂質氧化的現象,當過量脂質氧化,就會累積在我們皮膚中,而導致皮膚脂質過氧化而產 生變化,雖然皮膚也存在著抗氧化酵素系統,來幫助我們消除體內過量的活性氧自由基,並且也可以同時對 抗紫外線及污染所帶來的氧化壓力,然而也可以透過飲食方式來攝取抗氧化物質,但由於從飲食方面攝取抗 氧化量有限,經常因為消化吸收後,運送到皮膚的含量非常微弱,因此為了增加皮膚的抗氧化量,添加抗氧 化劑成分在化粧品中還是對皮膚有幫助的。 目前開發抗氧化原料的研究走向,多數從天然植物中萃取出多酚類(PolyPhenols)化合物為主,而存在植物 和蔬菜中的天然抗氧化成分種類繁多如:類胡蘿蔔素(carotenoids)、硫醇(thiols)、兒茶素(Catechins)、類黃酮 (flavonoids)、多酚類(polyphenols)、維生素(Vitamins):ascorbic acid、tocopherols 等,都具有其抗氧化效果[4-5], 目前在天然的抗氧化物中,具有較低毒性的優點,但因為來源取得不易、成本昂貴、不易純化,後製處理較 ©2010 National Kaohsiung University of Applied Sciences, ISSN 1813-3851

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為複雜且費時加上成分相當不穩定等缺點。因此,利用合成技術製造之抗氧化劑依然佔有市場的重要一席之 地,過去已證實了複合式的飲食中具抗氧化活性,另外,在各種化學、生物、和電化學的評估方式下,也已 經證實多酚類的化合物具有很強的抗氧化與清除自由基的活性[6],而對於從天然的實材中去找尋其有效成 分,由於取得不易加上品質又難控管,所以利用合成方法生產之原料,透過合成技術普遍運用在工業上當作 抗氧化添加物[7],因此,本研究希望透過有機合成製備一系列多酚類化合物,探討其在抗氧化及抑制黑色素 生成能力,進而研發出抗氧化原料。

2. 實驗方法

2.1 N-(羥基苯)-多羥基苯醯胺化合物製備 分別取原兒茶酸、胺基苯酚、HOBt (1-hydroxybenzotriazole),加入無水四氫呋喃(THF)於室溫下攪拌,最 後再加入DCC (N, N’-dicyclohexylcarbodiimide)於四氫呋喃(THF)中溶解,攪拌反應過夜。隔天再加入原來胺 基苯酚三分之一量於反應瓶中,置放過夜。用TLC 檢視反應結果(以 50% EtOAc/n-Hexane 為展開劑),確定產 物反應完成後,先將固體濾掉,濾液用減壓濃縮機濃縮,並加入蒸餾水再用乙酸乙酯萃取,合併有機層加入 飽和食鹽水(brine)處理,再以無水硫酸鈉進行乾燥,過濾,減壓濃縮後,經 60 M 的 silical gel 進行管柱層析 純化(以 50 % EtOAc/n-Hexane 為沖提劑),再以1H 及13C NMR 鑑定結構,得到一系列高產率之多酚醯胺化產

物(1~40),其反應如圖 1 以及與各結構式如表 1 所示。

表 1 N-(羥基苯)多羥基苯醯胺化合物(1~40)結構式

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2.2 抑制過氧化氫活性測試 本測試套組系列,包含過氧化氫啟動試劑,以及冷光產生之特異探針。當過氧化氫與探針作用後,產生 之超微弱冷光,以超微弱冷光儀偵測過氧化氫。當超微弱冷光儀之計數達平衡時(約 10-15 分鐘後),加入欲測 試樣品溶液,若該樣品有清除過氧化氫的能力,則冷光之計數會急速下降。藉由添加不同劑量測試樣品對產 生冷光值之變化來計算抑制過氧化氫能力及計算其IC50值,以評估樣品的抑制過氧化氫能力。 首先將已配置好的過氧化氫第Ⅰ劑(Luminol)、第Ⅱ劑(pH 7.3 PBS)、第Ⅲ劑(1.2 % H2O2),分別加入於 BJL 超微弱冷光儀之石英測量杯內充份混合均勻,放入儀器測定冷光值(約 600 秒),當冷光值達平衡後,再取 5mg 樣品與去離子水配製成濃度10 μg/ml,將 10 μg/ml 樣品中取 10 μl 加入試劑中,觀看冷光值的變化,等冷光再 達平衡後,記錄其冷光值,分次再加入10 μl 相同劑量之樣品,觀察再度下降之冷光值,並記錄之,測試步驟 重覆四次,求出四次的抑制率(百分比%),再分別計算出其抑制過氧化氫能力之 IC50值。並且以水溶性維他命 E(Trolox)為正相(+)作對照,觀察多酚醯胺化合物彼此間抑制過氧化氫活性能力的差異性。抑制過氧化氫能力 之計算方法如公式(1)所示。 過氧化氫抑制能力

(%)

=

1

×

100

%

initial initial

A

A

A

(1) 2.3 抑制酪胺酸酶活性活性測試 首先取多酚醯胺化合物(1~40)與 DMSO 溶液,加入酪胺酸酶酵素(Enzyme)PBS 溶液,配製成總體積 1000 μl;最終濃度分別為 10、20、60、150、200 μg/ml 之 DMSO 溶液的測試濃度,分別測試其不同濃度下樣品對 抑制制酪胺酸酶活性。扣色組含樣品及 PBS 磷酸緩衝液,但不加酪胺酸溶液,其餘步驟相同。在控制組(+) 方面則不加待測樣品;空白組(-)則不加酪胺酸酶酵素(Enzyme) PBS 溶液,另外以維生素 C(Vit.C)和麴酸(Kojic acid)作為本實驗對照組。溶液配製完成後,量測在 540 nm 之吸光值,每次測試皆重覆三次。再算出抑制率, 將求出多酚醯胺化合物抑制制酪胺酸酶活性之IC50濃度。酪胺酸酶抑制活性之計算方法如公式(2)所示。 Tyrosinase 抑制活性

(%)

(

)

(

)

100

%

2 1 4 3 2 1

×

=

A

A

A

A

A

A

(2) A1:控制組540 nm 之吸光值 A2:空白組540 nm 之吸光值 A3:樣品540 nm 之吸光值 A4:扣色組540 nm 之吸光值

3. 結果與討論

3.1 抑制過氧化氫活性測試 如圖2 所示,以多酚醯胺化合物 8 為例將其置於石英量測杯中,在超微弱冷光儀中與過氧化氫共存下所 得之冷光值變化圖,圖中可見冷光值在三劑過氧化氫混合加入後,當達到穩定時的冷光值為25264(約 538 秒), 在加入多酚醯胺化合物 8 後,急速下降至 21893,待冷光值趨向穩定時(約 60 秒),再次加入 10 μl 相同濃度的 樣品待測物,其抑制過氧化氫活性能力之冷光值再度下降為 19654,待冷光值趨向穩定時,第三次以同樣方 式加入樣品待測物,其抑制過氧化氫活性能力之冷光值逐步下降為 18035,待冷光值趨向穩定時,第四次加 入10 μl 的樣品待測物時,其冷光值再度下降為 17221;利用公式(1)求出其抑制過氧化氫活性之抑制率,並算 出其IC50值。

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3 多酚醯胺化合物(1~40)抑制過氧化氫 活性能力之IC50 圖2 利用 BJL 超微弱冷光儀器測試多酚醯胺化合 物 8 抑制過氧化氫活性能力之冷光變化光譜 表2 多酚醯胺化合物抑制過氧化氫活性能力測試 其多酚醯胺化合物(1~40)抑制過氧化氫活性能力之 IC50,如圖3 所示(Compound 2 之 IC50 :365.4、Compound 5 之 IC50為負值表示無抑制過氧化氫活性能力) 。為明顯觀察其冷光值變化以求得其抑制過氧化氫之活性,實 驗中,每種多酚醯胺化合物若以相同濃度(1 mg/ml)加入 10μl 時,其冷光值變化將不固定,因此將多酚醯胺化 合物與過氧化氫作用下其冷光值變化相當的化合物分類在一起,並調整其適當濃度以方便觀察,再依相同步 驟,測試其抑制過氧化氫之活性能力,其結果如表一所示。多酚醯胺化合物抑制過氧化氫活性評估,從結果 顯示大部分皆有良好抑制效果且明顯與羥基取代數量有關;當羧酸苯環上具有三羥基或二羥基取代之醯胺化 合物其抗氧化力較單羥基(IC50 = 0.18~17.02  g/ml)取代時好,甚至可以比 Trlox(IC50 = 12.06  g/ml)之抑制過 氧化氫活性能力強。

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3.2 抑制酪胺酸酶活性測試

抑制酪胺酸酶活性評估結果,以咖啡酸、沒食子酸及2, 5-二羥基苯甲酸之醯胺衍生物(Compound 33~40、

17~20)效果最為顯著(IC50 = 62.41~130.28  g/ml),但也有少許之化合物顯示出明顯抑制酪胺酸酶活性能力,

如(Compound 12 之 IC50 = 71.70  g/ml、Compound 24 之 IC50 = 57.26  g/ml 及 Compound 36 之 IC50 = 71.03

 g/ml)也出現較強之抑制酪胺酸酶活性能力,與對照組維生素 C (IC50 = 107.26  g/ml)及麴酸(IC50 = 80.11  g/ml)之抑制酪胺酸酶活性能力比較不相上下;而其中以 Compounds 12、24、36、39 效果最佳,比麴酸強, 但其他測試樣品對抑制酪胺酸酶活性能力就沒有明顯之效果,如表 2。而圖 3 所示為多酚醯胺化合物(1~40) 抑制酪胺酸酶活性能力之 IC50,由圖中值得注意的是,多酚醯胺化合物 37~40 皆為具有較佳之抑制酪胺酸酶 活性能力,且羧酸苯環上剛好具有三個羥基。另外,多酚醯胺化合物1~11 羧酸苯環的羥基數只有一個,其 IC50 數值偏高,而這也說明羥基數目可以影響活性抑制率。 表 3 多酚醯胺化合物抑制酪胺酸酶活性能力測試 圖4 多酚醯胺化合物(1~40)抑制酪胺酸酶活性能 力之IC50圖

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4. 結 論

多酚醯胺化合物抑制過氧化氫活性評估結果,皆有良好抑制效果,明顯與羥基取代數量有關;當羧酸苯 環上具有三羥基或二羥基取代之醯胺化合物(IC50 = 0.18~17.02  g/ml)普遍其抗氧化力較單羥基取代時好,甚 至比Trlox(IC50 = 12.06  g/ml)之抑制過氧化氫活性能力強,但也有少許例外如(Compounds 25 之 IC50 = 53.96  g/ml、28 之 IC50 = 45.77  g/ml 及 33 之 IC50 = 30.56  g/ml)。 美白活性測試:抑制酪胺酸酶活性評估結果,以咖啡酸、沒食子酸及2, 5-二羥基苯甲酸之醯胺衍生物效 果最為顯著(IC50 = 62.41~130.28  g/ml),但也有少許之化合物顯示出明顯抑制酪胺酸酶活性能力,如 (Compounds 12 之 IC50 = 71.70  g/ml、24 之 IC50 = 57.26  g/ml 及 36 之 IC50 = 71.03  g/ml)也出現強之抑制 酪胺酸酶活性能力,總結多酚醯胺化合物以 20、24、34、37、39 及 40 同時在抑制過氧化氫及抑制酪胺酸酶 活性上具有極強之能力。

參考文獻

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數據

圖 1  N-(羥基苯)多羥基苯醯胺化合物反應式
圖 3  多酚醯胺化合物(1~40)抑制過氧化氫 活性能力之 IC 50圖2  利用 BJL 超微弱冷光儀器測試多酚醯胺化合物 8 抑制過氧化氫活性能力之冷光變化光譜 表 2 多酚醯胺化合物抑制過氧化氫活性能力測試  其多酚醯胺化合物(1~40)抑制過氧化氫活性能力之 IC 50 ,如圖 3 所示(Compound 2 之 IC 50  :365.4、Compound  5 之 IC 50 為負值表示無抑制過氧化氫活性能力)  。為明顯觀察其冷光值變化以求得其抑制過氧化氫之活性,實 驗中,每種多酚醯胺化合物

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